一类p53错义突变体激活致癌的tead/yap转录
我们最初的目的是确定tead/yap激活是否最初报告为p53 R280 K错义突变。21，被其他P53基因突变体所共有。为此，我们筛选了不同的p5 3错义突变体，这些突变体在mcf10a永生化人乳腺上皮细胞中外显子表达，这些突变体对于河马通路和p5 3的成分都是野生型，因为它们具有激活tead转录报告的能力。25。在10-15%的肿瘤中，有热点，也有较少常见的突变，这些突变会特别损害dna与p5 3野生型(Wt)目标基因启动子的接触。21，与过度表达YAP相比，增加了TEAD记者的活性。1A)。相反，R175H和g245S p5 3热点突变体，约占p5 3错义突变的10%左右。26，有任何效果(图1)。1A)。检测到的突变体外源性表达的p53蛋白水平与这些突变体在人肿瘤中的内源性表达水平相似(附图)。1A)。这些发现认为，至少有2类p53、GOF错义突变，DNA接触突变体专门负责上调TEAD/YAP转录。
图1：p5 3 DNA接触突变通过MVA通路激活驱动人肿瘤中tead/yap依赖的转录/转化。a稳定表达空载体(EV)的MCF10A细胞、YAP WT、P53 R248Q、P53 R248W、P53 R273H、P53 R273C、P53 RS241F、P53 R175H或P53 G245S的TEAD报告活性。b稳定表达EV对照MCF10A细胞、YAPWT或P53 R273H细胞的TEAD报告活性在有或没有dnTEAD 4稳定表达的情况下表达。c代表形象n=2在稳定表达EV对照的MCF10A细胞软琼脂、YAP或P53 R273H的软琼脂中有或不存在dnTEAD 4稳定表达的不依赖于锚定的复制。d载于补充表中含有热点p53 DNA接触(蓝色)、构象(红色)或空突变(灰色)的人肿瘤细胞系的tead报告活性1。293 T(Wt P53)和H 2052细胞(wt p53和NF2；LATS 2 LoFs)分别作为阴性和阳性对照。e稳定表达空载体对照(Ctr)、显性阴性TEAD 4(DnTEAD 4)或p53 shRNA(ShP53)的肿瘤细胞系的TEAD报告活性。f代表板n=2个表达空载体对照(Ctr)、dnTEAD 4或shP53的肿瘤细胞株经14d稳定表达后，出现二维集落形成。g实时定量PCR技术检测稳定表达EV的MCF10A细胞、YAPWT、P53、R273H或P53 R175H细胞中MVA通路基因HMGCR和Sqle的mRNA表达水平。h用实时PCR技术检测稳定表达shScr或shP53的细胞株中MVA通路基因HMGCR和Sqle的mRNA表达。i稳定高表达p53、R273H或P53 R175H的MC10A细胞HMGCR启动子芯片分析用p5 3或对照免疫球蛋白G(IgG)抗体进行芯片检测，并对所指示的启动子进行实时PCR定量。以乙酰胆碱受体(ACHR)启动子为阴性对照。p值是用两个尾得出的。t-均值±SD的检验n=3个独立于生物的复制。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data with actual calculated p值作为源数据文件提供。
图形1B表明慢病毒介导的dnTEAD 4能明显抑制代表p53 DNA接触突变体YAPWT或P53 R273H的MCF10A细胞的TEAD报告活性。这些转化子像那些外生表达p53构象突变体p53R175H的人一样，在三维软琼脂分析中形成了易于检测的菌落，而载体控制的MCF10A细胞却未能做到这一点(图1)。1C)。在相当水平的dnTEAD 4表达水平(补充图。1B)，MCF10A YAPWT和MCF10A P53 R273H细胞几乎没有形成琼脂集落，但MCF10A R175H细胞对集落形成无明显抑制作用。所有这些发现都强烈地认为，由p53 DNA接触突变体激活的tead/yap转录激活是其转化GOF的原因之一。
人肿瘤内P53 DNA接触、构象或零突变分析(附表)1)对于上调的tead/yap转录，p53 DNA接触突变的转录水平较高，可与H 2052间皮瘤细胞相比，NF2和LATS 2的LOF突变类似于H 2052间皮瘤细胞。25(无花果)1D)。与之形成显著对照的是，具有改变p53构象的内源性突变或无突变的肿瘤对tead报告活性呈阴性(图1)。1D和补充表1)。内源性tead/YAP靶基因CTGF和CYR 61的表达水平27，展示了同样的图案(附图)。1C).
