m的系统绘图 1 小RNA空间中的位点 m1 已知A中断常规沃森-克里克A:U碱基配对(图。 1a )并在HTS文库的制备过程中导致逆转录酶(RT)停止 36 ,37 ,38 ,39 。这个特征可以用于绘制m 1 m处的不匹配(错误合作)站点 1 a职位。为了系统地绘制潜在的m 1 在小RNA(< 50个核苷酸长)中的a位点，我们结合了两种独立的方法(图。 1b ):m 1 抗体富集后进行小RNA测序(m 1 A-RIP-seq)和m 1 测序显示a诱导的错配特征。为了首先识别m 1 对于标准小RNA测序，三种候选RT(ProtoScriptII-一种常用的M-MuLV RT，TGIRT模板转换组II逆转录酶和工程HIV RT-1306)用具有单M 1 一个站点(图。 1c ).TGIRT和RT-1306是基于它们之前在m测序中的成功而被选择用于测试的 1 含a的mRNAs和tRNAs(李等2017；萨夫拉等人2017；周等2019；伯伦斯等人2021)。实验工作流程(图。 1c 左下)如下:首先将小RNA与3’末端接头连接，然后与5’末端接头连接，接着进行引物引发的RT反应以产生cDNA，然后通过覆盖两个接头序列的引物进行PCR扩增。我们的策略确保只有通读产物将被克隆并用于m的下游错配分析 1 修改估计。通过在RT步骤之前包括5’接头连接，我们消除了由于缺乏与用于PCR扩增的5’引物的互补性而将任何RT停滞产物克隆为截短产物的可能性。这种方法对于小RNA是优选的，因为它们通常只有几个碱基不同，特别是对于tRFs。例如，18个核苷酸的tRF-3和22个核苷酸的tRF-3通过不同的机制调节LTR功能 30 。使用该工作流程，在合成m上的错配指数(通过A到T/G/C突变计算) 1 一个站点在不同的m上表现出很大的灵敏度和动态范围 1 TGIRT和RT-1306的化学计量比(图。 1c 和补充图。 1a ，补充表 1 ).然而，通常用于短RNA测序的逆转录酶ProtoScriptII在m 1 a存在于≤60%的合成短RNA中(图。 1c 和补充图。 1b )，与TGIRT和RT-1306相比导致较低的克隆频率，正如当100%的RNAs具有m 1 一(图。 1d ).这一结果很可能是由于ProtoScripII RT在m 1 一个网站，并建议m 1 含a的小RNA在通常使用这种RT的大多数小RNA序列文库中代表性不足。作为测量背景突变率的对照，使用未修饰的合成短RNA测量错配，显示所有三种rt的错配< 2%，特别值得注意的是TGIRT的约0.2%错配(补充图。 1c 和补充表格 1 ).最后，当与m结合时 1 抗体富集(m 1 A-RIP)，TGIRT和ProtoScriptII都能够检测合成m 1 掺入细胞小RNA的RNA(图。 1e 和补充图。 1d ，补充表 1 ).基于上述分析，我们选择TGIRT来进一步识别内源性m 1 含a的小核糖核酸。
图1:m的系统图谱 1 小RNA空间中的一个位点。 a m的化学结构 1 一个 1 -甲基腺苷)。 b 总m 1 结合m的小RNA作图策略 1 一个裂口和m 1 a诱导的错配分析。合成m 1 包括RNA作为阳性对照。 c TGIRT被鉴定为m的最佳逆转录酶 1 a诱导的错配分析。简而言之，合成m 1 不同m的含RNA 1 通过三种不同的逆转录酶(RTs)对化学计量进行测序:TGIRT(热稳定的第II组内含子逆转录酶)、PSII (ProtoScriptII，逆转录病毒RT)和RT-1306(工程HIV RT)。对于每一个RT，错配率是通过作图到合成RNA序列(允许1个错配)的所有读数计算的，如序列标志所示。已知m下的失配率 1 然后根据已知的m绘制一个地点 1 化学计量比( R 2 源自被迫在零处交叉截距的线性拟合)。 d ProtoScriptII导致m的代表性不足 1 含a的RNA。克隆频率被标准化为尖峰信号。 e m1 RIP成功地丰富了合成m 1 当掺入总短RNA时，含a的RNA与输入相比。TGIRT比ProtoScriptII更好地捕捉浓缩。数据基于四个独立的RIP实验(两个HEK293T和两个U251)。箱线图中心代表中值，界限代表25%和75%，而触须显示距离界限不超过1.5 *四分位数范围的最小值或最大值。参见补充图。 1 和补充表格 1 。源数据作为源数据文件提供。
