不同尺寸和基质亲和力的工程IL-2融合 为了确定肿瘤内免疫治疗的疗效是否取决于其药代动力学特征,我们试图建立一组不同分子量和胶原结合亲和力的免疫治疗药物。最近,我们和其他人证实胶原蛋白是一种丰富的基质蛋白,是保留局部免疫治疗的有效和不可知的靶点。 29 ,31 ,32 ,33 ,34 。为了对胶原蛋白进行免疫治疗,我们使用了内源性胶原结合蛋白-1(Lair)的白细胞相关免疫球蛋白样受体(Lair)的外显子结构域。 35 。为了在保持其大小的同时消除lair的胶原亲和力,我们利用酵母表面显示器设计了惰性的lair版本。 36 。野生型巢穴显示在酵母表面特异性结合胶原相关肽(CRP),一种可溶的胶原模拟(图)。 1A 和补充图。 1A,b )37 。我们制作了一个酵母库,展示了突变体(如图所示)。 1A,b 与CRP结合减弱的克隆(如图所示)。 1B,c 和补充图。 2A,b )。重组表达后,这些突变体仍保留与天然胶原的残留结合(补充图)。 3A-j )。基于丰富酵母无性系的序列(附图)。 2A,b ),然后我们合理地将突变组合到被认为对CRP结合至关重要的残基上。 38 。在41位(R41A)和43位(E43A)的两个突变在一起,消除了与胶原蛋白的结合,构成了巢穴。 x ,一种惰性大小匹配的蛋白质。 1D ).
图1:分子量和胶原亲和力是影响IL-2疗效的关键因素. a 酵母文库示意图显示突变的白蚁为Aga 2(灰色)融合蛋白。用抗c-myc抗原表位(Green)的荧光抗体检测LAIR的表达,用荧光链霉亲和素(SA-AF 647,Red)检测与生物素化胶原相关肽(CRP)的结合。 b 连续流动辅助细胞分类分离突变体,减少与生物素化CRP的结合。 c 人造板富集酵母上生物素化CRP的平衡结合滴定 b (平均值+S.D.) n =8)与野生型显示巢穴的酵母( n =1)。流式细胞术测定SA-AF 647的中位荧光强度。 d 巢穴和巢穴 R41A E43A ,从今以后 x ,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定胶原结合。 n =6表示lair和 n =3表示lair x ). e 胶原结合亲和力( K d 用酶联免疫吸附法(EL ISA)测定小分子和大分子形式(KD,千吨数)的IL-2融合蛋白的平衡解离常数; n =3所有群体除外 n =6(Lair-IL2)。 f IL-2融合蛋白对CTLL-2细胞增殖的剂量依赖性(均值+S.D.) n =3) g B16F10肿瘤研究时间表(上)和治疗成分(下)示意图。小鼠接种1×10 6 第0天,B16F10细胞在右侧皮下。治疗第6天和第12天。TAA,肿瘤相关抗原;I.tu,瘤内;I.P.,腹腔内。 h , i 肿瘤生长(左,平均+S.D.)和生存(权利)随着时间的推移( n =PBS的10只小鼠(i.tu.)和PBS(i.tu.)+TA 99(I.P.)团体,和 n =所有其他各组小鼠7只)。肿瘤区域会被显示,直到一只老鼠被安乐死。用单尾学生法计算各组肿瘤面积及生存期(右上角)的统计学意义。 t -测试和对数级曼特尔-考克斯检验,相对于PBS(i.tu.)+TA 99(I.P.)。其他生存比较(图例相邻)是由一个对数级曼特尔-考克斯检验。* P < 0.03; **P < 0.002; ***P < 0.0002; ****P < 0.0001; n.s. not significant. Source data for panel c –f 和 h , i 在源数据文件中提供。板 a 和 g 由BioRender.com创建。
和许多免疫疗法一样,IL-2会引起暴露依赖性的抗肿瘤作用,使之成为一种模型免疫调节剂,以测试药物动力学特性对治疗效果的影响。我们将IL-2融合到巢穴或巢穴。 x ,产生两种小规模(32 Kd)免疫疗法lair-il2和lair。 x -IL2(附图) 4A-C )胶原亲和力分别为2 2 0nm和>1μM。 1E )。由于CRP是一种不完全的胶原模拟物,表现出较高亲和力的lair突变体对天然胶原的亲和力没有增强(补充图)。 5A-d )。相反,我们利用黏性通过使用巢穴和巢穴二聚体来增加结合强度。 x 。为了被动地增加分子量,我们还包括了一种大的惰性蛋白,即含有组氨酸谷氨酰胺突变(H464q)的小鼠血清白蛋白(Msa),它可以消除新生儿fc受体介导的再循环。 39 。大型(137 KD)免疫疗法(补充图)。 4C ),lair-lair-msa H464Q -IL2,lair-lair x -生活津贴 H464Q -IL2和Lair x -巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2分别显示13 nm、130 nm和>1nm的胶原亲合力(图1)。 1E )。所有IL-2融合蛋白在诱导T细胞增殖方面均具有相当的生物活性。 1F ).
