Mn@CCs的合成与表征 将食品营养添加剂葡萄糖酸锰(glucose-Mn)与L-天冬氨酸混合，再经水热处理和透析制备Mn@CCs。透射电子显微镜(TEM)成像显示Mn@CCs是单分散的，具有小于5 nm的均匀尺寸(图。 1a ).高分辨率TEM (HR-TEM)成像显示Mn@CCs具有间距为0.32 nm的分辨率良好的晶格条纹(图。 1b )，这可归因于石墨烯的(002)晶格条纹(补充图。 1 )27 。动态光散射(DLS)显示相对较窄的粒径分布，流体动力学直径约为11.3纳米(图。 1c ).拉曼光谱显示在1358和1560 cm处有两个峰 −1 ，分别对应于无序结构或缺陷(D带)和石墨碳域(G带) 32 。强度比( I D /I G )为0.97，表明Mn@CCs的石墨化(图 1d
图1:Mn @ CCs的表征。 a Mn@CCs的TEM图像。 b 高分辨透射电镜成像揭示Mn@CCs的类石墨烯结构。实验重复了三次。 c Mn@CCs的粒度分布。 d Mn@CCs的拉曼光谱。 e Mn@CCs的TGA。 f Mn@CCs的全扫描XPS光谱。 g –j 的高分辨率XPS光谱 g Mn2p， h N1s， i C1s，以及 j O1s。 k Mn@CCs及其原料的红外光谱。 l Mn@CCs的表面zeta电位。
然后，我们确定了Mn@CCs的分子结构。在氮气氛中进行的热重分析(TGA)进一步证实，在200℃以下损失了约8.3%的质量，这归因于吸附的水分，在200和800℃之间损失了50.7%的质量，对应于含碳成分的分解(图。 1e ).为了理解Mn@CCs中存在的组成元素的表面组成和电子状态，进行了X射线光电子能谱(XPS)分析。测量的XPS光谱显示了在284.8 eV (C1s，72.2原子%)、531.7 eV (O1s，21.1原子%)、399.7 eV (N1s，5.2原子%)和641.2 eV (Mn2p，1.5原子%)处的四个典型峰(图1)。 1f ).在Mn2p的高分辨率XPS光谱中，Mn2p峰被分解成位于641.0、642.6、652.8和653.9 eV的四个峰(图。 第一代 ).解析的Mn2p 3/2 和Mn2p 1/2 值对应于Mn-O键，这与葡萄糖酸锰的XPS一致(补充图。 2 ).高分辨率N1s XPS光谱揭示了Mn@CCs中三种不同类型的氮原子:吡啶氮(398.6 eV)、仲胺(399.5 eV)和石墨氮(401.4 eV)(图。 1h ).高分辨率C1s XPS光谱提供了sp3/sp2碳(C–C/C = C)和氧化碳(C–O和C=O)的证据(图。 1i ).还确定了对应于C–O(532.8 eV)和C=O (531.2 eV)的两个O1s带(图。 1j ).这些结果证实了Mn@CCs不仅成功地包裹和稳定了Mn离子，而且具有富含氧和氮的表面，这对于进一步的修饰是有用的。此外，由电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定的CDs中Mn的含量为约5.9重量%，这与XPS结果(Mn，6.1重量%)非常一致。傅立叶变换红外光谱(FTIR)在1560、1388和1307厘米处发现了谱带 −1 ，这分别归因于C=O、C=C和C–N基团的伸缩振动(图。 1k ).同时，3300-3500厘米的波段 −1 在2930厘米处有一个相对较小的峰值 −1 表明存在N-H和O-H基团(图。 1k ).这些使得Mn@CCs在水溶液中的ζ电势接近中性电荷，这表明在其表面上存在大约相等数量的羧基和氨基(图。 1l ).在4℃下储存一整年后，它仍然是清澈透明的溶液(补充图。 3 ).近中性电荷使Mn@CCs在不同介质(PBS [pH 7.4]、Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)和胎牛血清[FBS])中具有良好的胶体稳定性，在3-7天后没有任何明显的聚集或沉淀(补充图)。 4 ).Mn@CCs的表面结构有效地使血清蛋白和血细胞的吸附最小化(补充图。 5 , 6 )，说明循环过程中不受血清蛋白和血细胞的干扰，血液相容性好 33 ,34
