GPR 182在人黑色素瘤淋巴管内皮细胞(LECs)上表达上调
为了确定gpr 182在黑色素瘤中的表达，我们从最近两项有关黑色素瘤的研究中询问了单细胞表达数据。25,26。我们发现GPR 182的表达仅限于两个数据集中的ECs。1A)。对EC人群的详细分析表明，GPR 182完全在淋巴ECs(LECs)中表达(见图)。1B)。我们通过免疫荧光染色进一步研究了GPR 182蛋白在人黑色素瘤中的表达。我们观察到，只有一小部分弱CD 31+血管在TME中是阳性的GPR 182(图1)。1C、上面板)。GPR 182和podoplanin(PDPN)的连续切片共染色证实GPR 182在人黑色素瘤的PDPN+淋巴管中完全表达。1C、中间面板)。GPR 182蛋白与另一种主要在人LECs中表达的蛋白Prox-1共同表达。1C，下面板)27。在人乳腺癌中，我们还发现GPR 182的表达仅限于PDPN+LECs(补充图)。1A)。探讨淋巴管内皮细胞与淋巴管内皮细胞表达的关系GPR 182在更大范围的黑色素瘤肿瘤样本中，我们从肿瘤基因组图谱(TCGA)中询问了288例转移性黑色素瘤样本。我们根据黑色素瘤的相对表达水平，对黑色素瘤样本进行淋巴评分。PDPN, LYVE 1，和VEGFC28，发现GPR 182黑色素瘤的表达与淋巴管评分显著相关(图1)。1D).
图1：人黑色素瘤淋巴管内皮细胞表达GPR 182。a, b本文根据人黑色素瘤的细胞类型，对两组已发表的单细胞RNA测序数据进行了GPR 182表达的查询。a). b对人黑色素瘤中ECs的分析进一步揭示，GPR 182主要在LECs中表达。c对人黑色素瘤组织进行GPR 182(绿色)染色和EC标记，包括CD 31、podoplanin(PDPN)或Prox-1。d从TCGA数据库中提取288例转移性黑色素瘤样本，获得淋巴评分。的相对表达水平计算淋巴管评分。PDPN, LYVE 1，和VEGFC在每个样本中。根据GPR 182 mRNA表达水平(RSEM，log2归一化)绘制淋巴评分图。皮尔逊相关系数r，和p-双面测试所显示的数值。e, f对正常皮肤正常人黑色素瘤组织进行PDPN(红色)、CD 31(蓝色)、GPR 182(绿色)染色，S-100染色(棕色)鉴定黑色素细胞和肿瘤细胞。f成对肿瘤及癌旁正常组织PDPN+淋巴管GPR 182中位荧光强度(MFI)的定量研究n=15，P-双面配对的值t-测试。误差条表示扫描电镜。
为了比较GPR 182在黑色素瘤相关LECs和正常皮肤中的表达，我们对II/III期黑色素瘤患者的原发肿瘤组织进行了多重染色。我们观察到肿瘤内PDPN阳性淋巴管有较强的GPR 182染色，而癌旁正常皮肤淋巴管中GPR 182的表达较弱或阴性。1E)。在正常人皮肤中，GPR 182在LECs(补充图)中检测不到。1B)。为了量化GPR 182在淋巴管上的表达，我们测定了GPR 182在PDPN+淋巴管上的平均荧光强度(MFI)，我们观察到GPR 182在黑色素瘤相关淋巴管中的表达明显高于邻近正常皮肤上的淋巴管(图1)。1F).