局部IL-2的大小和矩阵亲和力决定响应 作为一种单一的药物,IL-2治疗不能克服肿瘤微环境造成的免疫抵抗障碍.然而,我们和其他人已经证明,IL-2与一种肿瘤靶向抗体结合,可以通过局部刺激细胞毒性CD8来实现对肿瘤的暴露依赖性控制。 + T细胞和NK细胞 29 ,40 ,41 ,42 ,43 。因此,我们治疗荷瘤小鼠,免疫浸润(补充图)。 6 ),皮下B16F10黑色素瘤肿瘤与抗肿瘤相关抗原酪氨酸酶相关蛋白-1(抗TYRP-1或TA 99)的抗体在腹腔内和瘤内注射我们的IL-2融合蛋白(图一)。 1g )。所有IL-2融合蛋白均导致肿瘤生长延迟(如图所示)。 1H,I 然而,使用大格式的融合处理(如图所示)。 氢 )进一步减缓肿瘤生长( p Lair=0.01 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2对Lair x -IL2)和加强生存( p Lair=0.01 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2对Lair x -IL2; p =0.04为lair-lair x -生活津贴 H464Q -IL2和lair-IL2相比,它们的小格式(图2)。 1I )。在每一层大小的范围内,与胶原结合的疗法提高了整体生存率(图1)。 1H,I )。然而,两种大格式胶原结合变异体lair-lair-msa治疗后的生存率差异。 H464Q -IL2和Lair-巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2不同胶原亲和力的差异无统计学意义(图二)。 氢 )。值得注意的是,肿瘤的生长延迟了( p =0.25)和生存津贴( p =0.21)的目标小格式lair-IL2相当于非目标大格式的巢穴。 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2。先前的工作表明,系统地传递大格式的IL-2(>70 kd)比野生型IL-2(15 Kd)更好地控制肿瘤,这是由于循环半衰期基于大小的增强导致肿瘤暴露增加。 40 。单纯比较lair-l2和lair的局部效应 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q IL2,我们通过补充局部治疗来配合全身IL-2暴露。 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2腹腔注射(补充图1)。 7A )。我们再次发现肿瘤的生长延迟和生存效益(补充图)。 7b,c )小目标巢穴-IL2与大型非目标巢穴难以区分。 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2。它们的治疗等效性表明,即使是直接注射到肿瘤内的治疗,分子大小也与局部暴露密切相关。
模型预测局部治疗活动的持续时间 为了了解和预测一种治疗药物的药代动力学特性如何影响疗效,我们将瘤内注射过程中和瘤内注射后发生的动力学和转运动力学重新描述为一个计算模型。在瘤内注射过程中,肿瘤间质(即肿瘤细胞间的细胞间间隙)内的液体被注射量瞬间移位。从理论上讲,对于混合良好的肿瘤间质注射,肿瘤内的体积( V 持持率 )与肿瘤的大小有关( V 肿瘤 )和间隙空隙体积分数(ε) 肿瘤 ):
$${{{V}}}_{\rm{holdup}=({{{V}}}_{\rm{tumor})\times{varepsilon}{rm}$
(1)