Mn@CCs的光学和磁学性质 Mn@CCs的紫外-可见吸收光谱在280 nm处有一个强的特征吸收带，代表了芳香化合物的n-π*跃迁 2 含有C=O和C=N键的系统(图。 2a ).光致发光显示在400-650纳米激发依赖发光(图。 2b ).由于Mn含量高达5.9重量%，因此在1.5 T、7.0 T和9.4 T MRI扫描仪中进行MR体模研究。放松(1/ T 1 )表现出与Mn@CCs浓度的线性关系(图。 2c ，补充图。 7a )，以及纵向弛豫度( r 1 )达42.9毫米 −1 −1 (1.5吨)，31.1毫米 −1 −1 (7.0吨)和22.1毫米 −1 −1 (9.4吨)(图 2c ).其余的 1 值远远高于前驱物和最常见的临床MRI造影剂Magnevist，即钆-DTPA(图。 2d，e ，补充图。 7 ).例如，r 1 在9.4 T MRI扫描仪下，Mn@CCs的值比前体葡萄糖-Mn高4.4倍，比Magnevist高4.9倍(图。 2f )，甚至更高的r 1 在较低磁场下检测到数值(图。 2f
图2:Mn @ CCs的光学和磁学性质。 a 锰@CCs的紫外-可见吸光度。插图:日光下净化后的Mn@CCs照片。 b Mn@CCs的光致发光光谱。 c 其余的 1 在1.5 T、7.0 T和9.4 T MRI系统中研究Mn@CCs的弛豫度。 d 其余的 1 在1.5 T、7.0 T和9.4 T MRI系统中研究葡萄糖-锰的弛豫度。 e 其余的 1 在1.5 T、7.0 T和9.4 T MRI系统中研究Magnevist (Gd-DTPA)的弛豫度。 f r的比较 1 锰@CCs、葡萄糖-锰和钆-DTPA的弛豫度。
神经胶质瘤和肝细胞癌细胞系吸收Mn@CCs 研究了Mn@CCs在生物成像应用中的可行性。在与人胶质母细胞瘤星形细胞瘤和人高加索人肝细胞癌细胞系(U87MG和HepG2)孵育4小时期间，Mn@CCs被细胞吸收，并且细胞内化的Mn@CCs在405、473和559 nm的激发下分别显示出强的蓝色、绿色和红色发射(图。 3a ).然后分离细胞并收集MR体模，其显示与载体对照相比，Mn@CCs孵育组增强了3.2倍，Gd-DTPA孵育组增强了1.3倍，葡萄糖-Mn孵育组增强了2.6倍(图。 3b，c ).这些结果表明Mn@CCs易于被具有良好靶向性的癌细胞摄取。然后，使用细胞实时多光子激光扫描显微镜对U87MG细胞摄取的Mn@CCs进行更全面和直观的观察(补充图。 8 ，补充电影 1 ).通过使用流式细胞仪测量对Mn@CCs的内化途径的研究表明，细胞摄取主要遵循能量依赖的内吞作用和脂筏介导的内吞作用(补充图。 9 )35 ,36
图3:神经胶质瘤和肝细胞癌细胞系摄取Mn@CCs，以及Mn@CCs和其他基于Mn的试剂的毒性评估。 a 在405、473和559 nm的激发下，在37℃下用Mn@CCs预处理4小时的U87 MG和HepG2细胞系的荧光图像。实验重复了三次。 b 照片和测试 1 U87MG细胞与PBS、Gd-DTPA、葡萄糖-Mn和Mn@CCs孵育3小时的加权MR图像 c U87MG细胞与不同药物孵育后的相对信号定量 b (n = 3个独立实验)。*与PBS、Gd-DTPA、葡萄糖-Mn和Mn@CCs四个组的显著差异， P < 0.05. d 正常细胞系(NIH/3T3和LO2)与Mn@CCs、Gd-DTPA和基于Mn的试剂一起温育24小时，评估细胞存活性。实验重复至少三次，如点图所示。*与对照组的显著差异， P < 0.05. All the statistical data are expressed as mean values ± SD. Statistical significance was assessed via a one-way ANOVA with Duncan post-hoc test.