与外源性表达的TEAD 4相比，shp53抑制携带内源性P53 DNA接触突变体的人肿瘤中TEAD 4的高水平转录，进一步证实突变型p53是致病的(图一)。1E)。P53基因敲除对人肿瘤的增殖有明显的抑制作用，所有的p53错义突变均被检测，作为特异性对照，对H 1299肿瘤细胞集落形成没有影响。1F)缺乏可检测的p53(附图)。1D)。值得注意的是，dnTEAD 4只拮抗具有内源性p53 DNA接触突变的肿瘤的集落形成。这些结果表明，上调的tead/yap转录是其增殖所必需的，并证实内源性p53构象突变必须具有不同的GOF机制。1F)。MDA-MB-468肿瘤细胞对shP53或dnTEAD 4转导的应答具有代表性的p53 DNA接触突变体，其特征为G1期阻滞(补充图1)。1E)。尽管p5 3 dna接触突变的肿瘤细胞已知有其他潜在的内源性致癌因素(补充表)，但这仍然是事实。1)。因此，无论是在人永生化细胞模型中还是在人类肿瘤中，外源性或内源性p53 DNA接触突变体激活tead/yap转录都是解释其转化GOF的必要条件和充分条件。
在各种报道的GOF机制中p53错义突变体16,17,18，生化研究表明与YAP有直接的相互作用。28或上调SREBPs靶基因19、甲羟戊酸(MVA)转录调控因子和脂肪酸生物合成途径29。我们观察到在肿瘤细胞内表达P53 DNA接触突变体时，未发现与YAP相互作用的p53蛋白(附图)。2A)。而外源性P53、R273H的表达则使父母MCF10A细胞的HMGCR和Sqle转录水平显著升高，而P53 R175H和Yap WT均无明显影响(图1)。1g)。P53基因敲除还导致携带p53 DNA接触突变体的人肿瘤细胞中MVA通路基因HMGCR和Sqle的表达下调(图一)。氢)但对p53构象突变者无影响(图一)。氢)。如先前报告所述19芯片分析显示P53 R273H与MVA通路基因HMGCR启动子结合，在MCF10A细胞中外显子表达该P53 DNA接触突变体。1I)。相反，我们观察到P53 R175H(一个热点构象突变体)与这个启动子没有明显的结合(如图所示)。1I)。当我们用内源性p53、DNA接触或构象突变分析人肿瘤细胞系时，也得到了类似的结果(补充图)。2B)。所有这些结果表明，p53 DNA接触而非构象突变体对MVA通路基因表达的上调能力，与其与MVA通路启动子结合的选择性和上调TEAD/YAP转录的能力有关，无论是在MCF10A模型中外生表达还是在人肿瘤细胞内表达。
RhoA/ROCK/actomyosin抑制剂拮抗p53 DNA接触突变体诱导的致癌TEAD/YAP转录
MVA通路利用乙酰辅酶A产生甾醇和异戊二烯类化合物，它们是婚前化、膜栓和激活参与细胞增殖和运动的蛋白质所必需的。20。为了进一步了解p5 3 dna接触突变导致tead/yap转录上调的机制，我们使用辛伐他汀抑制催化MVA产生的酶hmgcr和ggti-298，后者阻断了蛋白质婚前化的最后一步及其与膜的结合，作为药理学探针。19,20,21。辛伐他汀和ggti-298对内源性p5 3 dna接触突变的肿瘤组织中的tead报告活性均具有剂量依赖性的拮抗作用，与p5 3 dna接触突变体下游激活转录的mva通路一致。19(补充图。3A，b)。然而，两种抑制剂都能不同程度地拮抗p53 DNA接触或构象突变和永生化MCF10A细胞对肿瘤细胞的增殖(补充图)。3C，d)。这些结果与以往的研究结果一致，表明这两种抑制剂都具有多向性作用，其中包括诱导细胞凋亡和抑制多种肿瘤类型的增殖。30,31,32.
