全球基因网络联合预测抗PD-1免疫治疗的生物标志物和治疗组合

由于大多数癌症患者对抗PD1治疗缺乏反应，我们开发了一种网络方法来推断与抗PD1的肿瘤反应相关的基因、通路和潜在的治疗组合。在这里，我们的预测确定了已知的与抗-PD1相关的基因和途径，并通过6个CRISPR基因集进一步验证了与肿瘤对细胞毒性T细胞的耐药性相关的基因集和36个化合物的靶点，这些化合物已在临床试验中被测试为与抗-PD1联合治疗。我们的顶级预测和tcga数据的整合确定了数百个基因，它们的表达和基因改变可能影响每种tcgA癌症类型中对抗PD1的反应，而这些基因跨癌症类型的比较表明，与抗PD1应答相关的肿瘤免疫调节将是组织特异性的。此外，整合鉴定了MHC I关联免疫核心(MIA)的基因特征，表明6个队列中411例黑色素瘤患者对抗-PD1的反应有很好的相关性。此外，将药物靶标数据映射到我们的关联预测中的顶级基因，可以发现可能增强肿瘤对抗-pd 1的反应的抑制剂，例如编码的蛋白质的抑制剂。CDK 4, GSK3B，和PTK 2.

癌症免疫疗法的突破开辟了与癌症作斗争的新战线。免疫疗法不是用特定的抑制剂直接针对癌细胞，而是刺激和调节宿主的免疫系统以消除癌细胞。近年来，免疫检查点阻断(ICB)通过抑制T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡1(PD-1)和程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)等免疫抑制检查点分子而增强T细胞活性。尽管取得了这些成功，但只有一小部分癌症患者从这些疗法中受益，而且不同癌症类型的疗效差异很大。因此，人们越来越需要了解这种新的抗药性的机制，选择治疗反应的预测生物标志物，并确定可扩大icb益处的治疗靶点。1,2,3.

目前正在进行的研究表明，肿瘤细胞内因素和癌细胞外因子都参与了对icb的反应。3。最初的免疫激活需要肿瘤细胞表达新抗原，肿瘤细胞是由体细胞非同义突变编码的。许多研究表明，非同义突变负担是对ICB反应最重要的决定因素之一。4。然而，有相当数量的高肿瘤突变负担(TMB)患者有不良的反应，一个子集的低TMB可以对ICB作出反应。最近，两组患者都进行了研究4,5,6以及转基因小鼠模型7已有研究表明，肿瘤细胞可以利用其遗传和表观遗传变异影响免疫前景的各个方面，如肿瘤微环境中免疫抑制细胞的聚集，刺激肿瘤对T细胞攻击的抵抗力，以及解除免疫检查点分子表达的调控等。尤其是癌细胞内多种途径的改变或解除管制，包括MAPK/ptn/pi3k、wnt/β-catenin、jak/stat、干扰素-γ和抗原处理/呈递通路，已被证明与对icb的耐药有关。2,3,5。此外，肿瘤微环境中还存在多种肿瘤细胞外因子，如T调节细胞、髓源性抑制细胞、巨噬细胞等。3，以及微生物8，也影响ICB反应。

近年来，各种基于组学的方法被应用于肿瘤内部和外部因素的识别，这些因素可以作为ICB的预测生物标记物。首先，有几个基因组因素，如新抗原和tmb。9错配修复缺陷10，以及体细胞拷贝数变异负担。11,12，用于预测ICB反应。第二，转录水平数据，如pd-1/pd-l1表达水平。13，基于转录特征的免疫细胞浸润谱分析。14,15，以及转录免疫核心16,17，也被用于响应预测。第三，从16S核糖体RNA分析中获得的微生物分类数据。8也可用于响应预测。然而，这些方法都没有考虑肿瘤基因/通路与ICB反应之间的关系。由于每个肿瘤细胞的遗传组成不同，肿瘤的免疫状态不仅在不同的肿瘤类型之间有很大的差异，而且在特定肿瘤内的区域也有很大的差异。18。因此，阐明癌症基因/途径相关的分子机制将有助于开发个性化免疫干预策略的新途径。虽然最近的下一代测序研究探讨了基因改变/基因表达放松与患者对icb的反应之间的一些联系，但这些研究的小样本限制了它们的通用性。6。在过去的几十年中，计算网络方法被广泛应用于基因功能的注释、新疾病基因的识别和治疗靶点的预测。19,20,21。因此，网络方法可以帮助阐明与ICB反应相关的基因/途径。