损失GPR 182触发器提高抗肿瘤免疫延缓肿瘤进展
为了研究GPR 182是否影响肿瘤的生长，我们获得了GPR 182Tm2q(KOMP)WTSI/+ (GPR 182LacZ/+)鼠标(以下称为GPR 182+/−鼠标)，来自Knockout鼠标项目(KOMP)存储库，并通过反向杂交实现纯合子。GPR 182LacZ/LacZ(以下简称GPR 182−/−)小鼠，由Kechele等人描述。22。首先，我们用免疫荧光染色法检测了小鼠GPR 182在B16、YUMM1.7和YUMMER 1.7小鼠黑色素瘤模型中的表达。与人GPR 182相似，小鼠GPR 182在RIV-1阳性LECs上的表达是有限的，但在肿瘤相关LECs中表达较强，LECs似乎是GPR 182在肿瘤中的主要来源(补充图)。1C)。我们接种GPR 182−/−、GPR 182+/−和野生型黑色素瘤(WT)皮下接种B16黑色素瘤并监测肿瘤的进展。GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长速度明显低于WT和GPR 182+/−小鼠。2A结果，GPR 182−/−小鼠在研究终点的肿瘤体积比WT小鼠减少3倍，与GPR 182+/−小鼠相比减少2倍(图1)。2B)。GPR 182−/−小鼠皮下接种YUMM1.7小鼠黑色素瘤后，肿瘤生长也比WT小鼠慢。2C，d)。由于B16和YUMM1.7肿瘤的免疫原性较差，我们用免疫原性更强的YUMMER 1.7细胞攻击小鼠。29。GPR 182−/−小鼠与WT对照组相比，YUMMER 1.7的生长明显减弱，使GPR 182−/−组在接种肿瘤后14d的肿瘤体积减少4倍(图1)。2E)。结果表明，GPR 182−/−小鼠的整体生存期明显长于WT对照组，11只GPR 182−/−小鼠中有3只达到完全肿瘤消退(图1)。2F)。表现出完全肿瘤消退的GPR 182−/−小鼠获得了免疫记忆，因为它们对YUMMER1.7的再次攻击具有免疫记忆能力，并且接种了更大的肿瘤疫苗(如图所示)。2G).
图2：GPR 182−/−小鼠抗肿瘤免疫增强。a, bGPR 182−/−和小白蚁皮下接种20万个B16肿瘤细胞。肿瘤生长曲线(a肿瘤接种后14天(肿瘤接种后14天)和肿瘤肿块(b)记录。n每组分别为11、12和9。两个独立实验的代表性数据。c, dWt和GPR 182−/−小鼠皮下接种50,000只YUMM1.7肿瘤细胞。肿瘤生长曲线(c肿瘤接种后16天(肿瘤接种后16天)和肿瘤肿块(d)记录。n=每组9-10人。三个独立实验的代表性数据。e–g肿瘤生长曲线(e)和Kaplan-Meier曲线(f)−/−小鼠皮下接种250,000只YUMMER1.7肿瘤细胞，以提高WT和GPR 182小鼠的存活率。n=每组10-11。两个独立实验的代表性数据。无瘤GPR 182−/−小鼠(n5)在肿瘤被完全排斥后一个月用YUMMER 1.7进行攻击；朴素的GPR 182−/−小鼠(n=8)作为比较(g). hT细胞耗竭对WT和GPR 182−/−小鼠B16肿瘤生长曲线的影响。T细胞耗竭组在接种肿瘤前1天和接种肿瘤后第7天分别给予αCD4和αCD8耗竭抗体治疗。n=每组10人。iYUMM1.7 T细胞耗竭对WT和GPR 82−/−小鼠肿瘤生长曲线的影响。T细胞耗竭组在接种肿瘤前1天和接种肿瘤后第7天分别给予αCD4和αCD8耗竭抗体治疗。n=每组10人。P-双向方差分析的生长曲线值(a, c, e, h, i). P-单因素方差分析肿瘤肿块的数值，并作多次比较(b)和双面学生的t-测试(d). P-木秩检验的Kaplan-Meier曲线值(f)。误差条表示扫描电镜。
为了探讨GPR 182−/−小鼠肿瘤生长减弱是否是由于抗肿瘤T细胞反应增强所致，我们在GPR 182−/−和WT小鼠腹腔注射抗CD4和抗CD8β消耗型单克隆抗体，使CD4+和CD8+T细胞减少。外周血免疫细胞流式细胞仪染色证实T细胞耗竭(附图)。2A)。如图所示。2H和iB16和YUMM1.7肿瘤模型中T细胞的去除逆转了GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长抑制。
为了全面研究肿瘤内免疫细胞，我们解剖了YUMM1.7肿瘤组织，并进行了流式细胞术分析(附图)。2B, c)。YUMM1.7来自GPR 182−/−小鼠的肿瘤在比例和密度上均明显增加CD 45+免疫细胞和CD3+T细胞。3一个,b，以及附图。3A)；除了少数多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSC)(附图)。3B非T细胞群体，包括自然杀伤(NK)细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)、树突状细胞(DC)或总MDSC(图1)均无显着性差异。3B)。我们对YUMM1.7肿瘤组织和GPR 182−/−宿主的免疫荧光染色证实了CD3+T细胞在GPR 182−/−小鼠肿瘤中的浸润。3C)。B16肿瘤中免疫细胞浸润的特征反映了YUMM1.7模型中CD3+T细胞在GPR 182−/−肿瘤中的选择性增加(图1)。三维空间，补充图。3C).