该模型假设任何未堵塞的注射量都会立即释放到血液循环中,这与瘤内注射过程中全身传播的观察相一致。 44 ,45 。(无花果) 2A )注射后,IL-2融合蛋白在肿瘤内四种状态之间切换:未结合,与胶原结合,与IL-2受体(IL-2R)结合,或同时与这两种靶点结合(如图所示)。 2B )。蛋白质结合的相互作用是由关联决定的( k 在……上面 )和离解( k 脱 )速率常数,复合物及其组分的浓度。该模型包括两个去除药物的过程:(1)白细胞介素-2R的消耗。 + 肿瘤细胞和(2)血液清除。消费是使用内部化率( k 国米 )IL-2:IL-2R复合物。由于IL-2诱导NK和T细胞增殖,我们加入了一个Logistic生长函数来模拟IL-2R的增加。由于肿瘤内均匀较高的间质压力被认为可以消除血管壁和间质间的流体压力梯度,我们的肿瘤内药物传输模型描述了扩散而不是对流的过程。 18 ,46 。蛋白质输注( k 内v )和外渗( k 外溢 )是通过跨瘤内毛细血管的两孔模型的扩散传输捕获的,其毛细血管通透性取决于蛋白质的分子量,Schmidt等人验证了这一关系。 16 。在血液中,血浆清除率( k 清澈 )使用另一个验证的经验关系,它也依赖于蛋白质的分子量 16 。由于缺乏在肿瘤中观察到的功能淋巴管,此处未对进入淋巴系统的运输进行建模。 47 ,48 。我们将定义动力学、输运和细胞动力学的关系转化为一个常微分方程组(ODES)(补充表)。 1 –3 ,生成的代码也可公开使用。 49 )溶解ODE后,随着时间的推移,注入的IL-2融合蛋白的胞外浓度随着时间的推移而在肿瘤内自由扩散,并与靶标结合。(补充图。 8A )为了将模型输出与生物活性联系起来,我们利用这种关系评估了局部注射IL-2融合蛋白([肿瘤内IL-2融合蛋白])的肿瘤浓度:
${},{\mathrm{Activity}=\frac{1}{1+\frac{\mathrm{E}{\mathrm{C}_{50,{\mathrm{IL}2}}{[{\mathrm{Intratumoral}\,{matrem{ll-2}$$
(2)
欧共体 50,IL2 ,IL-2:IL-2R的最大有效浓度为2.4×10。 −7 M(当量) 2 )50 。当肿瘤内注射IL-2的浓度远远超过EC时 50,IL2 ,分数活度接近1。然而,当浓度等于EC时。 50,IL2 ,从而得到半最大响应,分数活度为0.5.(补充图。 8B 曲线下面积(AUC)随时间的变化,估计注射后的蛋白质在肿瘤内有多少天是有效的。(补充图。 8B )
图2:药物动力学模型预测局部IL-2治疗的疗效. 模型模拟肿瘤内注射IL-2胶原结合融合蛋白随时间的变化。 a 在瘤内注射过程中,IL-2融合蛋白立即从注射器转移到体积容量的肿瘤室(圆环)。 V 持持率 和血液室(方)的体积 V 血 b 注射后,注射的蛋白质在肿瘤和血液室之间的扩散是根据输注的速率( k 内v )和外渗( k 外溢 )。从血液中移除注射的蛋白质是以清除的速度进行的( k 清澈 )。表明去除了蛋白质。斜体化率取决于注入蛋白的分子量。在肿瘤间质(INSET)内,注入的蛋白质在靶结合状态之间切换.注射的蛋白质(游离蛋白或胶原结合蛋白)结合IL-2受体(IL-2R)是根据关联率( k ON,IL2R )和离解( k 关闭,IL2R )用IL-2R。当与IL-2R结合时,注入的蛋白-IL-2R复合物以IL-2R内化的速率被内化和降解。 k INT,IL2R )。IL-2信号随时间的延长而增加IL-2R的浓度.注射的蛋白质(游离或IL-2R结合)根据结合率( k 开,可 )胶原蛋白和胶原离解率( k 关闭,柯尔 )。补充表中提供了模型变量、初始条件和方程的词汇表 1–3 . c 模型预测注射IL-2融合蛋白的肿瘤内活性持续时间随分子量(KD)和胶原亲和力(Kd)的变化(P<0.01)。 K d 平衡解离常数(以M为单位)热图上的圆圈表示模型对蛋白质lair-lair-msa的预测。 