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GPR 182通过清除趋化因子对小鼠黑色素瘤模型抗肿瘤免疫的影响

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发表时间:2022-01-17 14:32作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

对于许多实体肿瘤,免疫检查点阻断治疗已成为一线治疗方法,但由于肿瘤浸润性淋巴细胞的缺乏,免疫冷肿瘤患者中仍有很大比例的患者无法受益。在这里,我们证明孤儿G蛋白偶联受体182(GPR 182)通过清除对肿瘤淋巴细胞吸收重要的趋化因子而促进肿瘤免疫治疗的耐药。GPR 182主要在黑色素瘤相关淋巴管内皮细胞(LECs)中被上调,而这种非典型的趋化因子受体内含子趋化因子(趋化因子)是杂乱无章的。在GPR 182缺乏的小鼠中,T细胞浸润到移植性黑色素瘤中增加,从而增强了效应T细胞功能,提高了抗肿瘤免疫能力。GPR 182的消融会增加肿瘤内多种趋化因子的浓度,从而使免疫原性差的肿瘤对免疫检查点阻断和过继细胞治疗敏感。CXCR 3阻断逆转GPR 182缺乏小鼠的抗肿瘤免疫和T细胞浸润特性。因此,我们的研究确认GPR 182是CXCL 9/CXCL 10/CXCR 3轴的上游调节因子,限制了抗肿瘤免疫,是免疫寒冷肿瘤的潜在治疗靶点。

导言

免疫检查点阻断(Icb)治疗极大地提高了许多晚期黑色素瘤患者的生存率;然而,晚期黑色素瘤患者的客观反应率仍低于40%。1,2,3。对ICB治疗产生耐药性的主要原因之一是许多黑色素瘤肿瘤免疫寒冷,缺乏有效T细胞浸润到肿瘤微环境(TME)。4。与此相一致的是,黑色素瘤内CD8+效应T细胞密度可预测抗PD1治疗的反应性。5。为了提高对ICB治疗的反应率,需要新的治疗靶点来改善CD8+T细胞对TME的浸润。

趋化因子及其受体在抗肿瘤免疫中起着至关重要的作用,因为它们调节免疫细胞向肿瘤的归巢。6。通过附着在内皮细胞(ECs)和细胞外基质(ECM)上的糖胺聚糖(Gags),肿瘤部位产生的趋化因子会产生梯度,引导T细胞进入肿瘤。7。其中,CXCR 3及其配体CXCL 9、CXCL 10和CXCL 11在调节效应T细胞浸润肿瘤中起核心作用,是有效治疗ICB的关键。8,9,10。效应细胞CD8+T细胞上调CXCR 3并迁移到TME中,以其同源配体的梯度为主,主要由肿瘤内的CD 103+树突状细胞(DC)和巨噬细胞产生。肿瘤内CD8+T细胞产生的干扰素-γ可进一步诱导cxcl 9-11的表达。9,10。在人类癌症中,CXCR 3配体的表达水平与浸润CD8+T细胞的数量和提高癌症患者的生存率呈正相关。11,12.

非典型趋化因子受体(ACKRs)是一组GPCRs,起清除作用,抑制组织趋化因子水平。13,14。与白细胞上存在的趋化因子受体不同,所有已知的ACKRs都是由ECs和其他基质细胞类型表达的。ACKRs在DRYLAIV基序上有突变,这是G蛋白偶联和经典GPCR信号传递所必需的。15,16。ACKRs功能清除多种趋化因子配体,形成细胞外空间的趋化因子梯度,并通过β-arrestin信号。15,16。最近的一份出版物发现,ACKR 4的丢失增加了瘤内CCL 21,从而促进了CD 103+DC的迁移,从而提高了抗肿瘤免疫。17支持ACKRs是提高免疫治疗反应性的可行治疗靶点。

G蛋白偶联受体182(GPR 182)(又名ADMR)是一个与趋化因子受体家族同源的孤儿A类GPCR。18。GPR 182在血管内皮细胞、肝窦内皮细胞、肝血管内皮细胞和肠干细胞中均有优先表达。19,20,21,22。据报道gpr182转录本在肿瘤相关细胞中被上调。23,24然而,GPR 182的功能描述仍然很差。

本研究探讨GPR 182在抗肿瘤免疫应答中的作用。我们在小鼠黑色素瘤模型上的研究支持GPR 182在TME中发挥Ackr的作用,清除趋化因子以限制T细胞浸润。

结果

GPR 182在人黑色素瘤淋巴管内皮细胞(LECs)上表达上调

为了确定gpr 182在黑色素瘤中的表达,我们从最近两项有关黑色素瘤的研究中询问了单细胞表达数据。25,26。我们发现GPR 182的表达仅限于两个数据集中的ECs。1A)。对EC人群的详细分析表明,GPR 182完全在淋巴ECs(LECs)中表达(见图)。1B)。我们通过免疫荧光染色进一步研究了GPR 182蛋白在人黑色素瘤中的表达。我们观察到,只有一小部分弱CD 31+血管在TME中是阳性的GPR 182(图1)。1C、上面板)。GPR 182和podoplanin(PDPN)的连续切片共染色证实GPR 182在人黑色素瘤的PDPN+淋巴管中完全表达。1C、中间面板)。GPR 182蛋白与另一种主要在人LECs中表达的蛋白Prox-1共同表达。1C,下面板)27。在人乳腺癌中,我们还发现GPR 182的表达仅限于PDPN+LECs(补充图)。1A)。探讨淋巴管内皮细胞与淋巴管内皮细胞表达的关系GPR 182在更大范围的黑色素瘤肿瘤样本中,我们从肿瘤基因组图谱(TCGA)中询问了288例转移性黑色素瘤样本。我们根据黑色素瘤的相对表达水平,对黑色素瘤样本进行淋巴评分。PDPN, LYVE 1,和VEGFC28,发现GPR 182黑色素瘤的表达与淋巴管评分显著相关(图1)。1D).