图3：GPR 182−/−小鼠肿瘤T细胞浸润及功能增强。a, b肿瘤接种后16d，对YUMM1.7荷瘤小鼠和GPR 182−/−小鼠的免疫TME进行了表征。用单细胞悬液对免疫细胞(CD 45+)进行染色，并进一步测定T细胞和NK细胞的浸润百分率(P<0.0 5)。a)。用流式细胞仪测定肿瘤内不同免疫细胞类型的密度。b). n分别为每组10人和9人。来自两个独立实验的数据代表。c, dYUMM1.7细胞CD3+T细胞的代表免疫荧光染色c)和B16(d)WT和GPR 182−/−小鼠的肿瘤。每高功率场(HPF)计数CD3+T细胞密度。YUMM 1.7，n=每组10人。B16，n分别为每组8例和7例。来自两个独立实验的数据代表。e–kYUMM1.7肿瘤接种后16d，CD8+密度(e)和CD4+T细胞(f)，以及干扰素γ-(g)或颗粒酶B(GzmB)(h)产生CD8+T细胞。效应细胞(CD 44)的频率高CD62L-)在CD8+和CD4+T细胞中(i)，CD8+T细胞同时表达PD1和4-1BB(j)，以及FoxP 3+Treg细胞(k)，已量化。e–i n=每组9例和10例；k n=每组5人。来自两个独立实验的数据代表。P-双面学生的价值观t-测试(a–k)。误差条表示扫描电镜。
我们进一步研究了GPR 182−/−小鼠YUMM1.7肿瘤中浸润的T细胞。GPR 182−/−小鼠肿瘤中CD8+T细胞和Foxp 3阴性常规CD4+T细胞密度均增加(图1)。3E，f)。GPR 182−/−小鼠的肿瘤也含有更多的CD8+T细胞，产生效应细胞因子IFN-γ。第三代)和颗粒酶B(GzmB)。3H)，指示一个改进的效应T细胞功能。GPR 182−/−小鼠的YUMM1.7肿瘤在CD4+和CD8+T细胞中均有较高的效应T细胞频率(CD 44+CD62L−)。3I)。此外，GPR 182−/−肿瘤中CD8+T细胞表达PD1和4-1BB的比例高于WT对照组(图1)。3J)。在GPR 182−/−肿瘤中，Foxp 3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例下降(图1)。3K)。提示GPR 182−/−宿主肿瘤内T细胞增多主要是由于效应T细胞增多所致。在GPR 182−/−小鼠的B16肿瘤中，常规CD8+和CD4+T细胞均有明显增加(附图)。三维空间T细胞具有效应表型(附图)。3E)和PD1-表达的T细胞(补充图)。3F)GPR 182−/−肿瘤CD8+和CD4+T细胞亚群均呈比例增高。在肿瘤幼稚小鼠中，WT和GPR 182−/−小鼠正常皮肤的CD3+T细胞密度也同样缺乏(附图)。第三代提示GPR 182−/−小鼠肿瘤T细胞浸润增加并不是由于皮肤内存在T细胞所致。
天真GPR 182−/−小鼠的免疫表型
在GPR 182−/−小鼠肿瘤中观察到的抗肿瘤T细胞反应增加，导致我们在天真的GPR 182−/−小鼠中检测T细胞。与以前的报告相似20,22我们观察到成年GPR 182−/−小鼠脾脏质量增加(附图)。4A, b)，可能是由于GPR 182在造血中的负面作用。30。用流式细胞仪分析脾细胞组成，观察WT和GPR 182−/−小鼠CD3+T细胞、CD 19+B细胞和CD 45阴性基质细胞百分率的变化。同样，我们观察到两组淋巴结的细胞组成没有差异(补充图)。4C)。我们进一步研究了WT和GPR 182−/−小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的表型。天真的比例没有差别(CD 44)。低层CD62L+)，中央存储器(CD 44)高CD62L+)和效应器存储器(CD 44)高CD62L−)在10周龄WT和GPR 182−/−小鼠之间的群体(补充图)。4D, 4E)。然后，我们从淋巴结中分离T细胞，用细胞增殖追踪染料(CFSE)标记，然后用平板结合抗CD3单抗体外刺激。我们没有观察到WT小白鼠和GPR 182−/−小鼠在CD4+的增殖方面有任何明显的差异(补充图)。4F和4G)或CD8+T细胞(补充图)。4h，4I)不同浓度的抗CD3。因此，我们的研究支持GPR 182的缺失并不直接影响肿瘤天真小鼠的T细胞功能。
GPR 182−/−小鼠T细胞归巢增加