特异性tRNA衍生的片段高度富集m 1 A为了识别内源性m 1 含a的小核糖核酸，m 1 将RIP应用于来自细胞的纯化短RNA。m 1 来自HEK293T细胞的α-修饰的tRNAs被m 1 撕开并洗脱(图。 2a ).输入和m的后续TGIRT序列 1 RIP RNAs(15-50碱基长)揭示了tRNA衍生的片段(基因组和线粒体编码的；TRF)在短RNAs中相对富集(补充图。 2a ).m的浓缩 1 对于有一个碱基错配的tRF读数，RIP更为突出，推测是在m位点 1 一个修改(图 2b ).这种错配相关的m富集 1 没有观察到微小RNA或其他小RNA的RIP(图。 2b 和补充图。 2b ).大多数这些含有错配的tRF读数在m后具有A到C/G/T错配(90%为细胞质tRF，95%为线粒体tRF) 1 裂口(图。 2b )，表明修饰(易错配)腺苷的特异性富集，最有可能是m 1 A.通过ProtoScriptII和两种不同的m 1 a-特异性抗体(一种来自MBL，一种来自Abcam，这两种抗体以前都以其m 1 α-结合特异性 44 )也证实了m对tRFs的富集作用最大 1 裂口(补充图。 2c 和补充表格 2 )，表明他们承担m 1 a修改。
图2:来源于特定tRNA的片段高度富集了m 1 A. a m1 通过针对tRNA的Sybr金染色和Northern印迹，与IgG对照RIP相比，RNA免疫沉淀(RIP)成功富集了tRNA 翼 b m1 RIP丰富了tRNA片段中含有A->C/G/T错配的阅读。条形图代表每组不允许错配的小RNA的RPM(每百万的读数)值(黑色)和当允许1-nt错配时的额外作图读数(红色)。标记的百分比显示所有错配中A->C/G/T错配的百分比。 c tRF的主要类型包括tRF-3s(成熟trna的3’末端)、tRF-5s(成熟trna的5’末端)和tRF-1s(前体trna的尾部)。tRF-3s有两种主要的亚型，tRF-3b (22核苷酸)和tRF-3a (18核苷酸)。 d , e tRF-3s被m显著富集 1 裂口。 d 对数2倍富集(m 1 RIP/input)对不同RNA组的小RNA丰度作图。仅显著(10 −5 通过具有多重假设调整的DESeq2 Wald测试),富集或耗尽的RNA被染色。 e tRF-3s( n = 114)和tRF-5s( n = 73)，但不是tRF-1s( n = 34)明显更富含m 1 瑞普比大鹏( n = 421) ( p 双边Wilcoxon测试的值与miRs的值相比)。箱线图中心代表中值，界限代表25%和75%，而触须显示距离界限不超过1.5 *四分位数范围的最小值或最大值。 f 柱状图显示22个核苷酸的tRF-3b而不是18个核苷酸的tRF-3a被m显著富集 1 与输入相比的RIP。此图中的数据基于HEK293T中两个独立RIP实验的TGIRT-seq。参见补充图。 2 。源数据作为源数据文件提供。
基于起始和终止位置，tRNA片段可以分成三大组(图。 2c 22 ,30 ,34 :(1)定位于成熟trna的3’CCA末端的tRF-3s，(2)定位于成熟trna的5’末端的tRF-5s，和(3)包含来自前体trna的尾部序列(通常以poly-U结尾)的tRF-1s。特别是，3’tRFs有两个主要种类:tRF-3a (18个核苷酸)和tRF-3b (22个核苷酸)，它们由TGIRT-seq概括(补充图。 2d ).成熟trna 3’端的tRFs优先被m富集 1 a抗体，而与微小RNA相比，从5’端开始的抗体中度富集，而tRF-1s不富集(图。 2d，e ).此外，22个核苷酸的tRF-3b被m特异性地富集 1 与18-nt tRF-3a相反的抗体(图 2f 和补充图。 2e )，表明只有22-nt，而不是18-nt的tRF-3s harbor m 1 A.值得注意的是，tRF-3b的富集(图。 2f )与掺入对照m的程度相似 1 核糖核酸(图。 1e 和补充图。 1d ).来自输入样本的TGIRT错误结合信号也产生了m的位置和化学计量 1 特定的tRF-3s。在第四个位置观察到最高的错配率(A 4 )的所有22-nt tRF-3b(图。 3b，c ).这种高错误整合率是高度特异性的:在tRF-3b的其他位置没有观察到(图。 3c )，或者在18-nt的tRF-3a上。有趣的是，一些微小RNA被m 1 裂口(图。 2d 和补充表格 2 )，但未能显示位点特异性错配模式，因此我们没有将其作为真正的m 1 本报告中的含a-的小RNAs(在讨论中进一步讨论)。所有这些都表明tRF-3b是m 1 含a的小核糖核酸。