在本工作中，我们开发了一种网络负罪感关联的方法来识别与抗PD-1/PD-L1 ICB反应相关的基因和通路(下称抗PD-1)。将顶级基因整合到网络关联和TCGA数据中，可以确定哪些基因的表达和基因改变可能影响每一种癌症类型对抗-PD1的反应。整合还可以选择特定癌症类型的基因标记来计算MHCI关联免疫核心(MIAS)，以预测患者对肿瘤型抗PD1的反应。最后，将药物靶点数据映射到网络关联中的顶级基因，以确定能增强抗PD1对肿瘤反应的化合物。

基于网络的方法概述

抗pd-1治疗的疗效取决于肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体(Mhc)Ⅰ类分子对肿瘤抗原的表达，以供细胞毒性CD8+T细胞监测。22。因此，我们假设在基因网络中任何接近MHCⅠ类基因的异常都可能解除MHCⅠ类抗原处理和呈递通路(以下简称MHC I通路)的调控，并影响肿瘤对抗-PD1的反应。我们提出的基于网络的方法如图所示。1.

第一，网络犯罪关联法。19,23用于计算每个基因与mhcⅠ类基因的功能相关性(以下称为mhc i关联评分)。，PDCD 1，和CD 274(下称MHCⅠ通路基因)根据其相对接近这些基因在一个编译的基因网络(见方法)(见图)。1A)。MHC I关联评分较高的基因变异更有可能解除MHC I通路的调控，从而与抗PD-1治疗的肿瘤反应有关。

其次，我们认为MHC I关联评分高的基因丰富的途径也与肿瘤对抗PD-1治疗的反应有关(图一)。1A)。基因集富集分析(GSEA)24它可以评估基因在一个路径中的分布，在MHCⅠ关联评分排序的有序基因列表中，用于识别与抗PD-1治疗反应相关的通路(称为GSEA关联分析)。然而，由于我们在关联预测中使用的基因网络包含了跨越不同细胞类型和状态的分子相互作用，所以并不是所有预测的基因和途径都与特定癌症类型的MHC I通路相关。通过利用来自一组接受抗PD-1治疗的癌症患者样本的基因表达数据，我们能够识别与MHC I通路功能高度相关的基因和通路，并在特定的癌症类型中解除管制(图1)。1B)。相关通路的解除管制水平也可以用GSEA(称为GSEA解除管制分析)来确定。截断乘积法25(参见方法)用于组合p由GSEA协会和GSEA解除管制分析产生的每一条通路的价值，以确定在特定癌症类型中与抗PD-1反应相关的通路。

第三，用于研究肿瘤免疫浸润的tcga转录数据。26也可以与我们的网络MHCI关联预测集成(图一)。1C)确定特定癌症类型中抗PD-1治疗后与肿瘤反应相关的基因和途径。我们推测mhc i关联预测中的顶级基因，其表达与免疫浸润评分显著相关(估计值)。26在特定的癌症类型中，将与对该癌症类型的抗PD-1治疗的反应有关.因此，我们首先确定了每个基因的表达水平与特定TCGA肿瘤类型的免疫浸润评分之间的相关性。然后，我们将结果与mhc i关联预测结合起来，选择免疫阳性和阴性mhc I相关基因，这些基因是我们的关联预测中的前10%，其表达水平分别与特定癌症类型的免疫浸润评分(绝对相关≥0.2)呈极强的正相关或负相关。这些基因及其通路将与抗PD-1治疗的肿瘤反应有关。此外，我们还通过整合关联预测和tcga转录组数据(见方法)进行了Meta分析，选择前100位免疫阳性mhc i相关基因来计算标记评分，即MIAs，用于预测特定癌症类型的抗pd-1治疗后患者的反应(图1)。1C)。MIAS评分较高的患者比得分较低的患者更有可能对抗PD-1治疗有反应。方法部分详细介绍了MIAS评分的计算方法。