为了确定GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长下降是否由造血细胞或非造血基质细胞中GPR 182的丢失所介导，我们进行了骨髓嵌合体实验，其中GPR 182−/−和WT对照组在重建GPR 182−/−或WT供体小鼠的BM细胞之前进行了致死照射，共产生4组(图1)。4A)。12周后，当免疫系统完全建立时，嵌合小鼠被皮下注射B16黑色素瘤。用GPR 182−/−BM重组的WT小鼠肿瘤生长曲线与对照组相似。用WT或GPR 182−/−BM细胞重组的GPR 182−/−小鼠与WT或GPR 182−/−BM细胞重组的WT小鼠相比，肿瘤生长同样受到抑制。4B)。两组GPR 182−/−宿主小鼠与WT宿主小鼠相比，总体存活率也有所提高(图1)。4C)。因此，GPR 182在基质细胞中的丢失可能是GPR 182−/−小鼠肿瘤生长减弱的主要机制。
图4：改进的归巢，而不是启动，有助于TIL在GPR 182−/−小鼠体内的积累。a–cGPR 182−/−骨髓嵌合体产生原理图(a)。肿瘤生长曲线(b)和Kaplan-Meier曲线(c)嵌合体小鼠皮下接种B16肿瘤细胞。两个独立实验的汇总数据。WT到WT，n=10；GPR 182−/−到WT，n=7；WT至GPR 182−/−，n=8；GPR 182−/−至GPR 182−/−，n=10。d–hDLN T细胞启动原理图(d)。将分化的OT-1细胞移植到荷B16-OVA肿瘤的小鼠体内72h后进行定量。n=7；GPR 182−/−，n=5)(e). f–h肿瘤接种10d后，从肿瘤DLN中制备单细胞悬液.CD 103+DC(f)和H2Kb/OVA257–264CD 103+DC人群中的阳性细胞(g)流式细胞仪定量。用DLN细胞悬液刺激CFSE标记的幼稚OT-1细胞，共培养3d后分裂OT-1细胞。n=每组4人(h)。两个独立实验的代表性数据。i, j预先激活的OT-1细胞转移原理图(i)。转移后24h测定肿瘤转移的OT-1细胞频率(P<0.0 5)。j). n=每组4和5，代表两个独立实验的数据。k–n预先激活的OT-1细胞归巢原理图(k)。转移的OT-1T细胞(CD45.1+CD8+)和BrdU染色的典型流式细胞仪分析(英文)l)。转移后3d，转移的OT-1细胞(CD45.1+CD8+)的频率(CD45.1+CD8+)。m)和BrdU+OT-1细胞(n)对WT和GPR 182−/−小鼠的肿瘤和淋巴结进行定量分析。n=每组5人。两个独立实验的代表性数据。P双面学生的价值观t-测试(e–n)。误差条表示扫描电镜。
淋巴系统在抗原传递、抗原呈递和T细胞启动的协调中起着至关重要的作用。30,31。因此，我们评价了GPR 182对淋巴引流功能和T细胞启动的可能影响。足垫法测定FITC-右旋糖酐的可溶淋巴输送量表明，WT和GPR 182−/−小鼠的淋巴引流无明显差异(补充图)。4J)。为了评估T细胞的启动情况，我们将B16-OVA肿瘤接种在高肿瘤负荷下，我们观察到WT和GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长没有差异。肿瘤生长10天后，将单纯CFSE标记的OT-1T细胞(CD45.1+)转入B16-OVA荷瘤小鼠，检测肿瘤特异性T细胞启动反应(图一)。4D)。我们观察到肿瘤引流淋巴结(DLN)中CD45.1+OT-1细胞在WT和GPR 182−/−小鼠中的分化百分率无明显差异(图1)。4E)。此外，CD 103+DC在肿瘤DLNs中的表达频率无明显差异(图1)。4F)或在CD 103+dc交叉递呈mhcⅠ级(H-2K)的频率。b)约束OVA257-264(SIINFEKL)在肿瘤DLNs中的表达(图1)。4G)。从B16-OVA荷瘤小鼠的DLN中制备单细胞悬液，并与单纯CFSE标记的CD45.1+OT-1细胞体外共培养。体外共培养72h后，WT组与GPR 182−/−组在刺激DLN细胞时，OT-1细胞增殖无明显差异(图二)。4H)。这些数据表明，GPR 182的缺失对肿瘤DLN中的抗原转运或T细胞启动没有影响。