H464Q -IL2(红色),巢穴-巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2(橙色),巢穴 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2(黄色)、lair-IL2(紫色)和lair x -IL2(粉红色)。每种蛋白质的预测活动天数都与颜色条相邻。 d 图中小鼠的百分比。 1H,I 治疗后100天存活(简写框)。第100天,在对侧左侧接种0.1M B16F10。小鼠在肿瘤再刺激后存活100天的百分比(填充盒)。 e 模型预测的C组肿瘤内活动与图中所示治疗的危险比之间的相关性。 1H,I 与PBS(i.tu.)+TA 99(I.P.)比较治疗对照组。用对数秩法计算危险度。面板源数据 d , e 在源数据文件中提供。面板 a 和 b 由BioRender.com创建。
通过将胶原亲和力和分子量的光谱输入到模型中,我们生成了一个热图,将注射免疫疗法的大小和胶原亲和力与其在肿瘤中的活性持续时间联系起来。(无花果) 2C )。模型预测的活性持续时间为1.33d(~32h)。 H464Q -IL2,0.99天(~24小时) x -生活津贴 H464Q -IL2,0.44天(~11小时) x -巢穴 x -生活津贴 H464Q -IL2,lair为0.24天(~6h),lair为0.13天(~3h)。 x -IL2(附图) 8B 还有无花果。 2C 模型的治疗活性、持续时间顺序与其诱导的体内存活和免疫记忆完全一致(图二)。 二维空间 )以及治疗的危险比(图一)。 2E ).
局部注射IL-2融合蛋白在硅汇中的主要作用是清除循环,而不是T细胞摄取,部分原因是我们的b16f10肿瘤模型中IL-2R+细胞的初始丰度较低。 51 。(补充图。 9A )尽管药物在模拟注射期间和之后向血液中传播了大量的药物(补充图)。 9B ),预测的全身暴露量仍比肿瘤暴露低数量级(补充图). 9C )。在对模型的速率和初始条件进行敏感性分析的基础上,除胶原亲和力和分子量外,影响输出肿瘤暴露的参数是:肿瘤胶原浓度、注射蛋白的初始肿瘤浓度和胶原的半衰期(补充图)。 10 )。浓度估计来源于肿瘤羟脯氨酸含量的测定。 52 (补充图。 11A 和补充表 2 )和根据报告的肿瘤空洞体积分数计算注射滞留量。 16 ,53 ,54 。(补充表) 1 胶原转换是肿瘤巨噬细胞促进的一个缓慢的过程,导致可忽略不计的药物降解(补充图)。 11B-E ),因此没有在模型中进行模拟。 55 。尽管如此,即使我们对浓度和半衰期的选择有很大差异,也证实了模型的发现:肿瘤暴露确实受到肿瘤内注射蛋白质的分子量和基质靶向性的严重影响。
大蛋白容易被肿瘤基质包封。 为了验证模型的药物配置,我们跟踪了 89 用PET/CT显像对B16F10肿瘤注射ZR(78小时半衰期)标记蛋白。为了尽量减少细胞残留放射性核素对肿瘤内总活性的贡献,我们从融合蛋白中去除了IL-2。(补充图。 12A-c )为了一致性,我们还调整了放射性同位素标记后的蛋白质浓度,以确保每个肿瘤在20μL中准确注射0.1nmol蛋白(补充表) 1 )。小鼠注射后在多个时间点成像(见图)。 3A,b 和补充图。 13A-E )。与系统给药相比,瘤内注射的蛋白质比任何其他器官都更多地集中在肿瘤上。部分体积校正(Pvc)和同位素衰变校正PET图像能够精确定量注射后肿瘤中的蛋白质(如图所示)。 3C 和补充图。 13F )。值得注意的是,最初注射的肿瘤只占注射剂量的30%(I.D.)。由于注入量(20μL)超过B16F10维持量(~6.6μL)(补充图)。 14A )。有趣的是,在范围内(20-80毫米),体积与肿瘤大小无关。 3 )在我们的PET研究中进行了评价。(补充图。 14A )。甚大的B16F10肿瘤(200-300毫米) 3 )更好地接近人类肿瘤的大小,但是,维持我们注射剂量的66%,这个剂量仍然只有~13μL,这表明肿瘤间质并不像先前想象的那样快速地混合(补充图1)。 14A )。由于注射量超过肿瘤的容量,我们在周围器官中检测到即时的蛋白质积累,尽管其浓度明显低于肿瘤,并且很难被PET成像所分辨。(补充图。 14B-f )