图3: m 1 22个核苷酸的3’tRNA片段上的a依赖于TRMT6/61A。 a 来源于成熟tRNA 3’末端的3’tRNA片段(tRF-3s)的图解。tRF-3b表示22核苷酸的tRF-3s，tRF-3a表示18核苷酸的tRF-3s。 b –e m1 22-nt tRF-3b上的错配由TRMT6/61A全面调节。 b , c 基于HEK293T中两个独立敲除实验的TGIRT-seq，计算tRF-3bs上A4位置的错配率。 d 通过蛋白质印迹和RT-qPCR证实了敲除效率。RT-qPCR数据表示为平均值±SD( p 基于来自三个独立敲除实验的双尾配对学生t检验的值)。 e 绘制在亲本tRNA上的所有tRF读数的覆盖图 翼 显示m的减少 1 a tRF-3b但不是tRF-3丰度(HEK293T中的TGIRT-seq，一个重复显示为实例)。 f m1 基于TGIRT-seq，在HeLa和U251中tRF-3b的A4位置上的错配也减少了siTRMT6/61A。 g Northern印迹证实检测到tRF-3a和tRF-3b同种型，它们不会被HEK293T中的siTRMT6/61A改变。全长tRNA 翼 ，tRNA 提尔 和U6作为负载控制进行探测。参见补充图。 3 。源数据作为源数据文件提供。
线粒体tRFs也被m 1 RIP，特别是大多数线粒体tRNAs的5’片段(补充图。 2f )，大概是由于丰富的m 1 在一个 9 线粒体tRNA的位置 9 ,36 。没有被m富集的三个5′半 1 一个RIP来自tRNA 半胱氨酸 ，tRNA 遇见 ，和tRNA 提尔 (补充图 2f );氨酰 半胱氨酸 和tRNA 提尔 拥有m 1 G9 而tRNA 遇见 有吗 9 ，所以都没有m 1 A9 13 。TGIRT的误掺信号证实了线粒体TRF如5′端一半来自tRNA 赖氨酸 在m处具有高的不匹配率 1 A9 现场(补充图 2g ).因为大多数的m 1 确定的位置处于高化学计量比，我们跳过了m 1 一个RIP和唯一使用的TGIRT不匹配签名来量化m 1 a在特定地点进行以下分析。
m1 一个22个核苷酸的3’tRNA片段依赖于TRMT6/61A A 4 22-nt tRF-3b上的位置对应于A 58 成熟tRNAs的位置(图。 3a ).m 1 A58 胞质上的tRNAs由异二聚体酶复合物TRMT6/TRMT61A(或酵母中的GCD10/GCD14)催化。为了测试m 1 tRF-3b上的a是由TRMT6/61A(可能在亲本tRNA上)引入的修饰，在TRMT6/61A敲除后评估了错配签名(图。 3b–e ).m 1 除了tRNA中的tRF-3s，tRF-3s依赖的误掺在全球范围内都在减少 训练项目 (图。 3b，c )当TRMT6/61A被击倒时(图。 三维（three dimension的缩写） ).下tRF-3b A 4 在HeLa和U251细胞中也观察到单独的siTRMT6/61A或siTRMT61A的误掺率(图。 3f 和补充图。 3a，b ).同时，TRMT6/61A不影响其他m 1 一个网站，如m 1 A9 线粒体tRNA的tRF-5s或5′端 赖氨酸 和tRNA （同glucose）葡萄糖 (补充图 3c ).虽然tRF-3b与ProtoScriptII的克隆频率在TRMT6/61A敲除后显著增加(补充图。 3d–g )，Northern印迹没有检测到tRF-3b和tRNAs稳态水平的任何变化(图。 3g 和补充图。 8 ).这证实了m 1 这种通常使用的ProtoScriptII RT不能代表含a的小RNA。
m1 通过tRF-3s减弱基因沉默 m的存在 1 tRF-3s上特定位置的a提出了一个有趣的可能性，它可能调节tRF-3的功能，特别是如果它涉及碱基配对或蛋白质结合。已经在多种生物途径中发现了tRF-3s，特别是依赖于指导小RNAs (tRF-3s)和靶RNAs之间的碱基配对的基因沉默途径(图。4a ).这些Ago依赖的基因沉默机制可能受m 1 tRF-3s第4位的a，它属于与靶RNA碱基配对所必需的种子区域 25 ,45