已知小gtp酶的rho家族是通过脂化的MVA途径激活的，它通过脂化作用于细胞膜，在细胞膜上影响细胞骨架收缩性的不同方面。33,34。也有证据表明RhoA促进yap核积累以增加tead/yap转录。21，但有报道称，rho的其他家庭成员cdc 42和rac 1也这样做。35,36,37。我们观察到MVA处理或外源RhoA表达明显刺激了MCF10A细胞的tead报告活性。2A，而Rac 1或Cdc 42的作用相对较小(图1)。2A)。作为对照组，RhoA、Rac 1或Cdc 42的外源性表达增强了其内源性下游效应物cofilin、PAK 1/2或PAK 4/5的磷酸化，与MVA诱导的所有三个靶点的磷酸化程度相当(图1)。2B)。图形2C结果表明，Rho家族成员中只有RhoA能促进肌动蛋白聚合，与未处理的MCF10A细胞相比，F/G肌动蛋白比率增加(图1)。2C)。作为对照组，肌动蛋白聚合反应的抑制剂--拉布球蛋白B38，以及Phalloidin，它能稳定肌动蛋白聚合物。39，分别对肌动蛋白聚合产生了预期的负效应和正效应。2C)。此外，外源性表达dnA，但无论是racdn1还是dnCdc 42，都不能阻断MVA诱导的TEAD报告活性。4A)。作为对照组，dnRhoA、dnric 1和dnCdc 42均抑制其内源性下游效应的磷酸化，但几乎没有交叉抑制作用(补充图1)。4B)。因此，当mva激活了三个rho家族成员的同时，也有证据表明mva通过增加翻译后的脂化而使其膜定位。40单用RhoA对TEAD/YAP转录的上调是必要的，也是充分的。
图2：p53 DNA接触突变体通过MVA途径激活RhoA/ROCK信号通路，增加tead/yap转录，诱导转化表型。a, bTEAD记者活动(a)和免疫印迹的全细胞裂解物(b)转染EV的MCF10A细胞，未用MVA 0.5mm处理24h，或用RhoA、Rac 1或Cdc 42转染。溶酶体以指示抗体为探针，以β-肌动蛋白为负载对照。c从转染EV对照、RhoA、Rac 1或Cdc 42的MC10A细胞中提取F-actin和G-actin的免疫印迹。F/G-肌动蛋白比率n=2个与生物无关的复制体。d转染RhoA或稳定表达EV对照的MCF10A细胞的全细胞裂解物免疫印迹，p53R273H或p53R175H对所述抗体进行了检测。e转染RhoA或稳定表达EV对照、P53、R273H或P53 R175H的MCF10A细胞中提取的F-actin和G-actin的免疫印迹。F/G-肌动蛋白比率n=2个与生物无关的复制体。f–h高浓度H-1152对表达P53 R273H的MCF10A细胞TEAD报告活性的影响(英文)f)，Latrunculin B(g)或白比司他汀(h)24小时。i从P53 R273H MCF10A细胞中提取的F-actin和G-actin的免疫球蛋白组分，无论是未经处理(Ctr)还是用所指示浓度的H-1152或1μM Latrunculin B或50μM blebbistatin处理24小时。n=2个与生物无关的复制体。j有代表性的图像n=2个生物学独立的复制体，显示MCF10AEV对照、P53、R273H或P53细胞无锚定性生长，用DMSO或1μM H-1152处理。k高浓度H-1152作用24h后肿瘤细胞热点p53 DNA接触突变的TEAD报告活性。l代表板n=2个独立于生物的复制体，显示出二维集落形成。DMSO或增加H-1152浓度的细胞系。m创伤愈合实验测定体外迁移率。DMSO或1μM H-1152处理细胞48h。p值是用两个尾得出的。t-均值±SD的检验n=3个与生物无关的复制体。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data with actual calculated p值作为源数据文件提供。
Rho相关激酶1和2(ROCK 1/2)是RhoA的几个靶点之一。41。我们观察到P53 R273H而不是p53 R175H可引起REAK下游效应物Cofilin和肌球蛋白轻链-2(MLC 2)磷酸化增加，其水平与RhoA外显子表达MCF10A细胞的水平相当(图1)。二维空间)。此外，含有典型内源性p53 DNA接触突变体的MDA-MB-468细胞中p53基因的敲除降低了pCoflin和pMLC 2的水平，但对含有p53构象突变的HCC 1395细胞的这些岩石下游效应的磷酸化无明显影响(附图)。4C)。值得注意的是，在MCF10A细胞中，P53 R273H与RhoA相比，肌动蛋白聚合增加，而P53 R175H对肌动蛋白聚合无明显影响。2E).