在确认良好的细胞摄取后，使用MTT试验评估Mn@CCs的细胞毒性。与临床上最安全的MRI造影剂Gd-DTPA相比，在高达100μg/mL的剂量下观察到类似的细胞活力 −1 Mn@CCs与癌细胞系孵育的结果(补充图。 10 ).最重要是，与Gd-DTPA相比，Mn@CCs对正常细胞显示出较小的细胞毒性，例如NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞和LO2人正常肝细胞(图。 三维（three dimension的缩写） ).锰基药剂，包括锰盐和MnOx纳米颗粒，在相同条件下表现出显著的细胞毒性，这是由于通过锰介导的类芬顿机制产生了有毒的活性氧(ROS )(图。 三维（three dimension的缩写） 18 ,19 ,20 。上述结果和红细胞溶血试验(补充图。 6 )进一步表明Mn@CCs具有高的生物相容性，没有Mn的泄漏 2+ 离子进入介质以诱导细胞毒性 33 ,34
Mn@CCs与正常健康小鼠的完整血脑屏障杂交 脑肿瘤是神经系统疾病中发病率较高的恶性肿瘤。其位置的特殊性使得脑肿瘤极易导致残疾并且常常是致命的，并且手术治疗是目前颅内肿瘤的首选方法。然而，手术的成功与肿瘤生物学边界的确定及其与周围结构的关系密切相关，因此脑肿瘤的精确诊断和鉴别诊断直接影响治疗效果 37 。MRI技术是临床上用于研究肿瘤发生的发展和诊断的主要非侵入性解剖学或功能诊断学之一，因为它具有无限的组织穿透深度和更大的软组织对比度 38 。然而，BBB阻止98%的小分子和所有大分子进入大脑，包括目前可用的MRI造影剂，如Magnevist (Gd-DTPA) 30 ,31 ,39 。虽然它在临床上用于检测脑肿瘤，但它仅用于检测已经显著损害BBB的肿瘤块 39 。在以前的研究中，表面分析表明Mn@CCs上存在大量的羧基和氨基，类似于氨基酸的结构。值得注意的是，在石墨烯样点上模仿生物结构使得这些点能够在体内有效地穿透血脑屏障，并实现对脑部疾病的诊断和/或治疗作用 40 ,41 ,42 ,43
在前沿研究的鼓舞下，我们使用MR成像和多光子成像研究了我们合成的Mn@CCs是否可以有效地穿透正常健康小鼠的BBB。对于MR成像研究，剂量为20 mg kg的Mn@CCs或Magnevist −1 通过尾静脉注射到正常小鼠( n = 3个生物学上独立的动物)。在每个T中，脑实质(蓝色方块)和脑垂体(红色椭圆形)的三个感兴趣区域(ROI) 1 加权磁共振成像被用来定量评估Mn@CCs的跨血脑屏障能力(图。 4a 30 。垂体在1小时内的信号增强使得Mn@CCs和Magnevist进入血流(图。 4b，c ).由于垂体没有血脑屏障，信号增强表明Mn@CCs能够诱导与Magnevist相似的MRI对比 30 。值得注意的是，在注射Mn@CCs后，脑实质中的信号急剧增加，然而，与注射Magnevist相比，来自脑实质的信号几乎保持不变，因为Magnevist被完整的BBB阻断(图。 4b，c ).蓝色染色进一步证实了这些正常小鼠中BBB的完整性(图。 4d ).所有这些结果提供了直接的体内证据，即Mn@CCs穿透完整的BBB并进入健康活鼠的脑实质 30