图1:人黑色素瘤淋巴管内皮细胞表达GPR 182。

a, b本文根据人黑色素瘤的细胞类型,对两组已发表的单细胞RNA测序数据进行了GPR 182表达的查询。a). b对人黑色素瘤中ECs的分析进一步揭示,GPR 182主要在LECs中表达。c对人黑色素瘤组织进行GPR 182(绿色)染色和EC标记,包括CD 31、podoplanin(PDPN)或Prox-1。d从TCGA数据库中提取288例转移性黑色素瘤样本,获得淋巴评分。的相对表达水平计算淋巴管评分。PDPN, LYVE 1,和VEGFC在每个样本中。根据GPR 182 mRNA表达水平(RSEM,log2归一化)绘制淋巴评分图。皮尔逊相关系数r,和p-双面测试所显示的数值。e, f对正常皮肤正常人黑色素瘤组织进行PDPN(红色)、CD 31(蓝色)、GPR 182(绿色)染色,S-100染色(棕色)鉴定黑色素细胞和肿瘤细胞。f成对肿瘤及癌旁正常组织PDPN+淋巴管GPR 182中位荧光强度(MFI)的定量研究n=15,P-双面配对的值t-测试。误差条表示扫描电镜。

为了比较GPR 182在黑色素瘤相关LECs和正常皮肤中的表达,我们对II/III期黑色素瘤患者的原发肿瘤组织进行了多重染色。我们观察到肿瘤内PDPN阳性淋巴管有较强的GPR 182染色,而癌旁正常皮肤淋巴管中GPR 182的表达较弱或阴性。1E)。在正常人皮肤中,GPR 182在LECs(补充图)中检测不到。1B)。为了量化GPR 182在淋巴管上的表达,我们测定了GPR 182在PDPN+淋巴管上的平均荧光强度(MFI),我们观察到GPR 182在黑色素瘤相关淋巴管中的表达明显高于邻近正常皮肤上的淋巴管(图1)。1F).

损失GPR 182触发器提高抗肿瘤免疫延缓肿瘤进展

为了研究GPR 182是否影响肿瘤的生长,我们获得了GPR 182Tm2q(KOMP)WTSI/+ (GPR 182LacZ/+)鼠标(以下称为GPR 182+/−鼠标),来自Knockout鼠标项目(KOMP)存储库,并通过反向杂交实现纯合子。GPR 182LacZ/LacZ(以下简称GPR 182−/−)小鼠,由Kechele等人描述。22。首先,我们用免疫荧光染色法检测了小鼠GPR 182在B16、YUMM1.7和YUMMER 1.7小鼠黑色素瘤模型中的表达。与人GPR 182相似,小鼠GPR 182在RIV-1阳性LECs上的表达是有限的,但在肿瘤相关LECs中表达较强,LECs似乎是GPR 182在肿瘤中的主要来源(补充图)。1C)。我们接种GPR 182−/−、GPR 182+/−和野生型黑色素瘤(WT)皮下接种B16黑色素瘤并监测肿瘤的进展。GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长速度明显低于WT和GPR 182+/−小鼠。2A结果,GPR 182−/−小鼠在研究终点的肿瘤体积比WT小鼠减少3倍,与GPR 182+/−小鼠相比减少2倍(图1)。2B)。GPR 182−/−小鼠皮下接种YUMM1.7小鼠黑色素瘤后,肿瘤生长也比WT小鼠慢。2C,d)。由于B16和YUMM1.7肿瘤的免疫原性较差,我们用免疫原性更强的YUMMER 1.7细胞攻击小鼠。29。GPR 182−/−小鼠与WT对照组相比,YUMMER 1.7的生长明显减弱,使GPR 182−/−组在接种肿瘤后14d的肿瘤体积减少4倍(图1)。2E)。结果表明,GPR 182−/−小鼠的整体生存期明显长于WT对照组,11只GPR 182−/−小鼠中有3只达到完全肿瘤消退(图1)。2F)。表现出完全肿瘤消退的GPR 182−/−小鼠获得了免疫记忆,因为它们对YUMMER1.7的再次攻击具有免疫记忆能力,并且接种了更大的肿瘤疫苗(如图所示)。2G).

图2:GPR 182−/−小鼠抗肿瘤免疫增强。
figure2

a, bGPR 182−/−和小白蚁皮下接种20万个B16肿瘤细胞。肿瘤生长曲线(a肿瘤接种后14天(肿瘤接种后14天)和肿瘤肿块(b)记录。n每组分别为11、12和9。两个独立实验的代表性数据。c, dWt和GPR 182−/−小鼠皮下接种50,000只YUMM1.7肿瘤细胞。肿瘤生长曲线(c肿瘤接种后16天(肿瘤接种后16天)和肿瘤肿块(d)记录。n=每组9-10人。三个独立实验的代表性数据。eg肿瘤生长曲线(e)和Kaplan-Meier曲线(f)−/−小鼠皮下接种250,000只YUMMER1.7肿瘤细胞,以提高WT和GPR 182小鼠的存活率。n=每组10-11。两个独立实验的代表性数据。无瘤GPR 182−/−小鼠(n5)在肿瘤被完全排斥后一个月用YUMMER 1.7进行攻击;朴素的GPR 182−/−小鼠(n=8)作为比较(g). hT细胞耗竭对WT和GPR 182−/−小鼠B16肿瘤生长曲线的影响。T细胞耗竭组在接种肿瘤前1天和接种肿瘤后第7天分别给予αCD4和αCD8耗竭抗体治疗。n=每组10人。iYUMM1.7 T细胞耗竭对WT和GPR 82−/−小鼠肿瘤生长曲线的影响。T细胞耗竭组在接种肿瘤前1天和接种肿瘤后第7天分别给予αCD4和αCD8耗竭抗体治疗。n=每组10人。P-双向方差分析的生长曲线值(a, c, e, h, i). P-单因素方差分析肿瘤肿块的数值,并作多次比较(b)和双面学生的t-测试(d). P-木秩检验的Kaplan-Meier曲线值(f)。误差条表示扫描电镜。