有几种已知的ROCK 1和ROCK 2的药理学抑制剂，它们向细胞骨架信号。42。我们观察到ROCK 1/2双抑制剂H-1152以浓度依赖性的方式显著拮抗P53 R273MCF10A细胞的TEAD报告活性。2F)。结构无关的岩石双重抑制剂，包括Y-27632，GSK 429286，CAY 10622和SAR 407899也拮抗了这一转录(补充图)。5A-C)，进一步支持ROCK 1/2是tead/yap转录的关键RhoA效应。
与ROCK 1/2抑制作用一样(图1)。2F)，拉丁菌素B(图1.2G)或博来司他汀，它通过抑制肌球蛋白的ATP酶功能来拮抗肌球蛋白的收缩。43(无花果)2H)，拮抗表达P53、R273H的MCF10A细胞的TEAD报告活性，其浓度依赖于F/G肌动蛋白比值的显著降低(图1)。2I)。此外，H-1152对P53 R273H MCF10A细胞的琼脂集落形成有明显的抑制作用，但在相同条件下对体外表达P53 R175H的MCF10A细胞的琼脂生长无明显影响。2J)。这些结果强烈认为P53 DNA接触突变体特异性地上调了tead/yap的转录，并通过MVA途径诱导转化表型，引起RhoA/ROCK/actomyosin信号的过度激活。
H-1152同样抑制携带不同内源性p53 DNA接触突变的人肿瘤组织中TEAD报告水平的升高(如图所示)。2K)并以浓度依赖性的方式拮抗其在2D培养中的增殖。2L)。这种靶向性的特异性表现在缺乏任何可检测到的肿瘤细胞生长抑制，p53的构象突变或零突变的浓度至少高出5-10倍(图1)。2L)。作为对照，H-1152降低了岩石靶细胞Cofilin和MLC 2的磷酸化水平，类似于MDA-MB-468和HCC 1395细胞，证实了岩石抑制剂在这两种情况下的作用(补充图1)。6)。活化的tead/yap转录也被报道能增加细胞的运动能力。3和H-1152分别通过内源性P53 DNA接触或构象突变，特异性地抑制了MDA-MB-468的体外迁移，而不影响HCC 1395细胞的迁移。2M)。值得注意的是，H-1152治疗对两种肿瘤的p53蛋白水平均无影响(附图)。6)，排除了选择性降解p53 DNA接触突变蛋白的可能机制。在H-1152和上游MVA途径抑制剂辛伐他汀(均未单独抑制增殖)浓度下，联合作用可选择性拮抗肿瘤细胞的增殖和内源性p53 DNA接触突变(附图)。7)，支持这两种抑制剂在同一途径内以不同的成分作为生化靶点。
复发的Hippo通路损伤依赖于生理的Rock信号来驱动致癌基因tead/yap的转录。
我们认为，如果RhoA/ROCK信号通路是Hippo通路损伤所驱动的致癌TEAD/YAP转录所必需的，那么RhoA/ROCK信号通路的药物抑制剂也可能对抗Hippo通路调控异常的肿瘤，该肿瘤目前还没有靶向治疗。为了探讨这一可能性，我们构建了NF2或LATS 1/2的组成性shRNA基因敲除系，并在野生型MCF10A细胞的共同背景下表达YAP WT(补充图1)。8)。与对照组相比，每一次基因操纵都会导致TEAD报告活性升高(图一)。3A)。值得注意的是，H-1152对每个病例的TEAD报告活性都有明显的拮抗作用。3A)。P53 R273H-MCF10A细胞中RhoA/ROCK机械信号通路表达上调，而pMLC 2和pCoflin的磷酸化水平升高。3B)和肌动蛋白聚合。3C)，对Hippo通路的调控障碍与对照组MCF10A细胞无明显差异。这些结果表明，YAP外源性过表达或敲除NF2或LATS 1/2所引起的河马通路功能失调并不影响RhoA/Rock机械信号的生理水平。