为评价活化T细胞在肿瘤中的归巢作用，将体外活化的CD45.1+OT-1 T细胞经静脉转移到具有大小匹配的B16-OVA肿瘤的WT和GPR 182−/−小鼠体内。OT--1转染24h后，流式细胞仪检测瘤内OT-1细胞数量。GPR 182−/−小鼠瘤内OT-1 T细胞密度高于WT对照组(图1)。4我，j)。为了进一步确定活化的OT-1细胞密度的增加是否仅仅是由于GPR 182−/−小鼠肿瘤归巢的改善，我们在组织收获前用BrdU对T细胞分裂进行了跟踪，并进行了流式细胞分析(图一)。4k，l)。GPR 182−/−小鼠瘤内OT-1细胞密度再次高于WT对照组，但肿瘤DLN中OT-1细胞的频率相似(图1)。4m)。用BrdU掺入法测定了WT和GPR 182−/−小鼠在肿瘤和肿瘤DLN中的增殖率。4N)。这些数据表明，T细胞向肿瘤归巢的增加，而不是T细胞启动或增殖的改善，是GPR 182−/−小鼠肿瘤T细胞密度增加的原因。
CXCR 3通路上调对GPR 182−/−小鼠肿瘤生长的抑制作用
通过与免疫细胞上表达的趋化因子受体的相互作用，趋化因子是免疫细胞归巢的主要驱动力。14。GPR 182是一个与ACKR 3同源的孤儿GPCR受体。5A)。与其他已知的ACKR类似，GPR 182没有一个保守的DRYLAIV基序(补充图)。5B主要由基质细胞表达，尤其是黑色素瘤中的LECs。1和补充图。5C)。我们假设GPR 182可能作为一种Ackr来调节TME中趋化因子的生物利用度。32。我们从WT和GPR 182−/−小鼠中摘取YUMM1.7肿瘤，用LEGENDplex小鼠趋化因子板(BioLegend)测量肿瘤内13种趋化因子的浓度。GPR 182−/−小鼠肿瘤中CCL 2、CCL 22、CXCL 1、CXCL 9和CXCL 10等多种趋化因子显著增加(图1)。5A).
图5：CXCR 3通路介导GPR 182−/−小鼠TIL浸润增加。a–c肿瘤接种后16d，分别在WT和GPR 182−/−小鼠体内采集YUMM1.7肿瘤进行分析。用LEGENDplex促炎趋化因子片(LEGENDPLE)测定YUMM1.7肿瘤瘤内趋化因子浓度(a)。WT，n=6；GPR 182−/−，n=8.CD8+细胞中CXCR 3-和CXCR 3+细胞密度b)和CD4+(c)流式细胞仪检测YUMM1.7肿瘤中T细胞的表达。WT，n=7，GPR 182−/−，n=9.两个独立实验的代表性数据。d–f接种50,000 YUMM1.7肿瘤细胞后，接种CXCR 3单克隆抗体(CXCR 3)后，WT和GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长曲线(d)。流式细胞术定量测定CD8+(e)和CD4+T细胞(f)荷瘤后16d，WT和GPR 182−/−小鼠的密度。n=每组10人。两个独立实验的代表性数据。P-双面学生的价值观t-测试(a)，具有Bonferonni校正的单向方差，用于多个比较(b, c, e, f)和双向方差分析(d)。误差条表示扫描电镜。
趋化因子CXCL 9和CXCL 10通过与受体CXCR 3的相互作用，被认为是黑色素瘤活化T细胞归巢的载体。33,34。在我们的小鼠肿瘤模型中，C57BL/6小鼠缺乏CXCR 3的第三配体功能CXCL 11。35。GPR 182−/−小鼠YUMM1.7肿瘤中CD8+和CD4+T细胞亚群中CXCR 3阳性细胞均有选择性增加(图一)。5b，c)。为了进一步评价GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长减弱和T细胞密度增加是否依赖于CXCR 3通路，我们在YUMM1.7肿瘤接种过程中用CXCR 3阻断单抗治疗小鼠。抗CXCR 3治疗完全抑制了GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长，提示GPR 182−/−小鼠抗肿瘤免疫的改善与CXCL 9/CXCL 10/CXCR 3轴有关(图1)。5D)。对WT和GPR 182−/−小鼠TIL的分析进一步表明，抗CXCR 3治疗明显减少了YUMM1.7肿瘤的T细胞浸润，从而使GPR 182−/−小鼠瘤内T细胞密度的增加完全被抗CXCR 3所阻断。5E和f).