图4: m 1 通过tRF-3s减弱基因沉默。 a m1 a位于tRF-3b的种子区内，代表RISC (RNA诱导沉默复合物)中的指导RNA。m 1 a可能干扰tRF-3b和靶RNA之间的碱基配对，从而减轻靶阻遏。 b 测量tRF-3基因沉默活性的双荧光素酶报告基因检测方案。tRF-3b互补靶序列被插入到 海肾 荧光素酶基因。 萤火虫 荧光素酶(Fluc)信号用于标准化。用未改性的A合成tRF-3b 4 或者m 1 修改过的 4 与报道质粒共转染以测量tRF-3b对报道活性的相对影响。 c –f 相对tRF-3基因沉默活性通过HEK293T中的双荧光素酶报告基因测定来测量。相对活性由Rluc信号除以Fluc信号计算，并归一化为空位点报道基因；NT1(非目标质控品1)在每次复制中被设置为1。g –j 相对tRF-3基因沉默活性在tRF-3被LNAs(锁定核酸)敲除后被解除抑制。相对活性由Rluc信号除以Fluc信号计算，并归一化为空位点报道基因。非靶向LNA用作对照(Ctrl)。所有数据均表示为平均值±标准差；p 基于三个双尾配对学生t检验的值(四个用于 d , e )独立实验。源数据作为源数据文件提供。
为了直接测试m的效果 1 关于tRF-3b基因沉默活性，我们产生了双荧光素酶报告基因，其在海肾荧光素酶基因的3’UTR具有tRF-3靶位点，并且可以标准化为萤火虫荧光素酶信号(图。 4b ).只有一个 4 -未修饰的tRF-3b触发基因沉默，而m 1 A4 修饰的tRF-3b消除了这种基因沉默(图。 4c–f ).对于来自不同氨基酸组的四种不同的tRF-3b序列(来自tRNA的tRF-3009b)观察到这种效应 罗马尼亚的货币单位 来自tRNA的tRF-3021b 翼 来自tRNA的tRF-3030b 提尔 和来自tRNA的tRF-3004b 谷氨酰胺
为了确保tRF的抑制不是过度表达的产物，我们也用LNA(锁定的核酸)敲除了内源性tRF-3。tRF-3021报道基因活性被抗tRF-3021特异性地去抑制(图。 第四代移动通信技术 )，而非抗tRF-3009，呈浓度依赖性(补充图。 4a ).类似地，tRF-3009、tRF-3030和tRF-3004报道基因活性被相应的lna去抑制(图。 4h–j
总的来说，这表明m 1 由于与靶mRNA退火的种子问题，a减弱了tRF-3b的基因沉默。
tRF-3b的Argonaute结合不被TRMT6/61A依赖性m降低 1 A因为m 1 tRF-3b上的a防止tRF-3b的沉默(图。 4 )，我们测试了这种修饰是否降低了内源性tRF-3s与Ago2的相关性。为此，我们建立了稳定表达Flag-HA标记的Ago2的细胞系(图。 5a ).TGIRT-seq在100个与Ago2相关的小RNA中鉴定出tRF-3s(图。 5b 和补充表格 3 ).在TRMT6/61A拆卸后(图。 5c )，读取中的不匹配百分比，对应于m 1 一种修饰是(a)Ago2相关部分减少，但(b)相对于输入，ago 2相关部分没有富集或减少(图。 5d 和补充表格 4 ).因此TRMT6/61A调节m 1 两个池中的tRF-3s上的a相等，而m 1 修改并不排除tRF-3b进入与Argonaute的复合体。敲除TRMT6/61A后，Ago2相关分数中的几个tRF-3有少量(1-3倍)增加，但增加不超过FDR阈值< 0.05(图。 5e 和补充图。 4b ).总tRF-3水平(输入)大部分未被siTRMT6/61A改变(补充图。 4c ，补充表 3 ).相对于输入分数，Ago相关分数中的tRF-3水平没有任何变化，表明TRMT6/61依赖性m。 1 tRF-3种子区的修饰不会显著影响直接Ago结合。这与人Ago2-siRNA共晶体结构中已知的Ago2与短指导RNA的结合模式一致 46 ，从中我们模拟了m 1 一进4 泰国(Thailand) 指导RNA的位置:模拟的结构显示Ago2蛋白与RNA骨架相互作用，而不与碱基相互作用(补充图。 4d ).有趣的是，尽管总tRF-3b错配的百分比(m 1 修饰)由TRMT6/61A调节(图。 5d )，这在来自tRNA的tRF-3b中没有观察到 训练项目 (补充表格 3 ).综合来看，m 1 修饰的tRF-3s不会减少它们的Ago关联，因此基因沉默的减弱很可能是因为与靶mRNA的碱基配对减少(图。 4 ).