为了探讨GPR 182−/−小鼠肿瘤生长减弱是否是由于抗肿瘤T细胞反应增强所致,我们在GPR 182−/−和WT小鼠腹腔注射抗CD4和抗CD8β消耗型单克隆抗体,使CD4+和CD8+T细胞减少。外周血免疫细胞流式细胞仪染色证实T细胞耗竭(附图)。2A)。如图所示。2H和iB16和YUMM1.7肿瘤模型中T细胞的去除逆转了GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长抑制。

为了全面研究肿瘤内免疫细胞,我们解剖了YUMM1.7肿瘤组织,并进行了流式细胞术分析(附图)。2B, c)。YUMM1.7来自GPR 182−/−小鼠的肿瘤在比例和密度上均明显增加CD 45+免疫细胞和CD3+T细胞。3一个,b,以及附图。3A);除了少数多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSC)(附图)。3B非T细胞群体,包括自然杀伤(NK)细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)、树突状细胞(DC)或总MDSC(图1)均无显着性差异。3B)。我们对YUMM1.7肿瘤组织和GPR 182−/−宿主的免疫荧光染色证实了CD3+T细胞在GPR 182−/−小鼠肿瘤中的浸润。3C)。B16肿瘤中免疫细胞浸润的特征反映了YUMM1.7模型中CD3+T细胞在GPR 182−/−肿瘤中的选择性增加(图1)。三维空间,补充图。3C).

图3:GPR 182−/−小鼠肿瘤T细胞浸润及功能增强。

a, b肿瘤接种后16d,对YUMM1.7荷瘤小鼠和GPR 182−/−小鼠的免疫TME进行了表征。用单细胞悬液对免疫细胞(CD 45+)进行染色,并进一步测定T细胞和NK细胞的浸润百分率(P<0.0 5)。a)。用流式细胞仪测定肿瘤内不同免疫细胞类型的密度。b). n分别为每组10人和9人。来自两个独立实验的数据代表。c, dYUMM1.7细胞CD3+T细胞的代表免疫荧光染色c)和B16(d)WT和GPR 182−/−小鼠的肿瘤。每高功率场(HPF)计数CD3+T细胞密度。YUMM 1.7,n=每组10人。B16,n分别为每组8例和7例。来自两个独立实验的数据代表。ekYUMM1.7肿瘤接种后16d,CD8+密度(e)和CD4+T细胞(f),以及干扰素γ-(g)或颗粒酶B(GzmB)(h)产生CD8+T细胞。效应细胞(CD 44)的频率CD62L-)在CD8+和CD4+T细胞中(i),CD8+T细胞同时表达PD1和4-1BB(j),以及FoxP 3+Treg细胞(k),已量化。ei n=每组9例和10例;k n=每组5人。来自两个独立实验的数据代表。P-双面学生的价值观t-测试(ak)。误差条表示扫描电镜。

我们进一步研究了GPR 182−/−小鼠YUMM1.7肿瘤中浸润的T细胞。GPR 182−/−小鼠肿瘤中CD8+T细胞和Foxp 3阴性常规CD4+T细胞密度均增加(图1)。3E,f)。GPR 182−/−小鼠的肿瘤也含有更多的CD8+T细胞,产生效应细胞因子IFN-γ。第三代)和颗粒酶B(GzmB)。3H),指示一个改进的效应T细胞功能。GPR 182−/−小鼠的YUMM1.7肿瘤在CD4+和CD8+T细胞中均有较高的效应T细胞频率(CD 44+CD62L−)。3I)。此外,GPR 182−/−肿瘤中CD8+T细胞表达PD1和4-1BB的比例高于WT对照组(图1)。3J)。在GPR 182−/−肿瘤中,Foxp 3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例下降(图1)。3K)。提示GPR 182−/−宿主肿瘤内T细胞增多主要是由于效应T细胞增多所致。在GPR 182−/−小鼠的B16肿瘤中,常规CD8+和CD4+T细胞均有明显增加(附图)。三维空间T细胞具有效应表型(附图)。3E)和PD1-表达的T细胞(补充图)。3F)GPR 182−/−肿瘤CD8+和CD4+T细胞亚群均呈比例增高。在肿瘤幼稚小鼠中,WT和GPR 182−/−小鼠正常皮肤的CD3+T细胞密度也同样缺乏(附图)。第三代提示GPR 182−/−小鼠肿瘤T细胞浸润增加并不是由于皮肤内存在T细胞所致。

天真GPR 182−/−小鼠的免疫表型

在GPR 182−/−小鼠肿瘤中观察到的抗肿瘤T细胞反应增加,导致我们在天真的GPR 182−/−小鼠中检测T细胞。与以前的报告相似20,22我们观察到成年GPR 182−/−小鼠脾脏质量增加(附图)。4A, b),可能是由于GPR 182在造血中的负面作用。30。用流式细胞仪分析脾细胞组成,观察WT和GPR 182−/−小鼠CD3+T细胞、CD 19+B细胞和CD 45阴性基质细胞百分率的变化。同样,我们观察到两组淋巴结的细胞组成没有差异(补充图)。4C)。我们进一步研究了WT和GPR 182−/−小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的表型。天真的比例没有差别(CD 44)。低层CD62L+),中央存储器(CD 44)CD62L+)和效应器存储器(CD 44)CD62L−)在10周龄WT和GPR 182−/−小鼠之间的群体(补充图)。4D, 4E)。然后,我们从淋巴结中分离T细胞,用细胞增殖追踪染料(CFSE)标记,然后用平板结合抗CD3单抗体外刺激。我们没有观察到WT小白鼠和GPR 182−/−小鼠在CD4+的增殖方面有任何明显的差异(补充图)。4F和4G)或CD8+T细胞(补充图)。4h,4I)不同浓度的抗CD3。因此,我们的研究支持GPR 182的缺失并不直接影响肿瘤天真小鼠的T细胞功能。