图3：岩石抑制对抗tead/yap转录和Hippo通路的转化表型解除了对肿瘤的管制。a表达shScr、P53 R273H、Yap WT、NF2 shRNA(ShNF 2)或LATS 1和LATS 2 shRNAs(shLATS 1/2)的MCF10A细胞表达shScr、P53 R273H、YAP WT和LATS 2 shRNAs(shLATS 1/2)。b稳定表达EV对照细胞、p53 R273H、YAPWT、shNF 2或shLATS 1/2的MCF10A细胞裂解液Westernblot分析以β-肌动蛋白为加载对照.cTriton-不溶性(F-actin)和Triton-可溶性(G-actin)组分的Westernblot分析a)。用β-actin抗体检测各组分.F-和G-肌动蛋白的比率代表n=2个与生物无关的复制体。dTriton-不溶性(F-actin)和Triton-可溶性(G-actin)组分的Westernblot分析a1μM H-1152处理24h，用β-actin抗体检测各组分。F-和G-肌动蛋白的比率代表n=2个与生物无关的复制体。e经1μM H-1152处理48 h后，用创面愈合试验测定细胞的体外迁移率。f代表板n=2个不依赖生物的复制体，显示同一细胞在琼脂中与锚定无关生长。a)未经治疗或用1μM H-1152治疗，每4天1次，共21天。g提示肿瘤细胞系对H-1152浓度升高反应24h的TEAD报告活性。h代表板n=2个不依赖生物的复制体，每2天用DMSO或1μM H-1152处理14d，显示出2D集落形成。IDMSO和1μM H-1152作用48h后，用创面愈合实验测定细胞的体外迁移率。p值是使用双尾计算的。t-均值±SD的检验n=3项独立实验。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data with actual calculated p值作为源数据文件提供。
H-1152处理降低了岩石下游效应物质的基础磷酸化水平(图)。3B)以及每种情况下肌动蛋白聚合的基本水平(如图所示)。三维空间)。H-1152治疗对两种运动也有明显的拮抗作用(图一)。3E)和表达YAPWT、shNF 2或shLATS 1/2的MCF10A细胞的琼脂集落形成(图1/2)。3F)但对表达HRAS V12G的MCF10A细胞的琼脂生长无明显影响。3F)，一种不上调tead/yap转录的癌基因。25。所有这些结果都证明了上调的tead/yap转录和Hippo通路引起的转化表型对生理岩石信号的依赖性，以及岩石抑制剂选择性拮抗这些效应的能力。
岩石抑制剂对表达shNF 2或shLATS 1/2的MCF10A细胞的TEAD/YAP转录和琼脂生长具有拮抗作用，提示LATS 1/2不需要YAP磷酸化。事实上，表达Yap 5SA的MCF10A细胞中存在tad报告活性，该细胞缺乏LAS抑制磷酸化位点。44对血清戒断完全耐药，是已知的河马通路激活剂45(补充图)9A)。相反，H-1152拮抗了TEAD记者的活动(补充图)。9B)以及这两种动力(补充图。9C)和琼脂集落形成的相同细胞(补充图。9d)。值得注意的是，如先前报道的那样，血清戒断增加了内源性Yap s 127磷酸化。44，而ROA/ROCK机械信号通路的岩石抑制和P53 R273H的上调均不影响这一主要LAS位点的磷酸化(补充图)。9E)。这些结果表明，岩石抑制是独立于LAT或任何其他激酶磷酸化该位点。
在WT MCF10A亲代细胞中，血清戒断使TEAD报告活性在4h内下降75%以上，而H-1152处理仅使报告活性降低24 h(补充图)。9F)。有充分的文献证明，Hippo通路的激活会导致yap从细胞核转移到胞浆。4。共聚焦显微镜显示，血清戒断在4小时内引起明显的转移，而H-1152处理即使在48小时内也不能检测到改变Yap核-细胞液比率(补充图1)。9g)。在岩石抑制剂的存在下，Hippo通路的激活使YAP向胞浆转移，表明它在诱导YAP细胞质再定位方面具有优势(补充图)。9g)。值得注意的是，在血清戒断或岩石抑制对抗tead报告活性的条件下，每一种都会引起tead-yap复合物的破坏，这是通过YAP与抗泛TEAD(补充图)的共同免疫共沉淀来测量的。9H)。所有这些结果表明，Hippo通路的激活和岩石抑制通过不同的机制阻断tead/yap相互作用，从而拮抗tead/yap在WT细胞中的转录。