GPR 182作为CXCR 3配体的Ackr
为了直接检验GPR 182是否作为Ackr，我们首先分析了标记的人CXCL 9(hCXCL 9-标志)与稳定表达人GPR 182(GPR 182+CHO)的CHO细胞之间的表面结合。在4℃孵育30 min后，hCXCL 9-标志与GPR 182+CHO细胞强结合，而非WT CHO细胞，这种相互作用可被过量无标记的人CXCL 9孵育细胞所阻断。6A)。滴度未标记的CXCL 9竞争试验进一步揭示KdCXCL 9为1.33×10−6(M)IC 50为3.03×10−6(M)(如图所示)。6B)。小鼠CXCL 9蛋白能瞬时表达小鼠GPR 182的HEK293T细胞，证明这种相互作用在小鼠体内是保守的。6C)。我们间接地评估了GPR 182是否也能与另外两个CXCR 3配体CXCL 10和CXCL 11结合。滴定的CXCL 10或CXCL 11的包涵体能与CXCL 9竞争GPR 182+CHO细胞的结合。6d)，IC 50为1.47×10。−7(M)和6.87×10−7(M)分别。这间接表明GPR 182与CXCR 3的另外两个趋化因子配体相互作用。有趣的是，GPR 182与ACKR 3具有最接近的同源性，而ACKR 3恰好与CXCL 11交互。36，CXCR 3的另一种趋化因子配体。
图6：GPR 182结合和内吞趋化因子CXCR 3配体。a, b将稳定转染人GPR 182(GPR 182+CHO)的WT CHO细胞和CHO细胞在4°处与人CXCL 9标记结合。细胞与纯化的人CXCL 9进行预孵育，以评估其阻断能力。a)。用不同浓度的未标记CXCL 9对IC 50和KD(b). n=3个复制样本。来自至少三个独立实验的代表性数据。c转染小鼠GPR 182的WT 293 T细胞和293 T细胞在4度处与CXCL 9标记结合。n=3.两个独立实验的代表性数据。d对GPR 182+CHO细胞进行4度hCXCL 9-AF 488染色。用不同浓度的CXCL 10或CXCL 11预孵育细胞，评价其阻断能力。n=3个复制样本。两个独立实验的代表性数据。e, f用CXCL 9-AF 488 37℃孵育20 min后，用麦胚凝集素(WGA)对WT和GPR 182+CHO细胞进行固定和共染色。共聚焦显微镜观察CXCL9-AF488与WT或GPR 182+CHO细胞共同作用后的变化。n=每组10人(e)。用共聚焦显微镜测定了GPR 182在CXCL 9孵育前后的位置。f)。两个独立实验的代表性数据。g–j将WT和GPR 182+293 T细胞与CXCL 9共孵育20 min，37℃，固定染色，观察GPR 182和clathrin HC(g)，卡韦林-1(h)，EEA 1(i)，或LAMP 1(j)在共聚焦显微镜前。两个独立实验的代表性数据。P-双面配对的值t-测试(e)。误差条表示扫描电镜。
众所周知，ACKRs通过受体结合将趋化因子内化。37,38,39,40,41。在原代人LECs中，我们发现GPR 182蛋白主要存在于细胞内(补充图)。5D)。DMO治疗LECs可显著上调GPR 182的表达，支持缺氧可诱导GPR 182的发生。42。将人LECs与GPR182mAb在37°C孵育1h后，可检测到GPR 182抗体内吞(附图)。5E)。我们无法通过原代LECs检测到CXCL 9内吞，这可能是由于GPR 182的低表达和弱相互作用所致。因此，我们使用GPR 182+CHO转染物来评价GPR 182介导趋化因子配体内化的能力。用AF 488标记的CXCL 9在37°C下孵育WT和GPR 182+CHO细胞20 min。用共聚焦显微镜观察CHO细胞时，GPR 182+CHO细胞内有AF488-CXCL 9，而WT CHO细胞中未检出AF488-CXCL 9。6E)。同时，表面GPR 182在与人CXCL 9孵育后内化。6f)。提示GPR 182与CXCL 9相互作用，内源细胞相互作用。我们进一步将GPR 182与内吞、内小体和溶酶体的标记一起染色，以确定CXCL 9孵育后GPR 182的细胞内命运。