GPR 182−/−小鼠T细胞归巢增加

为了确定GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长下降是否由造血细胞或非造血基质细胞中GPR 182的丢失所介导,我们进行了骨髓嵌合体实验,其中GPR 182−/−和WT对照组在重建GPR 182−/−或WT供体小鼠的BM细胞之前进行了致死照射,共产生4组(图1)。4A)。12周后,当免疫系统完全建立时,嵌合小鼠被皮下注射B16黑色素瘤。用GPR 182−/−BM重组的WT小鼠肿瘤生长曲线与对照组相似。用WT或GPR 182−/−BM细胞重组的GPR 182−/−小鼠与WT或GPR 182−/−BM细胞重组的WT小鼠相比,肿瘤生长同样受到抑制。4B)。两组GPR 182−/−宿主小鼠与WT宿主小鼠相比,总体存活率也有所提高(图1)。4C)。因此,GPR 182在基质细胞中的丢失可能是GPR 182−/−小鼠肿瘤生长减弱的主要机制。

图4:改进的归巢,而不是启动,有助于TIL在GPR 182−/−小鼠体内的积累。
figure4

acGPR 182−/−骨髓嵌合体产生原理图(a)。肿瘤生长曲线(b)和Kaplan-Meier曲线(c)嵌合体小鼠皮下接种B16肿瘤细胞。两个独立实验的汇总数据。WT到WT,n=10;GPR 182−/−到WT,n=7;WT至GPR 182−/−,n=8;GPR 182−/−至GPR 182−/−,n=10。dhDLN T细胞启动原理图(d)。将分化的OT-1细胞移植到荷B16-OVA肿瘤的小鼠体内72h后进行定量。n=7;GPR 182−/−,n=5)(e). fh肿瘤接种10d后,从肿瘤DLN中制备单细胞悬液.CD 103+DC(f)和H2Kb/OVA257–264CD 103+DC人群中的阳性细胞(g)流式细胞仪定量。用DLN细胞悬液刺激CFSE标记的幼稚OT-1细胞,共培养3d后分裂OT-1细胞。n=每组4人(h)。两个独立实验的代表性数据。i, j预先激活的OT-1细胞转移原理图(i)。转移后24h测定肿瘤转移的OT-1细胞频率(P<0.0 5)。j). n=每组4和5,代表两个独立实验的数据。kn预先激活的OT-1细胞归巢原理图(k)。转移的OT-1T细胞(CD45.1+CD8+)和BrdU染色的典型流式细胞仪分析(英文)l)。转移后3d,转移的OT-1细胞(CD45.1+CD8+)的频率(CD45.1+CD8+)。m)和BrdU+OT-1细胞(n)对WT和GPR 182−/−小鼠的肿瘤和淋巴结进行定量分析。n=每组5人。两个独立实验的代表性数据。P双面学生的价值观t-测试(en)。误差条表示扫描电镜。

淋巴系统在抗原传递、抗原呈递和T细胞启动的协调中起着至关重要的作用。30,31。因此,我们评价了GPR 182对淋巴引流功能和T细胞启动的可能影响。足垫法测定FITC-右旋糖酐的可溶淋巴输送量表明,WT和GPR 182−/−小鼠的淋巴引流无明显差异(补充图)。4J)。为了评估T细胞的启动情况,我们将B16-OVA肿瘤接种在高肿瘤负荷下,我们观察到WT和GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长没有差异。肿瘤生长10天后,将单纯CFSE标记的OT-1T细胞(CD45.1+)转入B16-OVA荷瘤小鼠,检测肿瘤特异性T细胞启动反应(图一)。4D)。我们观察到肿瘤引流淋巴结(DLN)中CD45.1+OT-1细胞在WT和GPR 182−/−小鼠中的分化百分率无明显差异(图1)。4E)。此外,CD 103+DC在肿瘤DLNs中的表达频率无明显差异(图1)。4F)或在CD 103+dc交叉递呈mhcⅠ级(H-2K)的频率。b)约束OVA257-264(SIINFEKL)在肿瘤DLNs中的表达(图1)。4G)。从B16-OVA荷瘤小鼠的DLN中制备单细胞悬液,并与单纯CFSE标记的CD45.1+OT-1细胞体外共培养。体外共培养72h后,WT组与GPR 182−/−组在刺激DLN细胞时,OT-1细胞增殖无明显差异(图二)。4H)。这些数据表明,GPR 182的缺失对肿瘤DLN中的抗原转运或T细胞启动没有影响。

为评价活化T细胞在肿瘤中的归巢作用,将体外活化的CD45.1+OT-1 T细胞经静脉转移到具有大小匹配的B16-OVA肿瘤的WT和GPR 182−/−小鼠体内。OT--1转染24h后,流式细胞仪检测瘤内OT-1细胞数量。GPR 182−/−小鼠瘤内OT-1 T细胞密度高于WT对照组(图1)。4我,j)。为了进一步确定活化的OT-1细胞密度的增加是否仅仅是由于GPR 182−/−小鼠肿瘤归巢的改善,我们在组织收获前用BrdU对T细胞分裂进行了跟踪,并进行了流式细胞分析(图一)。4k,l)。GPR 182−/−小鼠瘤内OT-1细胞密度再次高于WT对照组,但肿瘤DLN中OT-1细胞的频率相似(图1)。4m)。用BrdU掺入法测定了WT和GPR 182−/−小鼠在肿瘤和肿瘤DLN中的增殖率。4N)。这些数据表明,T细胞向肿瘤归巢的增加,而不是T细胞启动或增殖的改善,是GPR 182−/−小鼠肿瘤T细胞密度增加的原因。

CXCR 3通路上调对GPR 182−/−小鼠肿瘤生长的抑制作用

通过与免疫细胞上表达的趋化因子受体的相互作用,趋化因子是免疫细胞归巢的主要驱动力。14。GPR 182是一个与ACKR 3同源的孤儿GPCR受体。5A)。与其他已知的ACKR类似,GPR 182没有一个保守的DRYLAIV基序(补充图)。5B主要由基质细胞表达,尤其是黑色素瘤中的LECs。1和补充图。5C)。我们假设GPR 182可能作为一种Ackr来调节TME中趋化因子的生物利用度。32。我们从WT和GPR 182−/−小鼠中摘取YUMM1.7肿瘤,用LEGENDplex小鼠趋化因子板(BioLegend)测量肿瘤内13种趋化因子的浓度。GPR 182−/−小鼠肿瘤中CCL 2、CCL 22、CXCL 1、CXCL 9和CXCL 10等多种趋化因子显著增加(图1)。5A).