我们接下来检测了H-1152对河马通路核心成分NF2和/或LATS 1/2(H 2052、H 2373、MSTO-211 H间皮瘤、MDA-MB-157乳腺癌和Snu387肝癌)、YAP扩增(SF 268胶质瘤)或Hippo途径和p53 DNA接触突变(MDA-MB-231乳腺癌)的拮抗能力。在每一种情况下，这些肿瘤依赖于TEAD/YAP转录活性促进增殖(附图)。10a，b和25)。此外，岩石抑制剂显着地拮抗了TEAD的报告活性(如图所示)。第三代)，2维集落形成(图1.3H)，以及河马通路内源性病变的人肿瘤的体外迁移(图1。3I)浓度(1μM)时，也选择性地拮抗人肿瘤P53 DNA接触突变(见图1)。2)。这种生长抑制不依赖于lats的yap磷酸化，这是由Pyap没有任何改变所证实的。S 127治疗这些肿瘤的H-1152诱导的水平(附图)。11).
ROCK 1是推动癌基因tead/yap转录的岩石异构体。
ROCK 1或ROCK 2的特异性敲除在小鼠发育的不同阶段是致命的，尽管两者都被认为具有相似的底物。42,46。然而，也有证据表明它们具有不同的生化功能。47。我们观察到ROCK 1的shRNA敲除抑制了NF2突变株H 2373细胞的TEAD报告活性。4ANF2和P53 DNA接触突变体MDA-MB-231细胞(如图所示)。4B)，而ROCK 2击倒却没有这些效果(如图所示)。4A，b和补充图。12A)作为对照组，ROCK 1和ROCK 2在这些细胞中的表达水平相似(附图)。12b)。同样，ROCK 1/2双抑制剂H-1152对这两种肿瘤细胞系kd 025，一种选择性ROCK 2抑制剂的tead报告也有很强的抑制作用。48即使在浓度更高的情况下也不能做到这一点(图中所示)。4C，d)。此外，shROCK 1和H-1152，但shROCK 2和KD 025均未降低F/G肌动蛋白比率(图1)。4E，f)。这些结果表明，ROCK 1是一种岩石异构体，负责增强细胞骨架收缩能力和tead/yap转录。最后，shROCK 1(而不是shROCK 2和KD 025)分别拮抗内源性NF2或NF2和p53 DNA接触突变的H 2373细胞和MDA-MB-231细胞的增殖(图1)。4G，h)。在相同的条件下，这些干预措施均不改变WT p53 MCF10A或HCC 1395的集落形成，后者含有p53构象突变体(图1)。4G，h)。通过对具有内源性p5 3 dna接触或构象突变的肿瘤标本rna seq数据的挖掘，发现tcga三阴性乳腺癌(Tnbc)的ROCK 1或roCK 2表达水平没有统计学上的显着差异，tnbc是一种高频率p53错义突变的亚型。49(补充图。13A)。同样，ROCK 1和ROCK 2在肿瘤标本中的水平与tcga间皮瘤数据集中的Hippo通路突变或Hippo通路组分的野生型相类似，其中常见的是Hippo通路核心成分基因的突变。50(补充图。13B)。因此，所有这些发现都证明ROCK 1/actomyosin信号本身，而不是ROCK RNA表达水平的差异，是复发P53 DNA接触和/或Hippo通路损伤的肿瘤中癌基因tead/yap转录的关键效应。