图4:在正常健康小鼠中，Mn@CCs与完整的BBB杂交。 a 正常小鼠在静脉注射Mn@CCs和Gd-DTPA后不同时间点的体内MR图像。 b 正常小鼠脑实质和垂体Mn@CCs MRI信号的定量研究 a (n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。Mn@CCs组无显著差异。通过不成对的双尾分析评估统计显著性 t -测试。 c 正常小鼠脑实质和垂体中钆喷酸DTPA的定量研究 a 。所有统计数据均表示为平均值±SD。*与脑实质和脑垂体相比有显著差异: P = 0.5、1和2小时时分别为0.001、0.008和0.0170。通过不成对的双尾来评估统计显著性 t -测试。 d 示踪剂伊文思蓝不能渗透到正常小鼠的脑实质中。 e 暴露大脑的颅窗照片，用于体内多光子成像。 f 正常小鼠脑的活体多光子成像，显示正常小鼠上Mn@CCs(绿色信号)穿过BBB的扩散。预先注射德克萨斯红(红色信号)以标记脉管系统。 g 示踪剂伊文思蓝不能渗透到正常小鼠的脑实质中。 h 正常小鼠脑组织的组织学，证实Mn@CCs穿过正常小鼠中完整的BBB( n = 3个生物学上独立的动物)。蓝色，细胞核；红色，血管；绿色，锰@二氧化碳捕获和储存。
为了呈现Mn@CCs穿过完整BBB的扩散，我们通过颅窗进行了多光子活体成像(图。 4e )评估正常小鼠中Mn@CCs与完整BBB杂交的能力 44 ,45 。颅窗引起的微小视觉假象(图。 4e )，所有图像堆栈都是在距离地表120-164微米的典型深度进行监测的。为了监测血管泄漏，我们预先注射了70 kDa的德州红静脉注射液，以评估颅窗手术后的血管完整性(图中的红色信号)。 1f ).只有在血管和随后的活体图像中看到的红色荧光才能确保血管的完整性。相比之下，在血管和周围空间中观察到Mn@CCs的尖锐绿色荧光(图。 1f )，演示Mn@CCs穿过入口BBB进入周围脑空间。蓝色染色进一步证实了这些正常小鼠中BBB的完整性(图。 第四代移动通信技术 ).脑组织的组织学切片荧光图像清楚地显示了Mn@CCs在脑微血管的内皮壁中的累积(图中的紫色方块)。 4h )扩散穿过血脑屏障并在周围脑环境中聚集Mn@CCs(图1中的白色箭头)。 4h 44 。随着Mn@CCs后注射时间的延长，血管外荧光增强(补充图。 11a ).在注射后81分钟可以清楚地观察到Mn@CCs从脉管系统的外渗，这表明Mn@CCs有效地穿过BBB到达脑实质。所选区域的平均荧光强度从注射后21分钟开始增加(补充图。 11b ).探针穿过完整血脑屏障的整个过程在附图中显示得更清楚。 11 , 12, 和补充电影 2 .