图5:tRF-3b的Argonaute结合没有被TRMT6/61A依赖性m降低 1 A. a 构建稳定的FH-Ago2细胞，通过抗泛Ago蛋白质印迹检测(*表示抗体检测到的非特异性条带)。泛Ago带检测内源性Ago蛋白和标记的FH-Ago2蛋白。 b 在Ago2 RIP (RNA免疫沉淀)中检测到的排名前100的小RNA(灰点:微小RNA，红点:tRFs)被绘制( Y -轴:在log10标度上的读取计数)。 c 在HEK293T siCtrl和siTRMT6/61A中进行Ago2 RIP。 d Ago2结合部分和输入部分的TGIRT-seq鉴定出较低的m 1 tRF-3b上的一个错配。计算除tRNA外所有tRF-3b的颜色阴影错配率 训练项目 e siTRMT6/61A上Ago2结合的小RNA变化的火山图(差异分析和 p 通过DESeq2 Wald测试得到的值)。该图中的数据基于HEK293T稳定Flag-HA-Ago2细胞中三个独立Ago2 RIP实验的TGIRT-seq。参见补充图。 4 和补充表格 3 。源数据作为源数据文件提供。
m1 tRF-3b导致的整体基因沉默的a依赖性变化 指导RNA的2-4位碱基配对对于Ago介导的基因沉默至关重要 45 。m 1 tRF-3b上的a具体位于第4位(图。 2 和 3 ).自m以来 1 A中断了规范的A:U碱基配对，我们假设m削弱了碱基配对 1 带有靶RNA的tRF-3种子区域中的a解释了在m 1 含a的tRF-3s(图。 4 ).为了验证这一假设，我们首先确定了可能被m调节的tRF-3靶RNA 1 a根据图一总结的战略状况。 6a 。因为tRF-3bs中的种子序列(5’核苷酸2–8)高度相似，即使它们来自不同的亲本tRNAs(补充图中显示了一个种子的例子)。 5a )，我们合理化了种子相似的tRF-3b会一起作用沉默相同的基因，类似于microRNA家族。我们确定了哪些种子来自顶部Ago2相关的tRF-3b(图。 6b 和补充表格 4 )也是m值下降最多的 1 敲除TRMT6/61A后的修改，以确定最有可能遭受目标预测的生物学显著干扰的种子(图。 6c 和补充表格 4 ).我们基于3’UTR的互补性预测了这些种子的靶标。RNA-seq显示，当TRMT6/61A被敲除并且tRF-3b被m亚修饰时，与非靶标相比，这些种子的靶标被显着抑制 1 a在第四个位置(图。 6d 和补充表格 5 ).