细胞内GPR 182与clathrin、EEA 1和LAMP 1共定位，而与空洞蛋白1无共定位(图1)。6G-j)。这表明GPR 182在与早期EEA 1阳性的内小体和LAMP 1阳性溶酶体的结合和交通过程中经历了clathrin介导的内吞作用。43。人黑色素瘤中巨噬细胞和DC表达的CXCL 910,44，主要存在于淋巴GPR 182所在的瘤周间质(补充图)。5F)。这种紧密的空间关系支持了GPR 182清除TME中CXCL 9的可能性。一贯地，在小鼠黑色素瘤模型中，GPR 182表达的LECs主要存在于肿瘤周围，肿瘤内CD3+T细胞主要定位于肿瘤周围(补充图)。5G)。综上所述，我们的研究表明，GPR 182是一种Ackr，可以清除CXCR 3的趋化因子配体，并将它们作为细胞内降解的靶点。
GPR 182通过gag结合基序与趋化因子杂乱地相互作用。
ACKRs经常与多种趋化因子相互作用。13,45。通过竞争结合实验，我们进一步分析了35个人趋化因子组阻断GPR 182与CXCL 9相互作用的能力。所有4个亚类(CCL、CXCL、CX3CL和XCL)的趋化因子均能不同程度地阻断CXCL9-AF 488与GPR 182+CHO细胞的相互作用，提示GPR 182与趋化因子有不同程度的结合。7A)。因为已知趋化因子具有连接内皮细胞的gag结合基序。7我们假设GPR 182是gag结合基序的模式识别受体.GPR 182+CHO细胞与人CXCL 9 C末端gag结合肽的预孵育(69-93)46完全阻断了GPR 182和CXCL 9之间的相互作用。7b)。当我们合成两个由gag结合基序重复序列组成的gAG结合肽[(ARKKAAKA)]时3和(阿克卡拉)4]47这两种多肽均能明显破坏CXCL 9与GPR 182+CHO细胞的结合。7C)。因此，GPR 182可能与广泛的gag结合蛋白结合.
图7：gpr 182通过gag结合基序随意结合趋化因子.a用hCXCL9-AF488研究了35个人趋化因子对GPR 182+CHO细胞的阻断作用。所有趋化因子均显示%阻滞，黑条(>90%阻塞)、暗灰色(80%-90%阻塞)和轻度灰暗(<80%阻塞)的趋化因子表现较强。两个独立实验的代表性数据。bHCXCL9-AF 488与WT和GPR 182+CHO细胞呈4度结合。将细胞与CXCL 9(CXCL 9，69-93)的25-AA肽(CXCL 9，69-93)共同孵育，评价其阻断能力。来自至少三个独立实验的代表性数据。c用CXCL9-AF488研究了两种合成的GAG结合肽对GPR 182+CHO细胞的阻断作用。两个独立实验的代表性数据。
与CXCR 3相比，我们进一步评估了GPR 182触发的信号通路。刺激CXCL 11，最强的CXCR 3激动剂48我们观察到CXCR 3+CHO细胞有较强的钙通量，而GPR 182+细胞则无明显的钙通量(附图)。5H)。Westernblot分析表明，CXCL 11处理可引起CXCR 3+CHO细胞ERK磷酸化，而不触发GPR 182表达细胞(附图)。5I)。除了典型的G蛋白介导的信号传递外，gpRs还通过不同的方式招募β-arrestin来协调它们的信号传递。49。我们采用了纳米发酵酶二元(Nanobit)技术。50探讨β-arrestin与GPR 182的关系.在此系统中，我们构建了GPR 182和CXCR 3融合到小的11-AA互补肽(SmBiT)N端的表达结构，同时在互补的大比特蛋白(LgBiT)的C端加入了β-ARD 2。这两种GPCRs与β-READ 2之间的联系将导致荧光素酶的激活(补充图)。5J，左)。我们在HEK293T细胞中观察到一个强的发光信号，共转染GPR 182和β-ARSTIN 2，证明GPR 182与β-arrestin(补充图)有着内在的联系。5J，右)。这些数据表明gpr 182并不触发经典的G蛋白信号，而是与β-arrestin有关，这与最近的一篇文章一致。51.