体内药代动力学和生物分布 在确认Mn@CCs穿透健康小鼠完整血脑屏障的能力后，通过注射Mn@CCs (20 mg kg)进一步评估其生物分布和清除行为 −1 )并定量感兴趣器官中的荧光强度。使用体内成像系统在注射后0、0.25、0.5、1、2和4小时获得荧光成像。在大脑区域观察到强荧光信号；强度在0.5-2小时达到峰值，然后随着时间的推移逐渐降低(图。 5a、b ).体外结果显示，大量Mn@CCs在脑部肿瘤中积累(图。 5c ).主要器官的累积分析表明，在注射后24小时，通过使用电感耦合等离子体质谱检测锰离子的数量，几乎所有的锰@CCs都已从体内提取出来(图。 5d ，补充图。 13 ).此外，肾脏中的荧光信号增加并变得强烈(图。 5c，d )，表明Mn@CCs的肾脏清除率。基于这一发现，我们检测了膀胱中的荧光信号并收集了尿液。发现具有Mn@CCs的特征光学性质的强光致发光(图。 5e，f ).我们还收集并拍摄了尿液，尿液在1-4小时内显示出清晰的棕色，并逐渐变成正常的黄色。磁共振结果和提取尿液中锰离子的分析显示了相似的趋势(补充图。 14 ).总的来说，这些结果证实了Mn@CCs可以有效地通过BBB并在脑组织的肿瘤中积累，然后未结合的Mn@CCs通过肾清除有效地排出，这对于成像目的是理想的。
图5:通过荧光成像评价Mn@CCs优先靶向颅内小鼠模型中的显微神经胶质瘤。 a 静脉内施用Mn@CCs(例如:500nm；em:过滤器dsRED)。 b 脑实质中Mn@CCs的平均荧光强度随时间的变化( n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。通过ImageJ计算平均荧光强度。 c 静脉注射Mn@CCs后不同时间点切除的器官的离体荧光图像。 d 从离体成像数据(例如:500nm；em: DsRed)( n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。 e 静脉注射Mn@CCs后1小时膀胱区域的代表性体内荧光图像(例如:500nm；em: filter dsRED)( n = 3个生物学上独立的动物)。 f 从注射和未注射的小鼠获得的尿样的荧光分析。
Mn@CCs优先靶向颅内小鼠模型中的显微神经胶质瘤 为了评估Mn@CCs对小鼠超小原位肿瘤的精确成像能力，我们在接种30天后建立了超小原位脑肿瘤，并通过生物发光和MRI(长度:2.7±0.6mm；宽度:1.5±0.3毫米，补充图 15 ).尾静脉注射Magnevist或Mn@CCs (20毫克/千克)后 −1 )，监测和分析肿瘤中的MRI信号(图。 6a–j ).值得注意的是，T 1 在全脑中观察到加权MRI信号，表明Mn@CCs成功通过BBB(图。 6a、c、f、h ).最重要的是，在尺寸为2.1 × 1.0 mm的脑组织中的肿瘤区域中观察到显著的阳性信号增强，其在注射Mn@CCs后长达4小时内被成功检测并与正常脑组织清楚地区分(图。 6a、c、f、h ).与之前的报道一致，Magnevist也显示了全脑和神经胶质瘤中可忽略的低摄取(图。 6b、d、g、I ).主要原因是Magnevist是非特异性造影剂，只能检测到明显损害血脑屏障的肿瘤块 30 ,46 ,47 。与Gd-DTPA相比，Mn@CCs显示出区分肿瘤和正常组织高灵敏度和高准确度(图。 6e，j ).此外，通过使用Mn@CCs增强MRI确定的肿瘤大小与通过全脑苏木精-伊红(H&E)染色检查的几乎相同(图。 6a、f、k ).约1 mm的超小神经胶质瘤清晰可见，并与正常和良性组织相区别(图。 6k ).神经胶质瘤细胞的放大图像和详图证实了肿瘤的存在(图。 6k ，区域1，2)。这些直接比较结果表明，在超小型原位神经胶质瘤小鼠模型中，Mn@CCs提供了优于Magnevist (Gd-DTPA)的肿瘤对比增强，其通过Mn@CCs增强的MRI实现了肿瘤区域及其大小的精确描绘。