图5:CXCR 3通路介导GPR 182−/−小鼠TIL浸润增加。
figure5

ac肿瘤接种后16d,分别在WT和GPR 182−/−小鼠体内采集YUMM1.7肿瘤进行分析。用LEGENDplex促炎趋化因子片(LEGENDPLE)测定YUMM1.7肿瘤瘤内趋化因子浓度(a)。WT,n=6;GPR 182−/−,n=8.CD8+细胞中CXCR 3-和CXCR 3+细胞密度b)和CD4+(c)流式细胞仪检测YUMM1.7肿瘤中T细胞的表达。WT,n=7,GPR 182−/−,n=9.两个独立实验的代表性数据。df接种50,000 YUMM1.7肿瘤细胞后,接种CXCR 3单克隆抗体(CXCR 3)后,WT和GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长曲线(d)。流式细胞术定量测定CD8+(e)和CD4+T细胞(f)荷瘤后16d,WT和GPR 182−/−小鼠的密度。n=每组10人。两个独立实验的代表性数据。P-双面学生的价值观t-测试(a),具有Bonferonni校正的单向方差,用于多个比较(b, c, e, f)和双向方差分析(d)。误差条表示扫描电镜。

趋化因子CXCL 9和CXCL 10通过与受体CXCR 3的相互作用,被认为是黑色素瘤活化T细胞归巢的载体。33,34。在我们的小鼠肿瘤模型中,C57BL/6小鼠缺乏CXCR 3的第三配体功能CXCL 11。35。GPR 182−/−小鼠YUMM1.7肿瘤中CD8+和CD4+T细胞亚群中CXCR 3阳性细胞均有选择性增加(图一)。5b,c)。为了进一步评价GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长减弱和T细胞密度增加是否依赖于CXCR 3通路,我们在YUMM1.7肿瘤接种过程中用CXCR 3阻断单抗治疗小鼠。抗CXCR 3治疗完全抑制了GPR 182−/−小鼠的肿瘤生长,提示GPR 182−/−小鼠抗肿瘤免疫的改善与CXCL 9/CXCL 10/CXCR 3轴有关(图1)。5D)。对WT和GPR 182−/−小鼠TIL的分析进一步表明,抗CXCR 3治疗明显减少了YUMM1.7肿瘤的T细胞浸润,从而使GPR 182−/−小鼠瘤内T细胞密度的增加完全被抗CXCR 3所阻断。5E和f).

GPR 182作为CXCR 3配体的Ackr

为了直接检验GPR 182是否作为Ackr,我们首先分析了标记的人CXCL 9(hCXCL 9-标志)与稳定表达人GPR 182(GPR 182+CHO)的CHO细胞之间的表面结合。在4℃孵育30 min后,hCXCL 9-标志与GPR 182+CHO细胞强结合,而非WT CHO细胞,这种相互作用可被过量无标记的人CXCL 9孵育细胞所阻断。6A)。滴度未标记的CXCL 9竞争试验进一步揭示KdCXCL 9为1.33×10−6(M)IC 50为3.03×10−6(M)(如图所示)。6B)。小鼠CXCL 9蛋白能瞬时表达小鼠GPR 182的HEK293T细胞,证明这种相互作用在小鼠体内是保守的。6C)。我们间接地评估了GPR 182是否也能与另外两个CXCR 3配体CXCL 10和CXCL 11结合。滴定的CXCL 10或CXCL 11的包涵体能与CXCL 9竞争GPR 182+CHO细胞的结合。6d),IC 50为1.47×10。−7(M)和6.87×10−7(M)分别。这间接表明GPR 182与CXCR 3的另外两个趋化因子配体相互作用。有趣的是,GPR 182与ACKR 3具有最接近的同源性,而ACKR 3恰好与CXCL 11交互。36,CXCR 3的另一种趋化因子配体。

图6:GPR 182结合和内吞趋化因子CXCR 3配体。

a, b将稳定转染人GPR 182(GPR 182+CHO)的WT CHO细胞和CHO细胞在4°处与人CXCL 9标记结合。细胞与纯化的人CXCL 9进行预孵育,以评估其阻断能力。a)。用不同浓度的未标记CXCL 9对IC 50和KD(b). n=3个复制样本。来自至少三个独立实验的代表性数据。c转染小鼠GPR 182的WT 293 T细胞和293 T细胞在4度处与CXCL 9标记结合。n=3.两个独立实验的代表性数据。d对GPR 182+CHO细胞进行4度hCXCL 9-AF 488染色。用不同浓度的CXCL 10或CXCL 11预孵育细胞,评价其阻断能力。n=3个复制样本。两个独立实验的代表性数据。e, f用CXCL 9-AF 488 37℃孵育20 min后,用麦胚凝集素(WGA)对WT和GPR 182+CHO细胞进行固定和共染色。共聚焦显微镜观察CXCL9-AF488与WT或GPR 182+CHO细胞共同作用后的变化。n=每组10人(e)。用共聚焦显微镜测定了GPR 182在CXCL 9孵育前后的位置。f)。两个独立实验的代表性数据。gj将WT和GPR 182+293 T细胞与CXCL 9共孵育20 min,37℃,固定染色,观察GPR 182和clathrin HC(g),卡韦林-1(h),EEA 1(i),或LAMP 1(j)在共聚焦显微镜前。两个独立实验的代表性数据。P-双面配对的值t-测试(e)。误差条表示扫描电镜。