第四，目前抗pd-1治疗的临床队列规模仍然非常有限，对抗pd-1的反应进行了遗传关联分析。6。一些大规模的癌症基因组项目，如tcga，揭示了许多癌症类型的基因组情况。因此，利用我们的顶级mhc i关联预测来挖掘tcga数据将使我们能够在特定的癌症类型中探索与抗pd-1治疗相关的遗传和表观遗传变异(图)。1D)。在这里，我们从一种癌症类型的最高免疫阳性和阴性mhc i相关基因中筛选出反复改变的基因。

第五，我们还推断，在特定的癌症类型中，对某些免疫阴性mhc I相关基因的抑制很可能会促进抗pd-1治疗对该癌症类型的肿瘤反应。因此，从DGIdb数据库汇编的药物目标数据27被定位到特定癌症类型中最高的免疫阴性mhc i相关基因，以确定可能的抑制剂，可以增强对抗pd-1治疗该癌症类型的肿瘤反应(如图所示)。1E).

Mhc i通路相关基因和通路的预测及抗pd-1治疗的应答

我们的方法首先预测了与MHC I通路基因相关的基因。1A)。一些已知直接参与MHC I通路的基因，如TAP 1, 塔普2, CALR, TAPBP，和B2M28，在我们的预测列表中排在前1%(补充数据)1A)。预测中一些顶级基因的变化，如B2M, JAK 1, JAK 2, HSP 90，和IFNG，已知与抗pd-1治疗的不良反应有关。5,28,29,30,31。最近发现的几个与抗pd-1反应相关的基因也被发现在我们的关联预测列表中，例如克拉斯32, STK 1133, ATR34，和阿克塞尔35.

几个小组开发了基于T细胞的crispr/ca 9筛选器，以确定与肿瘤细胞和T细胞相互作用相关的基本基因。36,37,38,39,40。因此，我们利用这些研究中的六个基因集来全面评估我们的预测。六个基因集的接收机工作特性(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)如图所示。2A。高的AUC值表明，在我们的关联预测列表中的许多顶级基因将与抗PD-1治疗的反应高度相关。通过配对重叠分析，我们还发现，我们预测的前10%的基因与所有六个基于CRISPR的基因集都有显著的重叠(补充图)。1)。然而，在不同的研究中，一些CRISPR基因集之间的重叠并不显著。这可能是由于在他们的实验中使用了不同的技术或细胞来源。

接下来，我们将GSEA应用到我们的关联预测中的基因有序列表中，以推断与抗PD-1治疗相关的通路(图1)。1B)。研究结果还显示，已知与抗PD-1治疗反应相关的几条途径在我们的预测列表中居首位(如图所示)。2C；补充数据1B)：WNT通路(此通路的GSEA关联图如图所示。2B)、PI3K-AKT通路、MYC通路、MAPK通路、干扰素信号通路和TP 53通路。41,42,43,44。由于这些关联预测并不是特定的癌症类型，我们还将我们的预测与来自抗pd-1治疗应答者和无效者的肾细胞癌样本的基因表达数据相结合。45。我们对基因表达数据进行了分析，并利用GSEA检查了这些通路的解除管制情况。GSEA协会和GSEA解除管制分析的结合揭示了一些在我们的预测中与MHC I通路高度相关的通路，并且在反应和非应答肾癌样本之间显着地解除了管制(图一)。2C；补充数据1B).

此外，最近提出的抗pd-1治疗反应或抵抗机制的几条途径也被我们的方法所确认(补充数据)。1B)，如DNA损伤/修复途径46和缺陷转录延伸47.