图6:通过MR成像评估Mn@CCs优先靶向颅内小鼠模型中的显微神经胶质瘤。 a , b 静脉注射Mn@CCs和Gd-DTPA后，U87MG神经胶质瘤小鼠在不同时间点的体内轴向MR图像。 c , d 在Mn@CCs的不同时间点量化胶质瘤中的MRI信号( c )和广东DTPA( d )在 a 和 b (n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。与对照组相比有显著差异。* P < 0.05, ***P < 0.001. Statistical significance was assessed via unpaired two-tailed Student’s t -测试。 e Mn@CCs和Gd-DTPA对显微胶质瘤成像能力的比较( n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。*与Mn@CCs和Gd-DTPA相比有显著差异:30分钟( p < 0.001), 1 h (p = 0.002)，2 h( p = 0.008)，4 h( p = 0.023)。* P < 0.05. Statistical significance was assessed via an unpaired two-tailed t -测试。 f , g 静脉注射Mn@CCs和Gd-DTPA后，U87MG神经胶质瘤小鼠在不同时间点的体内冠状MR图像。 h , i 在Mn@CCs的不同时间点量化胶质瘤中的MRI信号( h )和广东DTPA( i )在 f 和 g (n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。与对照组相比有显著差异。* P < 0.05, ***P < 0.001. Statistical significance was assessed via unpaired two-tailed Student’s t -测试。 j Mn@CCs和Gd-DTPA对显微神经胶质瘤成像能力的比较(n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。*与Mn@CCs和Gd-DTPA相比有显著差异:30分钟( p < 0.001), 1 h (p < 0.001), 2 h (p = 0.003)，4 h( p = 0.042)。* P < 0.05. Statistical significance was assessed via an unpaired two-tailed t -测试。 k 裸鼠胶质瘤组织切片的H&E染色。 l 不同时间点膀胱的活体MR图像。 m 基于磁共振成像结果的膀胱在不同时间点的相对信号变化( n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。
下降到注射前水平表明Mn@CCs从循环中排出，并且信号持续时间比Gd-DTPA长 48 。体内荧光成像证实Mn@CCs可以从肾脏系统中排出，因此还研究了膀胱中的MR信号变化。结果显示在膀胱中有强MR信号，在注射后2小时强度最高，表明Mn@CCs的有效肾清除(图。 6l，m ).这些结果表明Mn@CCs具有与Magnevist相似的提取效率，并且具有较高的安全性。
Mn@CCs的高成像性能促使我们进一步研究它们在体内显微肿瘤诊断中的应用。与在接种肿瘤细胞后第30天开始监测的上述肿瘤大小不同，我们建立了具有不同肿瘤大小(即肿瘤体积)的原位神经胶质瘤，以模拟在注射后第5天、第10天和第20天接种表达红色荧光蛋白(RFP)的U87 MG (U87 MG-RFP)细胞系后的早期神经胶质瘤。在注射Mn@CCs后，MR图像显示了不同大小的肿瘤的清晰可见性，甚至在仅接种5天后(红色箭头，图。 7a );值得注意的是，还清楚地检测到了存在于脑组织中的多结节(第30天，图。 7a ).为了显示肿瘤的形态和结构，进行了具有肿瘤分割的磁共振图像的三维(3D)呈现(原位单结节神经胶质瘤用绿色表示，脑组织用灰色表示，图。 7b 37 。在数据处理和区域分割准确性测量后，计算肿瘤体积，即使肿瘤细胞仅在第5天接种(图。 7c 49