众所周知,ACKRs通过受体结合将趋化因子内化。37,38,39,40,41。在原代人LECs中,我们发现GPR 182蛋白主要存在于细胞内(补充图)。5D)。DMO治疗LECs可显著上调GPR 182的表达,支持缺氧可诱导GPR 182的发生。42。将人LECs与GPR182mAb在37°C孵育1h后,可检测到GPR 182抗体内吞(附图)。5E)。我们无法通过原代LECs检测到CXCL 9内吞,这可能是由于GPR 182的低表达和弱相互作用所致。因此,我们使用GPR 182+CHO转染物来评价GPR 182介导趋化因子配体内化的能力。用AF 488标记的CXCL 9在37°C下孵育WT和GPR 182+CHO细胞20 min。用共聚焦显微镜观察CHO细胞时,GPR 182+CHO细胞内有AF488-CXCL 9,而WT CHO细胞中未检出AF488-CXCL 9。6E)。同时,表面GPR 182在与人CXCL 9孵育后内化。6f)。提示GPR 182与CXCL 9相互作用,内源细胞相互作用。我们进一步将GPR 182与内吞、内小体和溶酶体的标记一起染色,以确定CXCL 9孵育后GPR 182的细胞内命运。细胞内GPR 182与clathrin、EEA 1和LAMP 1共定位,而与空洞蛋白1无共定位(图1)。6G-j)。这表明GPR 182在与早期EEA 1阳性的内小体和LAMP 1阳性溶酶体的结合和交通过程中经历了clathrin介导的内吞作用。43。人黑色素瘤中巨噬细胞和DC表达的CXCL 910,44,主要存在于淋巴GPR 182所在的瘤周间质(补充图)。5F)。这种紧密的空间关系支持了GPR 182清除TME中CXCL 9的可能性。一贯地,在小鼠黑色素瘤模型中,GPR 182表达的LECs主要存在于肿瘤周围,肿瘤内CD3+T细胞主要定位于肿瘤周围(补充图)。5G)。综上所述,我们的研究表明,GPR 182是一种Ackr,可以清除CXCR 3的趋化因子配体,并将它们作为细胞内降解的靶点。

GPR 182通过gag结合基序与趋化因子杂乱地相互作用。

ACKRs经常与多种趋化因子相互作用。13,45。通过竞争结合实验,我们进一步分析了35个人趋化因子组阻断GPR 182与CXCL 9相互作用的能力。所有4个亚类(CCL、CXCL、CX3CL和XCL)的趋化因子均能不同程度地阻断CXCL9-AF 488与GPR 182+CHO细胞的相互作用,提示GPR 182与趋化因子有不同程度的结合。7A)。因为已知趋化因子具有连接内皮细胞的gag结合基序。7我们假设GPR 182是gag结合基序的模式识别受体.GPR 182+CHO细胞与人CXCL 9 C末端gag结合肽的预孵育(69-93)46完全阻断了GPR 182和CXCL 9之间的相互作用。7b)。当我们合成两个由gag结合基序重复序列组成的gAG结合肽[(ARKKAAKA)]时3和(阿克卡拉)4]47这两种多肽均能明显破坏CXCL 9与GPR 182+CHO细胞的结合。7C)。因此,GPR 182可能与广泛的gag结合蛋白结合.

图7:gpr 182通过gag结合基序随意结合趋化因子.
figure7

a用hCXCL9-AF488研究了35个人趋化因子对GPR 182+CHO细胞的阻断作用。所有趋化因子均显示%阻滞,黑条(>90%阻塞)、暗灰色(80%-90%阻塞)和轻度灰暗(<80%阻塞)的趋化因子表现较强。两个独立实验的代表性数据。bHCXCL9-AF 488与WT和GPR 182+CHO细胞呈4度结合。将细胞与CXCL 9(CXCL 9,69-93)的25-AA肽(CXCL 9,69-93)共同孵育,评价其阻断能力。来自至少三个独立实验的代表性数据。c用CXCL9-AF488研究了两种合成的GAG结合肽对GPR 182+CHO细胞的阻断作用。两个独立实验的代表性数据。

与CXCR 3相比,我们进一步评估了GPR 182触发的信号通路。刺激CXCL 11,最强的CXCR 3激动剂48我们观察到CXCR 3+CHO细胞有较强的钙通量,而GPR 182+细胞则无明显的钙通量(附图)。5H)。Westernblot分析表明,CXCL 11处理可引起CXCR 3+CHO细胞ERK磷酸化,而不触发GPR 182表达细胞(附图)。5I)。除了典型的G蛋白介导的信号传递外,gpRs还通过不同的方式招募β-arrestin来协调它们的信号传递。49。我们采用了纳米发酵酶二元(Nanobit)技术。50探讨β-arrestin与GPR 182的关系.在此系统中,我们构建了GPR 182和CXCR 3融合到小的11-AA互补肽(SmBiT)N端的表达结构,同时在互补的大比特蛋白(LgBiT)的C端加入了β-ARD 2。这两种GPCRs与β-READ 2之间的联系将导致荧光素酶的激活(补充图)。5J,左)。我们在HEK293T细胞中观察到一个强的发光信号,共转染GPR 182和β-ARSTIN 2,证明GPR 182与β-arrestin(补充图)有着内在的联系。5J,右)。这些数据表明gpr 182并不触发经典的G蛋白信号,而是与β-arrestin有关,这与最近的一篇文章一致。51.

GPR 182消融术使免疫冷黑色素瘤对免疫治疗敏感

YUMM1.7肿瘤是一种免疫原性差的小鼠黑色素瘤细胞系,对ICB治疗具有耐药性。29,52。考虑到GPR 182−/−小鼠YUMM1.7肿瘤中T细胞浸润和功能的增加,我们推测GPR 182消融将使YUMM 1.7对ICB敏感。肿瘤接种后第8天,采用抗CTLA 4和抗PD1抗体双重ICB治疗小鼠。我们观察到双ICB治疗未显著降低YUMM1.7荷瘤小鼠的肿瘤生长或整体存活,与以往观察结果一致。29。然而,GPR 182−/−小鼠在ICB治疗后肿瘤生长明显下降(如图所示)。8A结果,ICB进一步延长了GPR 182−/−小鼠的整体存活时间(如图所示)。8B)。此外,B16肿瘤是另一种免疫寒冷的小鼠黑色素瘤,在GPR 182−/−小鼠中表现出对单剂抗PD1的反应增强(如图所示)。8C)。在WT小鼠中,单用抗PD1治疗对B16肿瘤的进展无影响,而GPR 182−/−小鼠的抗PD1治疗能显著减缓肿瘤的生长(图一)。8C).