GPR 182消融术使免疫冷黑色素瘤对免疫治疗敏感
YUMM1.7肿瘤是一种免疫原性差的小鼠黑色素瘤细胞系，对ICB治疗具有耐药性。29,52。考虑到GPR 182−/−小鼠YUMM1.7肿瘤中T细胞浸润和功能的增加，我们推测GPR 182消融将使YUMM 1.7对ICB敏感。肿瘤接种后第8天，采用抗CTLA 4和抗PD1抗体双重ICB治疗小鼠。我们观察到双ICB治疗未显著降低YUMM1.7荷瘤小鼠的肿瘤生长或整体存活，与以往观察结果一致。29。然而，GPR 182−/−小鼠在ICB治疗后肿瘤生长明显下降(如图所示)。8A结果，ICB进一步延长了GPR 182−/−小鼠的整体存活时间(如图所示)。8B)。此外，B16肿瘤是另一种免疫寒冷的小鼠黑色素瘤，在GPR 182−/−小鼠中表现出对单剂抗PD1的反应增强(如图所示)。8C)。在WT小鼠中，单用抗PD1治疗对B16肿瘤的进展无影响，而GPR 182−/−小鼠的抗PD1治疗能显著减缓肿瘤的生长(图一)。8C).
图8：GPR 182消融使肿瘤对免疫治疗敏感。a, bWt和GPR 182−/−小鼠接种50,000只YUMM1.7肿瘤细胞，分别接种抗CTLA-4和抗PD1或载体对照(箭头表示抗CTLA-4和抗PD1)。肿瘤生长a)和Kaplan-Meier生存(b)YUMM1.7的曲线。WT，n=10；WT(ICB)，n=10；GPR 182−/−，n=8；GPR 182−/−，n=10。cWt和GPR 182−/−小鼠在建立肿瘤后，接种B16肿瘤，经抗PD1或对照处理后的肿瘤生长曲线(箭头表示抗PD1治疗)。n=每组10人。dWT和GPR 182−/−小鼠为S.C。接种50万只B16-OVA肿瘤细胞，第6天，半数小鼠接受腹腔注射。活化的OT-1细胞的转移。每日随访B16-OVA肿瘤生长曲线。n=每组10人。两个独立实验的代表性数据。e一个方案描述了GPR 182如何发挥趋化因子清除剂的作用，抑制抗肿瘤免疫。P-双向方差分析的生长曲线值(a, c, d). P-学生对肿瘤肿块的价值t-测试。P-对数秩检验的Kaplan-Meier曲线的值，双面(b)。误差条表示扫描电镜。
我们进一步评价了过继T细胞治疗GPR 182−/−小鼠的疗效。Wt和GPR 182−/−小鼠接种B16-OVA肿瘤，两组肿瘤生长相似。肿瘤植入后，小鼠在接种肿瘤后第6天接受500万体外激活的OT-1细胞的静脉转移。单用OT-1细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对WT小鼠的肿瘤生长无明显抑制作用，而接受相同数量OT-1CTL的GPR 182−/−小鼠则表现出明显的肿瘤生长抑制作用(图一)。8D)。综上所述，我们的数据表明，GPR 182发挥趋化因子清除剂的作用，限制效应T细胞在TME中的浸润(如图所示)。8E)，GPR 182消融提高了对ICB治疗的反应性，提高了ACT治疗低免疫原性肿瘤的疗效。