图7: 3D成像允许显示Mn@CCs对肿瘤的分布和渗透。 a T1 在注射Mn@CCs之前和之后，在不同阶段的原位GBM荷瘤小鼠( n = 3).第5天、第10天、第20天和第30天:在第5、10、20和30天后接种肿瘤细胞以成像的天数。 b 从Mn@CCs增强MRI构建的3D视图，显示不同角度下脑组织(灰色)中的显微原位神经胶质瘤(绿色)。 c 用Amira 2020.1(美国Thermo Fisher Scientific)和Clinical Eclipse治疗计划系统(15.6)评估不同早期不同早期肿瘤体积( n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。 d 大脑的清理和成像过程以及小肿瘤的识别(小箭头)。 e 原位GBM荷瘤小鼠全脑宽视野图像。灰色:脑组织，红色:RFP表达的胶质瘤，绿色:Mn@CCs。
光片荧光显微术(LSFM)成像允许对Mn@CCs在肿瘤中的分布和渗透进行3D可视化 为了清楚地呈现不同阶段的肿瘤的靶向性、分布性和穿透性，执行了用于3D重建的全脑的清除和成像技术和高分辨率绘图，这使得能够完整地观察脑肿瘤 50 ,51 。使用立方体进行光学清除后 52 脑组织是透明的，组织结构通过对整个荷瘤脑进行宽视野3D成像的光幕荧光显微术(LSFM)成像进行可视化(图。 7d，e ).在3D LSFM成像中，来自U87 MG-RFP的红色信号清楚地标记了肿瘤的位置(图。 7e ，补充图。 16 )，并且辅助电影呈现肿瘤的形态，清楚地看到不同阶段的3D结构(补充视频 3 ).令人惊讶的是，来自我们合成的Mn@CCs的绿色信号与来自不同角度的红色信号重叠得非常好(图。 7e ，补充图。 16 ).肿瘤的三维可视化清楚地显示了在整个肿瘤中的均匀分布和高穿透性，甚至在晚期颅内肿瘤中存在多结节(补充电影 3 ).总之，这些数据表明，Mn@CCs可以穿过完整的血脑屏障分布到大脑中，并实现对不同阶段颅内肿瘤的特异性靶向、均匀分布和高穿透性，这表明我们的Mn@CCs在开发GBM的有效诊断和治疗中具有很高的潜力。
Mn@CCs优先靶向原位小鼠模型中的显微镜下和分散性肝细胞癌 除了原位神经胶质瘤，肝细胞癌也是世界上最常见的恶性肿瘤之一。它的恶性程度最高，在恶性肿瘤发病率中排名第六，在死亡率中排名第三，因此严重危害生命和健康 53 。MRI是检测肝脏中肿瘤包膜存在的最佳成像方法，Gd-DTPA也是实现增强成像最常用的MRI造影剂 54 。由于Mn@CCs的出色成像能力，我们还建立了一个超小型分散性原位肝细胞癌小鼠模型(总长度为6.5±1.4mm，总宽度为3.5±0.8mm)，并通过生物发光和MRI进行监测(补充图。 17 ).
为了评估Mn@CCs的对比度增强性能并与Gd-DTPA进行比较，我们注射了Magnevist或Mn@CCs (20 mg kg −1 )通过尾静脉，监测和分析肿瘤中的MRI信号(图。 8a–j ).在注射后1-4小时，在原位肝组织中观察到显著的阳性信号增强，表明Mn@CCs在肝肿瘤中成功积累(图。 8a、c、f、h 8a ).然后，在大约8小时时，信号下降到注射前的水平，表明颗粒从循环中排出(图。 8a、c、f、h ).在超小型和分散性原位肝细胞癌小鼠模型中，比较Mn@CCs MRI造影剂与商业钆基造影剂Gd-DTPA的功效也是重要的。在等剂量注射的情况下，仅在低SNR下实现了肿瘤增强，并且在注射后1小时内迅速消失(图。 8d，我 ).此外，放大的图像不能描绘清晰的肿瘤边缘(图。 8b，g ).与Gd-DTPA相比，Mn@CCs显示出区分具有多结节肿瘤和正常组织的高灵敏度和高准确性(图。 8e，j