图8:GPR 182消融使肿瘤对免疫治疗敏感。
figure8

a, bWt和GPR 182−/−小鼠接种50,000只YUMM1.7肿瘤细胞,分别接种抗CTLA-4和抗PD1或载体对照(箭头表示抗CTLA-4和抗PD1)。肿瘤生长a)和Kaplan-Meier生存(b)YUMM1.7的曲线。WT,n=10;WT(ICB),n=10;GPR 182−/−,n=8;GPR 182−/−,n=10。cWt和GPR 182−/−小鼠在建立肿瘤后,接种B16肿瘤,经抗PD1或对照处理后的肿瘤生长曲线(箭头表示抗PD1治疗)。n=每组10人。dWT和GPR 182−/−小鼠为S.C。接种50万只B16-OVA肿瘤细胞,第6天,半数小鼠接受腹腔注射。活化的OT-1细胞的转移。每日随访B16-OVA肿瘤生长曲线。n=每组10人。两个独立实验的代表性数据。e一个方案描述了GPR 182如何发挥趋化因子清除剂的作用,抑制抗肿瘤免疫。P-双向方差分析的生长曲线值(a, c, d). P-学生对肿瘤肿块的价值t-测试。P-对数秩检验的Kaplan-Meier曲线的值,双面(b)。误差条表示扫描电镜。

我们进一步评价了过继T细胞治疗GPR 182−/−小鼠的疗效。Wt和GPR 182−/−小鼠接种B16-OVA肿瘤,两组肿瘤生长相似。肿瘤植入后,小鼠在接种肿瘤后第6天接受500万体外激活的OT-1细胞的静脉转移。单用OT-1细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对WT小鼠的肿瘤生长无明显抑制作用,而接受相同数量OT-1CTL的GPR 182−/−小鼠则表现出明显的肿瘤生长抑制作用(图一)。8D)。综上所述,我们的数据表明,GPR 182发挥趋化因子清除剂的作用,限制效应T细胞在TME中的浸润(如图所示)。8E),GPR 182消融提高了对ICB治疗的反应性,提高了ACT治疗低免疫原性肿瘤的疗效。

讨论

我们的研究表明,GPR 182缺乏导致小鼠黑色素瘤多种模型中T细胞依赖性的肿瘤生长减弱,并认为GPR 182是提高免疫治疗效果的潜在治疗靶点。GPR 182的缺失导致肿瘤内趋化因子水平升高,从而引起效应细胞CD4+和CD8+T细胞浸润的CXCR 3依赖性增加。此外,我们还证明GPR 182作为一种Ackr广泛地清除趋化因子。

迄今为止,ACKR家族至少包括四个成员:ACKR 1(DARC)、ACKR 2(D6)、ACKR 3(CXCR 7)和ACKR 4(CCRL 1或CCX-CKR)。53。ACKRs与传统的趋化因子受体具有同源性,但在组织表达、信号传递和功能上有显著差异。趋化因子是白细胞迁移的关键调节因子,通过激活在不同白细胞群上表达的常规趋化因子受体。54。相反,ackr在基质细胞群体中表达,包括淋巴和血液ecs,由于dryLAIV基序的突变,无法激活经典的gprotein介导的信号传递。13,14,15。与直接促进白细胞迁移相反,ACKRs通过趋化因子结合、降解和胞吞作用,通过形成组织中的趋化因子梯度来调节炎症。13,14,15。我们的数据强烈地表明GPR 182是Ackr家族的另一成员。GPR 182与趋化因子受体家族具有相近的同源性。18,但有DRYLAIV基因突变(GPR 182中的“DRYVTLT”)。GPR 182不触发典型的G蛋白介导的信号传导,而与β-arrestin有关.我们的数据和其他出版物21,22,55,56提示GPR 182在ECs中广泛表达,尤其是LECs和正弦ECs,而在白细胞中不表达。在TME中,我们证明GPR 182是在LECs上特异表达的,但是GPR 182是否在肿瘤中的血管EC或其他间质细胞中表达还没有被完全排除。GPR 182通过gag结合基序与人趋化因子广泛相互作用.在受体结合后,趋化因子被GPR 182激活,并以细胞内早期内小体和溶酶体为靶点。这些数据支持GPR 182作为趋化因子清除剂(补充表)的功能。1).

我们的数据与LeMercier等人最近的一份报告一致。19,这表明GPR 182作为一个Ackr与CXCL 10、CXCL 12和CXCL 13具有最高的亲和力。表型上,GPR 182缺陷小鼠血浆CXCL 10、CXCL 12和CXCL 13浓度升高,造血干细胞在骨髓中的存留率降低。我们进一步证实了GPR 182清除CXCL 9和CXCL 10在小鼠黑色素瘤TME中的作用,表明淋巴GPR 182是肿瘤免疫治疗的潜在靶点。此外,我们还发现GPR 182与存在于趋化因子之间的gag结合基序相互作用,从而解释了GPR 182具有混杂的趋化因子结合能力。我们还展示了比LeMercier等人报道的更广泛的GPR 182的趋化因子结合谱。19。一个可能的原因是LeMercier等人。仅发现GPR 182的趋化因子结合谱有限,即他们使用较低浓度的趋化因子(120 NM)与CXCL 10竞争GPR 182的结合。然而,在类似的实验中,我们使用更高浓度的趋化因子(20μg/ml,约2.4μM)与CXCL 9结合,而CXCL 9对GPR 182的亲和力低于CXCL 10。

在人类恶性肿瘤中,肿瘤淋巴管生成往往与淋巴结转移增加和预后不良有关。57,58。癌细胞利用淋巴管作为转移到局部淋巴结的管道,这是一个很差的预后指标。淋巴管和LECs也可能通过耐受性诱导使癌症逃避免疫系统。59。除了调节抗原呈递和dc归巢,最近的研究显示淋巴管对抗肿瘤免疫有积极的调节作用,包括pd-l1的上调。60,61以及免疫细胞在TME中的吸收62。尽管LECs主要位于肿瘤边缘,但它们积极帮助形成TME中炎性细胞因子的浓度,并影响T细胞浸润。63。发现许多ackr在淋巴管中表达,其中许多已被证明可以调节多种趋化因子来影响tme。17。我们的发现,GPR 182作为一种新的Ackr功能,广泛内吞的趋化因子提供了新的分子证据,以免疫调节作用的淋巴管。通过GPR 182清除促炎症趋化因子,LECs积极保留免疫反应以维持组织耐受性。