一些作为网络枢纽的癌症基因与抗pd-1治疗的反应有关。

我们发现许多已知的癌症基因都在我们的mhc-i关联预测的首位，例如Akt 2, EGFR, TP 53, PTEN, MAPK 1, MAPK 3, CTNNB 1, AKT 1, JAK 1，和JAK 2(补充数据)1A)。我们用京都基因和基因组(KEGG)癌症路径汇编的328个癌症相关基因对我们的关联预测列表进行了ROC曲线评估，也表明许多癌症途径基因在我们的预测列表中居首位(图一)。2A)。重叠分析表明，所有6个基于CRISPR的基因集也与KEGG癌症通路基因集或从两个数据库编译的其他癌症基因集有显著的重叠(图1)。3A)。这些结果表明，许多肿瘤基因及其相关通路可能与MHC I通路和患者对抗PD-1治疗的反应密切相关。

我们推测，这些癌症基因可能是网络中的枢纽，直接或间接地解除了多个分子通路的管制。19,48，包括MHC I通路，抑制免疫系统，促进癌细胞的生长、存活和增殖。为了验证这一点，我们首先计算了编译网络中所有基因的三种中心性评分：程度、中间度和特征向量中心(见方法)。然后，我们使用基于CRISPR的六个基因集来评价三种中心性方法所产生的结果。图中的中华民国曲线。3B结果表明，6个CRISPR基因集的度中心性结果与所有6个CRISPR基因集的结果具有较好的相关性。其他两种中心性方法(补充图)也有类似的结果。2和3)。图形3C，d，以及附图。4分别表明，MHCⅠ关联预测的程度、中间度和特征向量中心性方法的结果均与我们的MHCⅠ关联预测结果高度相关。综上所述，这些结果表明，一些癌症基因在分子网络中起枢纽作用，间接地解除了某些途径，如MHC I通路，从而驱动癌细胞的免疫逃逸。

挖掘tcga数据以识别与抗pd-1反应相关的遗传变异和通路

一些大规模的癌症基因组项目，如tcga，已经揭示了几种癌症类型的基因组情况，也可以与我们的网络关联预测集成(图一)。1C，d)确定特定癌症类型中抗PD-1治疗后与肿瘤反应相关的遗传变异和通路。在我们网络关联预测的前10%的基因中，我们首先根据mhc-i的表达水平与估计的免疫浸润评分(绝对相关≥0.2)的相关性，选择了最高的免疫阳性和阴性的mhc-i相关基因。26在TCGA癌症类型的所有样本中。我们发现前10%的关联预测列表(补充数据)1A)在大多数癌症类型中显着地丰富与免疫浸润相关的基因(如图所示)。4A)。平均而言，在一种癌症类型中发现了大约800个最高的免疫阳性和阴性的mhc i相关基因；在所有癌症类型中，总共发现了2008年的基因(补充数据)。2)。这些顶级的免疫阳性和阴性的mhc i相关基因有望与每一种癌症类型的抗PD-1治疗反应或耐药性相关。对每种癌症类型的这些顶级免疫阳性和阴性基因的通路分析也揭示了在某些癌症类型中与抗-pd 1反应相关的几条众所周知的途径，例如PI3k信号通路、IFN-γ和wnt通路(补充数据)。3A和3B).

在比较了所有癌症类型中最高的免疫阳性和阴性mhc i相关基因之后，我们发现只有59个基因在所有癌症类型中共享(补充数据)。4)。所有59个基因均为免疫阳性，大部分与T细胞诱导的溶细胞过程有关。此外，我们还发现，在所有癌症类型中，这些2008基因中的某些基因与免疫浸润的相关方向并不一致；也就是说，它们在某些癌症类型中是正相关的，而在另一些类型中则是负向的(图一)。4B)。此外，这些2008年基因中的500个最可变基因的免疫浸润相关性的分级聚类表明，相关组织系中的癌症类型被聚在一起(图一)。4B)。例如多形性胶质母细胞瘤和低级别胶质瘤聚集在一起，肺鳞状细胞癌/肺腺癌、肾嫌色癌/肾乳头状细胞癌、胃腺癌/胃和食管癌。这些结果表明，与抗PD-1治疗反应或耐药相关的分子机制可能是组织和谱系依赖性的。