图4：通过肌动蛋白细胞骨架发出的ROCK 1信号是通过p53、DNA接触和/或Hippo途径突变的人肿瘤的tead/yap转录激活和转化的表型所必需的。a, bH 2373细胞的TEAD报告活性a)或MDA-MB-231细胞(b稳定表达shScr、shROCK 1、shROCK 2或shROCK 1/2。c, dH 2373细胞的TEAD报告活性c)或MDA-MB-231细胞(d)未处理或用增加浓度的岩石双重抑制剂H-1152或ROCK 2特异性抑制剂KD 025处理24小时。e, f从稳定表达shScr、shROCK 1、shROCK 2、shROCK 1/2的肿瘤细胞中提取Triton-不溶性(F-actin)和Triton-可溶性(G-actin)组分，用β-actin抗体检测各组分。F-和G-肌动蛋白的比率代表n=2个与生物无关的复制体。g代表板n=2个与生物学无关的复制体，表明稳定表达shScr、shROCK 1、shROCK 2、shROCK 1/2的细胞系在14天内形成了2D集落。h代表板n=2个不依赖于生物学的复制体，表明DMSO或每2天增加KD 025浓度，连续14d，可使所指示的细胞系形成2D集落。p值是使用双尾计算的。t-均值±SD的检验n=3项独立实验。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data with actual calculated p值作为源数据文件提供。
岩石抑制剂在体内选择性拮抗致癌的tead/yap转录
作为对岩石抑制剂选择性拮抗TEAD/YAP激活肿瘤的体内实验，我们采用小鼠异种移植模型。H-1152对TEAD/YAP驱动的MDA-MB-468和MDA-MB-231乳腺癌的体内生长有明显的抑制作用(图1)，分别含有内源性P53 DNA接触或NF2和p53 DNA接触突变。5A)。在同样的条件下，岩石抑制剂对HCC 1395乳腺肿瘤细胞的体内生长几乎没有影响，细胞内存在p53构象突变，缺乏明显的tead/yap转录(见图)。5B)。对H-1152抑制反应的肿瘤细胞Ki 67染色减少，这是细胞增殖的标志，但Caspase 3细胞凋亡的标记物Caspase 3没有明显增加(补充图)。14)。未发现H-1152治疗对体重的不良影响，表明岩石抑制剂靶向TEAD/YAP转录激活的人肿瘤在这个临床前体内模型中没有明显的体内毒性(如图1所示)。5C)。我们还监测了H-1152治疗对ROCK信号在体内的抑制作用，并观察到肿瘤切片中pCoflin免疫染色的减少(图一)。5D).
图5：岩石抑制选择性地拮抗TEAD/YAP驱动的人肿瘤的体内生长。a–cMda-MB-468，mDA-MB-231免疫低下小鼠原位接种肿瘤细胞a)或HCC 1395细胞(b在肿瘤体积达到100 mm后每日注射H-1152(25 mg/kg)。3. n每组5只。p值显示在使用两个尾计算的图中。t-测试n=每组5只不依赖生物的小鼠。在治疗开始和结束时，每只老鼠的体重也被显示(c). d肿瘤切片免疫染色a, b)用方法中描述的针对pCoflin的抗体。标尺：100分贝。n=每组5只不依赖生物的小鼠。e描述在生理条件下抑制tead/yap转录的模型，由p53 DNA接触突变激活或岩石抑制物对Hippo通路的改变。p < 0.05, **p < 0.01. Source data with actual calculated p值作为源数据文件提供。
P5 3 DNA接触突变或Hippo通路变异的肿瘤标本具有tead/yap转录特征。
我们进行了基因集富集分析(GSEA)。51在临床肿瘤标本中寻找p53、DNA接触突变或Hippo通路突变与tead/yap转录激活之间的统计联系。为此，我们应用了一个建立良好的tead/yap保守基因标记。52TNBCs和间皮瘤的TCGA RNAseq数据集。通过GSEA，与p53构象突变相比，p53 DNA接触突变的TNBCs中存在显着的tead/yap保守特征富集(补充图1)。15A)，以及在间皮瘤患者河马路径突变(补充图。15B).