图8:评价Mn@CCs优先靶向原位小鼠模型中的微观和分散性肝细胞癌。 a , b 静脉注射Mn@CCs后不同时间点荷HepG2小鼠的体内轴向MR图像( a )和广东DTPA( b ). c , d 在Mn@CCs的不同时间点量化肝癌中的MRI信号( c )和广东DTPA( d )在 a 和 b (n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。与对照组相比有显著差异。* P < 0.05, ***P < 0.001. Statistical significance was assessed via unpaired two-tailed Student’s t -测试。 e Mn@CCs和Gd-DTPA对显微肝癌成像能力的比较( n = 3个生物学上独立的动物)。所有统计数据均表示为平均值±SD。*与广东DTPA相比，Mn@CCs的显著差异:30分钟( p = 0.029)，1 h( p = 0.023)，2 h( p = 0.003)，4 h( p = 0.044)，8 h( p = 0.021)。* P < 0.05. Statistical significance was assessed via an unpaired two-tailed t -测试。 f , g 静脉注射Mn@CCs和Gd-DTPA后不同时间点荷HepG2小鼠的体内冠状MR图像。 h , i 在Mn@CCs的不同时间点量化肝癌中的MRI信号( h )和广东DTPA( i )在 f 和 g (n = 3个生物学上独立的动物)。与对照组相比有显著差异。* P < 0.05, ***P < 0.001. Statistical significance was assessed via unpaired two-tailed Student’s t -测试。 j Mn@CCs和Gd-DTPA对显微肝癌成像能力的比较( n = 3个生物学上独立的动物)。*与Mn@CCs和Gd-DTPA相比有显著差异:30分钟( p < 0.001), 1 h (p < 0.001), 4 h (p = 0.028)。* P < 0.05. Statistical significance was assessed via an unpaired two-tailed t -测试。 k 裸鼠原位肝组织切片的H&E染色。实验重复了三次。
全肝H&E染色图像显示，大小约为0.5 mm的显微镜下分散的肝细胞癌清晰可见，并与正常和良性组织区分开来，肝细胞的放大图像和详图证实了肿瘤的存在(图。 8k ).这些直接比较结果表明，Mn@CCs在微观和分散的原位肝细胞癌小鼠模型中也提供了优于Gd-DTPA的肿瘤对比增强，其通过Mn@CCs增强的MRI实现了肿瘤区域、结节数目及其大小的精确描绘。
Mn@CCs的长期生物相容性 此外，通过向健康小鼠静脉注射Mn@CCs (60 mg/kg)来评估Mn@CCs的长期生物相容性。在第7天使用H&E染色对主要器官(包括肝、脾、肾、心脏和肺)进行的组织学检查显示没有明显的干扰(补充图。 18a ).血液生物化学和血液学分析显示，注射Mn@CCs前后的肝功能、肾功能或血液指标没有显著差异，表明Mn@CCs没有产生全身毒性(补充图。 18b
总之，我们使用食品添加剂和一种氨基酸作为前体制备了碳化的锰(II)顺磁性络合物(Mn@CCs)。锰 2+ 离子与官能团配位封闭在碳化壳层中，表现出超高的电阻率 1 松弛度(22.1毫米 −1 −1，9.4 T)且稳定性高。与最常见的临床造影剂Magnevist (Gd-DTPA)相比，我们证明了Mn@CCs能够穿过正常健康小鼠的完整BBB最重要的是，3D MRI和LSFM成像允许Mn@CCs对肿瘤的均匀分布和高穿透性的三维可视化，证明Mn@CCs能够对小鼠的显微原位单结节脑肿瘤(约1 mm)和多结节肝肿瘤(每个结节< 1 mm)进行精确的磁共振成像。此外，Mn@CCs在注射后4小时通过肾脏清除有效地从宿主体内排出，并有少量沉积。总的来说，超小原位脑和肝脏肿瘤的优异弛豫性和成像能力可以得出结论，Mn@CCs优于目前用于原位肿瘤的临床MRI造影剂，并提供更可靠的早期诊断。