此外，我们可以将这些顶级免疫阳性和阴性mhc i相关基因定位到tcga中的突变和拷贝数数据，以确定可能与每种癌症类型的抗pd-1反应或耐药相关的遗传变异。表1列出了黑色素瘤中已发现的一些基因异常。我们发现了一些已知的与抗pd-1耐药相关的基因变异，例如拷贝数丢失。B2M和IFNGR 129,30的拷贝数增益MYC42。表中几个已鉴定的基因1最近的研究表明，在其他癌症类型中，适应性免疫反应与适应性免疫反应有关，并将成为黑色素瘤潜在的生物标志物和治疗靶点。首先，p16-cyclinD-CDK 4/6-视网膜母细胞瘤蛋白通路在大多数黑色素瘤中存在异常。49。最近，CDK 4在小鼠乳腺癌模型中发现与抗肿瘤免疫有关。50的基因产物的抑制作用CDK 4能增加pd-l1的表达，提高体内抗pd-1的治疗效果。51。因此，CDK 4拷贝数增加将与抗Pd-1治疗黑色素瘤的耐药性有关.第二，基因的过度表达PTK 2已被证明能促进人黑色素瘤异种移植的转移。52。几项研究还表明，沉默PTK 2能使胰腺癌对抗PD1产生反应53。拷贝数增益PTK 2因此与抗Pd-1治疗黑色素瘤的耐药有关.第三，泛素化在MHCⅠ通路中起重要作用。54在癌症的发展过程中55。因此，泛素C的突变UBC)可能与抗Pd-1治疗黑色素瘤的耐药有关.第四，一些研究表明，翻译起始因子3b(EIF3b)是最大的翻译起始因子的一个关键亚基，其作用是保证翻译起始的准确性，它与肿瘤的发生密切相关。56。徐等人57报告说EIF3B基因表达通过激活β-catenin信号通路促进食管鳞状细胞癌的进展，促进免疫逃逸和抗pd-1抵抗。41。因此，拷贝数增益为EIF3B通过β-catenin激活，可能与抗Pd-1治疗黑色素瘤的耐药有关.

抗PD-1联合治疗的潜在治疗靶点

我们还推测，针对我们的关联预测列表中的一些顶级基因和途径的疗法可以克服阻力，扩大抗PD1治疗的临床应用范围。最近，一些靶向治疗和化疗联合抗PD-1疗法的临床试验已经完成.为了评估我们的方法预测治疗靶点与抗pd-1联合使用的能力，我们手工收集了36个化合物的155个靶基因，这些基因已经在临床试验中测试过，或者用于抗pd-1治疗癌症的联合治疗(补充数据)。5)。如图所示。5这些化合物的许多目标都在我们的MHC I-缔合分析和三种中心性方法的预测列表中。这表明，这些网络方法可以帮助确定有针对性的治疗策略，以提高患者对抗PD-1治疗的反应。

ROC曲线评估MHCI关联方法和其他网络中心性方法的预测，使用36个化合物的靶基因，这些化合物已经在临床试验中测试过，或用于抗PD-1治疗的联合治疗。此图的源数据在源数据文件中提供。