图6: m 1 tRF-3b引起的全球基因沉默的a-依赖性变化。 a 识别潜在的tRF-3靶RNA的工作流程 1 一种状态。 b ago-结合tRF-3b种子序列是从Ago2-RIP中鉴定的。 c m1 依赖于a的tRF-3b种子序列从m 1 TRMT6/61A敲除后Ago2结合部分的错配率，如颜色所示。 d 与HEK293T中siTRMT61A上的非靶标相比，tRF-3靶标被全面抑制。表情变化的分布( X -轴:从RNA-seq的Log2倍变化)通过CDF(累积分布函数)图可视化。 P 单侧Kolmogorov-Smirnov检验值，用于比较每种目标类型与非目标之间的总体分布。显著抑制的tRF-3目标(7/8-mers，DESeq2调整 p 值< 0.01，log 2 foldchange < 0.5)从( e )RNA-seq通过( f )RT-qPCR。 g 使用tRF-3靶位点进行双荧光素酶测定，以测量siTRMT6/61A后的效果。 MBTPS1 和 CREB3L2 之后插入3’UTR序列 海肾 荧光素酶基因。 h 通过RT-qPCR，tRF-3004b模拟过表达抑制tRF-3靶。 i 进行双荧光素酶测定以测量tRF-3004b模拟过表达后的效果。内源性tRF-3004b靶位点 MBTPS1 和 CREB3L2 3’UTR被克隆为4X串联重复序列。数据基于 b , c Flag-HA-Ago2 HEK293T中三个独立敲除和Ago2 RIP实验的TGIRT-seq； d , e 两个独立敲除实验的RNA-seq； f n = 3, ( g ) n = 3, ( h ) n = 4, ( i ) n = HEK 293t中的3个生物学独立实验(平均值±SD)。RT-qPCR:相对表达被标准化为siCtrl( f )或NT1(非靶向RNA对照1( h )，并与 肌动蛋白 表情。双重荧光素酶检测: 海肾 荧光素酶读数被标准化为 萤火虫 荧光素酶读数并进一步标准化为siCtrl( g )或NT1( i ).显著性基于学生的t检验(双尾不成对，* 1) p < 0.05, **p < 0.01, N.S. = p > 0.05).确切的 p 从左到右的值: f 9.6e 6、9.1e 4、0.0050、2.2e 5、0.018、0.0095、3e 4、2.6e 5和0.042； g 0.49, 0.03, 0.0042; h 0.0097、3.5e、0.026、0.0068、0.003、0.22和0.0001545； i 0.0011、0.00063、5.7e 5和4.1e 6。另请参见补充表格 4 –5 和补充图。 5 。源数据作为源数据文件提供。
预测具有8-聚体和7-聚体匹配的靶比种子中具有6-聚体匹配的靶更显着地被抑制(图。 6d，e 6f 和补充表格 5 ).值得注意的是，这些tRF-3b种子序列不与任何表达的(阅读计数> 10) miRbase注释的人类微小RNA种子重叠(补充图。 5a )，排除了TRMT6/61A敲除后的阻遏是通过微小RNA的调控的可能性。特别是，78%的预测目标有一个以上的目标地点(补充图。 5b 和补充表格 5 ).
当每个单独的tRF-3b种子分别用于预测靶时，也观察到TRMT6/61A调节的tRF-3b靶阻遏(补充图。5c ).为了证实这种基因抑制是由靶向3’UTR的tRF-3介导的，内源性3’UTR序列 MBTPS1 具有单一的、进化上保守的tRF-3靶8聚体位点(补充图。 5d )克隆到双荧光素酶报告基因中。mbt PS 1 3’UTR报告基因确实被siTRMT6/61A抑制(图。 6g ).用另一种8聚体靶基因获得了类似的结果， CREB3L2 (图。 6g 和补充图。 5e ).两个8聚体位点都由种子序列“TCAAATCT”预测，由来自tRNA的tRF-3b代表 谷氨酰胺 (图。 6b 和补充表格中“种子2” 5 ).与预测一致，通过从tRNA中过量表达未修饰的tRF-3004b，可以模拟siTRMT依赖性抑制 谷氨酰胺 TRMT6/61A表达没有减少(图。 6小时 )，而m 1 a-修饰的tRF-3004b显示出明显较弱的抑制3’UTR报道基因的能力(图。 6i 和补充图。 5f ).总的来说，结果表明tRF-3s可以通过与靶3′UTRs的种子配对来调节全局基因表达，并且这受到m 1 tRF-3种子区的修饰。