图3:局部注射的蛋白质保留率由大小和胶原亲和力调节。 a B16F10荷瘤小鼠瘤内注射后0、6、24和48h的典型同位素衰变和pvc校正的全身PET/CT三维强度投射 89 ZR标记融合蛋白lair-lair-msa H464Q ,巢穴 x -生活津贴 H464Q 巢穴 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q 、巢穴和巢穴 x 。CT图像(灰阶彩色条,Hounsfield单位)作为解剖学参考。宠物发射(红色-黄色标度从0-100%ID)对所有图像归一化为最大活动强度在时间0,以允许组间和组内比较。 b B16F10瘤在全身PET/CT面板三维投影中的应用 a 放大显示注射蛋白的局部分布。 c 注射后瘤内活性的定量研究 89 ZR标记的lair-lair-msa H464Q (平均+S.D.) n =5),巢穴-巢穴 x -生活津贴 H464Q (平均+S.D.) n =5),巢穴 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q (平均+S.D.) n =4),Lair(平均值+S.D.), n =4),或巢穴 x (平均+S.D.) n (4)校正PET图像。融合蛋白分子量(KD,千吨数)和亲和力( K d ,平衡离解常数)胶原Ⅰ型,测量在补充图。 12 ,显示在图例旁边。 d 模型预测的融合蛋白与体内测量的肿瘤暴露量的比较(平均±S.D.) n =4-5)。根据注射后一天内注射蛋白质时间曲线的肿瘤浓度,计算肿瘤暴露面积。面板 c , d 在源数据文件中提供。注射剂量,AUC面积曲线下。
对于15 kD的小蛋白质巢穴,瘤内滞留蛋白的减少速度更快。 t 1/2 =48分钟) x (t 1/2 =40分钟),与它们较大的95 kD等效亲和力对应的lair-lair相比 x -生活津贴 H464Q (t 1/2 =2.8 h)和Lair x -巢穴 x -生活津贴 H464Q (t 1/2 =2.5小时(见图)。 3C )。Lair-lair-msa H464Q 显示出最慢的肿瘤逃逸率( t 1/2 =7.9小时)。(无花果) 3C )。模型预测的肿瘤逃逸率与观察到的扩散逃逸相吻合。(补充图。 15A-c )。然而,该模型始终低估了它们对肿瘤的绝对暴露,这是因为所有注射的蛋白质中有一小部分持续存在于肿瘤中,甚至在实验终点也是如此。(无花果) 三维空间 和补充图。 16 )每个PET图像的最大强度投影显示持续蛋白定位于肿瘤边缘(补充图)。17 )。对注射肿瘤的定量分析显示,注射剂量的0.001%在细胞内残留,使我们相信非特异性蛋白质分解代谢的贡献是疏忽的。(补充图。 11B-E )。B16f10肿瘤的边缘富含基质,尤其是胶原蛋白。 29 然而,即使是惰性的巢穴 x 和巢穴 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q 在本地区累积(附图)。 17 )。该矩阵已被证明大大减缓了扩散。 30 对流 56 蛋白质,使它们被包裹。(无花果) 3B )。我们观察到包埋组分的大小与分子量和胶原结合有关。