趋化因子系统由于趋化因子与其受体的重叠相互作用,常被描述为多余或混杂。64。尽管趋化因子与其受体之间存在着复杂和重叠的相互作用,但这些相互作用的生物学意义并不一致。不同的趋化因子可与同一受体相互作用,诱导不同程度的受体内化、受体再循环和配体降解。此外,组织和细胞类型特异性表达模式和时间表达动态影响这些特定相互作用的生物学相关性。64。我们在体内的观察使我们发现GPR 182与CXCL 9、CXCL 10和CXCL 11相互作用,进而调节CXCR 3轴以限制T细胞归巢进入TME。由于CXCL 9和CXCL 10是C57BL/6小鼠CXCR 3的唯一功能配体,CXCR 3阻断后,CXCL 9和CXCL 10可完全逆转GPR 182缺失小鼠的抗肿瘤表型,改善T细胞浸润,提示TME中这两种趋化因子的丰度改变是促进所观察到的表型的重要因素。我们还观察到在缺乏GPR 182的小鼠肿瘤中CCL 2、CCL 22和CXCL 1的浓度增加;这些发现使我们进一步发现GPR 182通过它们的gag结合基序与趋化因子广泛地相互作用。CCL 2、CCL 22和CXCL 1分别与CCR 2、CCR 4和CXCR 2相互作用,介导单核细胞、巨噬细胞、DC和T细胞趋化。14。虽然我们没有发现GPR 182缺乏的小鼠的巨噬细胞或DC密度有显著差异,但我们确实观察到GPR 182缺乏的小鼠PMN-MDSC浓度增加,这可能是CCL 2、CCL 22和CXCL 1浓度升高的继发原因。然而,与我们观察到的T细胞表型相比,PMN-MDSC浓度的增加并不大.在我们的小鼠肿瘤模型中,GPR 182为什么调节某些趋化因子,而不调控其他趋化因子,这还有待确定。此外,GPR 182−/−肿瘤中炎性趋化因子的增加可能是TME炎症增强的继发性效应。另一方面,CXCR 3通路在调节黑色素瘤效应T细胞浸润中的主导作用可能掩盖了GPR 182调控的其他趋化因子的贡献。此外,GPR 182是唯一已知与CXCL 9和CXCL 10密切相关的Ackr。CXCL 9和CXCL 10的清除受体缺乏冗余,这可能使GPR 182的消融对这些趋化因子有更多的主导作用。我们进一步证明,GPR 182是一个模式识别受体的gag结合的结构.因此,gpr 182很可能在免疫系统之外具有更广泛的生物学功能。20,65。未来对GPR 182可能调控的额外GAG结合蛋白的研究是有必要的。

CXCR 3及其三种趋化因子配体CXCL 9、CXCL 10和CXCL 11在调节效应T细胞归巢中起核心作用。CXCR 3在活化后在幼稚T细胞上表达,在效应细胞CD8+T细胞和Th1型CD4+T细胞上高表达。66。B6小鼠产生一种非功能形式的cxcl 11。67,但CXCL 9和CXCL 10均在介导T细胞浸润小鼠肿瘤中发挥重要作用,CXCL 9似乎起主导作用。10,68,69。当CXCR 3依赖的T细胞浸润到TME或其他炎症部位时,存在一个趋化因子依赖的正反馈回路,其中CXCR 3阳性T细胞的募集导致干扰素-γ诱导的趋化因子的增加,反过来又会招募更多的CxCR 3阳性T细胞。66。这个正反馈环为GPR 182消融引起的T细胞浸润增加和抗肿瘤免疫增强提供了额外的解释。另一方面,TILs通过传入淋巴管从原发肿瘤迁移到DLN。70因此,淋巴GPR 182可能通过调节肿瘤中T细胞的滞留来限制TIL的浸润。因为CXCR 3在许多黑色素瘤上都有表达。71GPR 182消融增加的趋化因子可能对肿瘤细胞有直接影响。免疫寒冷肿瘤中缺乏炎性趋化因子,提示GPR 182消融对这些肿瘤最有利。在两种免疫寒冷黑色素瘤肿瘤模型中,我们能够证明仅GPR 182消融就能吸收足够的效应T细胞来减缓肿瘤的进展,同时使其他耐药肿瘤对随后的免疫治疗产生敏化作用。阻断GPR 182介导的趋化因子清除作用的治疗剂是否能在这些ICB无反应的肿瘤中提供类似于GPR 182基因敲除小鼠的抗肿瘤免疫,仍有待确定。

GPR 182在辐照后肠再生和腺瘤形成过程中的表达已经被研究过。Kechele等人鉴定了GPR 182在隐窝基柱状肠干细胞中的富集表达。GPR 182基因缺失对肠内稳态增殖无影响,但与辐射损伤后肠增生及APC腺瘤负担增加有关。(分钟/+)老鼠模型。作者得出结论,GPR 182具有抑制肠道增殖的作用,因此可能抑制肿瘤的发生。22。与先前的工作相比,我们展示了GPR 182的抗肿瘤作用.这些研究的重要区别包括GPR 182对肠干细胞的细胞内禀效应与基质细胞清除TME中趋化因子的外在效应。在人黑色素瘤和乳腺癌标本中,GPR 182的表达仅在LECs上检测到,使癌细胞的外部效应在生物学上更加相关。

总之,我们发现GPR 182是一种通过清除趋化因子来负调控黑色素瘤抗肿瘤免疫的Ackr。以GPR 182为靶点的治疗药物在改善免疫冷肿瘤TME中的T细胞浸润方面具有重要的翻译潜能,从而扩大免疫治疗的有效性。


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