tRF-3 m的改造 1 膀胱癌中的a水平和tRF-3靶点 据报道，一些tRNA修饰酶，包括TRMT6/61A，在几种癌症类型中显著上调 47 。对TCGA公共癌症数据库的分析显示 TRMT6 与相应的正常对照相比，mRNA确实在多种癌症类型中上调(补充图。 6a :红色标签)，但这并没有广泛传播 TRMT61A (补充图 6b ).这 经直肠微波热疗 6在膀胱尿路上皮癌(BLCA)中上调显著(图。 7a ).检验在细胞系模型中是否观察到trm T6/61A-介导的tRF-3修饰(图。 1 –6 )也见于肿瘤样品中，我们从临床诊断的BLCA患者中获得匹配的肿瘤和正常样品(补充表 6 )，其中我们通过RNA-seq和RT-qPCR证实 TRMT6 RNA在肿瘤样本中过度表达(补充图。 7a，b ).这里又不像 TRMT6 , TRMT61A 与正常样品相比，RNA相对没有变化(补充图。 7a–c ).最重要的是，通过蛋白质印迹检测到肿瘤样品中TRMT6和TRMT61A蛋白水平的显著上调(图。 7b，c ).这些肿瘤样本中的小RNA TGIRT-seq成功地鉴定了m 1 a-介导的tRF-3b第4位的错配，否则通过使用其它RT如ProtoScriptII在m 1 (补充图。 7d
图7:tRF-3m的改变 1 膀胱癌中的a水平和tRF-3靶点。 a TRMT6 TCGA BLCA语表达( n = 404)相比正常( n = 28，TCGA和GTEX)。表情( Y -轴)来源于Log2标度的RNA-seq。GEPIA2可视化的数据( p 通过单向ANOVA的值)。箱线图中心代表中值，界限代表25%和75%，而触须显示距离界限不超过1.5 *四分位数范围的最小值或最大值。 b , c 用β-肌动蛋白作为加载对照，通过蛋白质印迹比较BLCA肿瘤和正常样品中的TRMT6和TRMT61A蛋白表达。相对蛋白质表达标准化为β-肌动蛋白； p 基于双尾不成对学生t检验的值。 d , e m1 通过TGIRT-seq在BLCA肿瘤样品和成对的正常( n = 5). d 总tRF-3b标准化错配指数( y -轴，标绘由错配%对非错配%定义的指数 TRMT6 表情( x -轴，来自RNA-seq的log2标度)。在肿瘤中观察到显著更高的tRF-3b错配指数( p 通过成对学生的t检验得出的值)。 e 将每个患者的肿瘤和配对正常组织之间的tRF-3b A4-错配%进行比较(热图中的红色表示肿瘤中的错配%较高， p 通过不成对的双侧Wilcoxon检验得到的值)。 f , g 与配对正常相比，在BLCA肿瘤中观察到的tRF-3b靶的整体去抑制( f , n = 5)或在高- TRMT6 表达(上四分位数)BLCA肿瘤( n = 102)相比低- TRMT6 TCGA表达的(底部四分位数)肿瘤(n = 102)( g ).CDF(累积分布函数)p值通过单侧Kolmogorov–Smirnov检验计算，以比较tRF-3靶与非靶之间的总体分布。 h 之间的相关性 TRMT6/61A TCGA BLCA患者中的表达和tRF-3目标( n = 404).Pearson相关性是基于GEPIA2在TPM中的mRNA表达水平(每百万转录本)(在log2标度上可视化)。用颜色汇总的相关系数(红色=正相关，蓝色=负相关)， p 成对相关检验的值* p < 0.05, **p < 0.01. Exact p 从上到下的值: e 0.0075、0.0075、0.0075、0.025、0.12、0.66、0.66、0.66、0.0075、0.65、0.66、0.12和0.66； h trmt 6–9.1e 8，7.8e 9，0.019，0.78，8.4e 9，1.2e 6，0，0，0.005，4.5e 8；trmt 61a–9.1e 8，0.81，0.08，0.37，0.68，0.94，0.29，0.96，0.17和0.47。另请参见补充图。 6 , 7 和补充表格 6 。源数据作为源数据文件提供。