大型胶原结合蛋白 H464Q 和巢穴 x -生活津贴 H464Q 稳定期分别为滞留剂量的37.3%和33.0%(如图所示)。 3C )。大型惰性蛋白质巢穴 x -巢穴 x -生活津贴 H464Q 稳定在17.8%的滞留剂量(图)。 3C )。在小蛋白质中,11.1%的被扣留的巢穴能忍受,而只有7.5%的巢穴能忍受。 x (无花果) 3C )。我们的PET图像观察,验证了伽马计数器测量的切除器官(补充图)。 16 ),与以前的报告一致,即肿瘤内的蛋白质可能被包裹在粘性基质区域,而大蛋白比小蛋白质更容易被包封。 30 。然而,这种被低估的动态并没有被当前的模型重新描述。
大小对暴露的贡献大于对FN-EIIIB的亲和力 我们试图评估大小和结合亲和力的作用是否延伸到针对较少数量的IL-2融合蛋白(补充图)。 18A )肿瘤特异性基质蛋白。我们将IL-2融合到15 kD的纳米体NJB 2上,与肿瘤特异性糖蛋白FN-EIIIB(一种肿瘤特异性糖蛋白)的选择性剪接结构域B(EIIIB)结合,具有纳米分子亲和力。(补充图。 18B )57 ,58 为了产生惰性大小匹配的比较器,我们将IL-2与NJT 6融合,NJT 6是一种缺乏小鼠靶的纳米体。为了在保持亲和力的同时增加分子量,MSA H464Q 在纳米体和IL-2之间结合(补充图)。 18B )。32 kd小格式,njb2-l2和njt6-il2,98 kd大格式,njb2-msa。 H464Q -IL2和NJT6-MSA H464Q -IL2,在培养中相当于激活T细胞(补充图)。 18C ).
我们用TA 99和我们的IL-2纳米贴片治疗小鼠皮下B16F10皮下肿瘤。 4A )。与早期观察一致的是,大格式的IL-2比小格式的IL-2更能延缓肿瘤的生长.(无花果。 1g 和 4B,c )当比较等效亲和力结构时,增加分子量可提高总成活率:njb2-msa。 H464Q -IL2诉NJB2-IL2( p =0.003)和NJT6-MSA H464Q -IL2诉NJT 6-IL2( p =0.03)。然而,针对EIIIB的小格式NJB2-IL2的治疗效果比NJT6-IL2( p =0.05),而不是大格式的njb2-msa。 H464Q -IL2诉NJT 6-MSA H464Q -IL2( p =0.92)。与先前的观察一致,即尺寸的好处大于目标的利益,大的无目标的njt6-msa生存。 H464Q -IL2相同( p =0.13)小目标NJB2-IL2。局部注射EIIIB靶向IL-2融合蛋白的药代动力学,特别是其分子量,决定了其整体有效性.
图4:对于较少数量的目标EIIIB,尺寸对曝光的贡献大于目标结合亲和力。 a B16F10肿瘤免疫治疗研究时间表(上)和治疗成分(下)的原理图。小鼠接种1×10 6 第0天,B16F10细胞在右侧皮下。肿瘤植入后6天,按时间顺序开始治疗。( n =PBS的5只小鼠(i.tu.)和PBS(i.tu.)+TA 99(I.P.)团体,和 n =所有其他各组小鼠7只)。TAA肿瘤相关抗原。肿瘤内,I.P.腹腔内。 b , c 肿瘤随时间的增长(左,平均+S.D.)以及所述各组的存活(右)。每组的肿瘤面积显示,直到该组的小鼠因肿瘤负担而被安乐死。用单尾学生法计算各组肿瘤面积(右上角显示)的统计学意义。 t -测试相对于PBS(i.tu.)+TA 99(I.P.)各组于第11天进行比较,采用对数秩Mantel-Cox检验法计算各组的生存率。* P < 0.03; **P < 0.002; ***P < 0.0002; ****P < 0.0001; n.s. not significant. Source data for panel b , c 在源数据文件中提供。面板 a 是由BioRender.com创建的。