两者之间呈正相关 TRMT6 表达水平和整体m 1 tRF-3b的错配水平和m的显著增加 1 BLCA肿瘤样品中的错配与较高的TRMT6/61A表达一致(图。 7d，e ).与干扰m的较高水平一致 1 在我们的实验数据中，与正常相比，在BLCA肿瘤样品中，通过种子-mer匹配预测的修饰tRF-3b靶RNA与非靶RNA相比上调(图。 7f :组合种子和补充图。 7e 7g ).有趣的是，9个tRF-3靶中有8个被siTRMT6/61A抑制(图。 6e )在表达中显示出显著的正相关 TRMT6 在TCGA膀胱患者样本中(图。 7h 和补充图。 7f ).综上所述，这些结果表明TRMT6/61A调控m 1 肿瘤中tRF-3s的水平，BLCA trm T6/61A的升高与肿瘤中tRF-3靶的预期诱导相关。
TRMT6/61A对tRF-3b的修饰对于维持未折叠的蛋白质反应是重要的 探索m的潜在生物学功能 1 依赖于a的tRF-3靶点，我们关注了被siTRMT6/61A显著下调和在高水平tRF-3显著上调的生物学途径。 TRMT6 肿瘤样本通过基因组富集分析我们的RNA-seq数据。对总共1532个反应组途径的富集分析在细胞系和患者数据中鉴定出7个重叠的途径。一个这样的途径是未折叠蛋白反应或UPR(图。 8a、b 和补充图。 7g ).当比较TCGA BLCA患者和高胰岛素血症患者时，UPR也显示为一种富集的途径 TRMT6 表情与低表情的对比 TRMT6 表情(补充图。 7h
图8:trm T6/61A对tRF-3b的修饰对维持未折叠蛋白反应很重要。 a 来自BLCA RNA-seq和HEK293T siTRMT61A数据的GSEA揭示了未折叠蛋白反应(UPR)是由TRMT6/61A调节的候选途径。 b 基因集合富集分析显示，与配对的正常样品相比，UPR在BLCA肿瘤中是正向富集的途径( n = 5, x -轴:基于从上调基因到下调基因的差异分析的排序)。 c TRMT6/61A通过在HEK293T和BLCA肿瘤细胞系T24中的UPR报告基因分析调节UPR反应。ATF6应答元件ERSE2的三个串联重复被插入萤火虫荧光素酶基因启动子中。通过萤火虫荧光素酶信号除以海肾荧光素酶信号(在共转染的质粒上)来测量UPR反应，并标准化为siCtrl基础水平。添加衣霉素(Tm)来引发UPR反应。d m1 tRF-3的状态调节UPR报告基因的输出。将tRF-3004b合成模拟物和UPR报道质粒(同上)共转染入HEK293T。NT1和NT2是非靶向控制RNA。 e , f 在HEK293T细胞中，tRF-3004敲除和衣霉素处理后，tRF-3004靶标水平增加。数据基于 c , d n = 3个独立实验， e , f n = 2个独立实验。 c , d 数据代表平均值±SD， p 基于学生t检验的值(双尾配对样本，* 1) p < 0.05, **p < 0.01). Exact p 从左到右的值: c 0.00019、0.00409、0.00088和0.00062； d 0.00013, 0.00066.参见补充图。 7 。源数据作为源数据文件提供。
m1 依赖于a的tRF-3靶点，特别是MBTPS1(也称为位点1蛋白酶或S1P)和CREB3L2，以前被认为与UPR和蛋白质分泌有关 48 ,49 ，表明TRMT6/61A可能有助于通过去抑制这些tRF-3靶来维持生长细胞中的UPR。众所周知，MBTPS1 (S1P)的作用是切割和激活高尔基体上的不同蛋白质底物，包括转录因子ATF6和CREB3L2 50 ,51 ,52 。为了直接测试TRMT6/61A是否调节UPR以响应er应激，我们利用了由具有ER应激反应元件2 (ERSE2)的最小启动子驱动的荧光素酶报告子，该元件可被ATF6转录因子激活 53 。如预期的，报道分子显示依赖于er效应元件和ER应激(衣霉素，Tm)的荧光素酶活性增加。这种UPR诱导的应激反应被HEK293T和T24膀胱癌细胞系中的TRMT6/61A敲低显著抑制(图。 8c ).转染未修饰的tRF-3004b，但不转染m 1 相对于NT1和NT2非靶向RNA，a-修饰的tRF-3004b可以降低UPR报道基因活性(图。 8d )，暗示了m 1 tRF-3b上的状态可以直接调节未折叠蛋白反应。为了确保内源性tRF-3004b抑制参与UPR的靶基因，我们通过LNA敲除了内源性tRF-3004b，这显著增加了er应激后靶细胞基因CREB3L2、HERPUD1、MBTPS1和HLTF的水平(图。 8e，f 和补充图。 7i ).总之，这表明TRMT6/61A介导的m 1 tRF-3s的修饰对维持UPR体内平衡很重要。