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我们还探索了TCGA，SKCM数据集，以确定额外的潜在治疗目标在黑色素瘤。我们认为，抑制所选的免疫阴性mhc I相关基因的表达将增强免疫浸润，使其成为与抗PD-1联合治疗的潜在治疗靶点。从DGIdb数据库汇编的药物目标数据27然后将其定位到这些顶级免疫阴性的MHCI相关基因上，以确定与抗PD-1联合治疗的潜在化合物。表1列出了SKCM的一些已鉴定的化合物，并引用了与免疫应答相关的文献。我们鉴定出的一些化合物，如组蛋白去乙酰化酶和聚adp核糖聚合酶抑制剂，没有包括在上述性能评估所用的36种化合物中，目前正在与抗pd-1疗法结合进行临床试验。58,59。其他已被证实与免疫反应相关的化合物也可用于抗PD-1治疗黑色素瘤的联合治疗。首先，一种用于治疗白血病和淋巴瘤的抗肿瘤药物--反尼露素diftitox(Denileukin Diftitox)抑制了延伸因子2(EEF 2)的ADP核糖基化产生的蛋白质合成，导致细胞死亡。60。最近的一项研究47报道过高表达EEF2抗Pd-1治疗肾细胞癌和转移性黑色素瘤时，基因抑制炎症反应通路，并与不良反应相关。这意味着去黑素可用于增强黑色素瘤的免疫反应。第二，蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT 1)参与干扰素信号传递61，一些研究指出，蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT 5)可能参与调节某些免疫应答基因的表达62。最近的一些研究表明，一些表观遗传靶向药物，如dna甲基转移酶抑制剂，在某些小鼠模型中可以诱导T细胞的吸引和增强icb的疗效。63。因此，编码蛋白质的抑制剂PRMT 1和PMRT 5可与抗Pd-1联合治疗黑色素瘤.第三，Li等人。64结果表明，糖原合成酶激酶3β(GSK 3β)与Pd-L1相互作用，可诱导Pd-L1磷酸化依赖性蛋白酶体降解。泰勒等人的一项研究。65还报道了GSK 3β抑制剂可下调Pd-1的表达，增强CD8+T细胞在肿瘤治疗中的作用。因此，GSK 3β抑制剂tideGlusib与抗PD-1联合治疗可能是治疗黑色素瘤的一种很有前途的策略。第四，蛋白激酶C epsilon基因(PRKCE)在大多数实体肿瘤中过度表达，并在不同的肿瘤相关通路中发挥关键作用，包括在诱导先天免疫和适应性免疫过程中发挥作用的Toll样受体4(tlr-4)信号。66。最近发现tlr-4信号可以改善慢性病毒感染时抗pd-1的治疗。67。因此，蛋白激酶C抑制剂扎司他林(Enzastaurin)可增强抗Pd-1治疗黑色素瘤的能力.

Mhc i相关免疫核心与抗pd-1治疗的病人反应有关。

我们的MHCI关联预测可以集成到特定癌症类型的TCGA转录数据中，选择标志性基因来计算MIAS评分，以预测癌症类型中抗PD1治疗的患者反应(图一)。1C)。在这项工作中，我们通过应用我们的治疗黑色素瘤的方法来证明这种能力，而抗PD-1疗法是最有效的。我们首先使用一种元分析方法(见方法)将我们的mhc i关联预测与基因表达免疫相关数据结合起来，使用tcga黑色素瘤样本进行计算，选择100个顶级免疫阳性mhc i相关基因(补充数据)。6)用于响应预测。在此，TCGA黑色素瘤样本可视为选择签名的训练集。然后，我们使用来自6个黑色素瘤队列的411个样本(补充数据)验证了这一特征的预测能力。7)16,68,69,70,71,72单用抗Pd-1治疗，或联合抗CTLA-4治疗。我们对411份样本的基因表达数据进行了分析，并使用该标记计算了他们的MIAS评分(见方法)。然后用MIAS评分和临床反应数据计算AUC，以量化我们的MIAS方法的预测能力。此评估分别应用于每个队列数据集以及来自所有队列的组合数据集。如图所示。6A大多数数据集的AUC值显著高于随机期望值(AUC=0.5)。然而，由于一些数据集的大小很小，因此ROC曲线的评估可能不可靠。73。因此，我们还使用了Wilcoxon-mann-Whitney统计量，该统计量与rc曲线的aUC直接相连。74，以评估我们的MIA方法的性能。实际上，我们发现Wilcoxon检验和AUC的结果在一些小数据集中是不一致的；也就是说，一些小数据集的AUC值很高，但在Wilcoxon检验上没有显著的p值(例如，Auslander.PD1.Pre_2018数据集)。

a p-单侧Wilcoxon检验值和接收者操作特性曲线(ROC)曲线下面积(AUC)的值，该曲线量化了我们的MIAS评分对几个黑色素瘤患者队列数据集(Auslander、Gide、Hugo、Liu、Riaz、Abril-Rodriguez)和聚合数据集(SKCM.All)对抗-PD1反应的预测性能。“prep”表示治疗前；“on”，在治疗期间。两个条形图中的垂直虚线分别表示。p-数值=0.05，AUC=0.5。不同队列的数据集用不同的颜色着色。b我们的方法与三种先前的方法，IMPRES，潮汐，和GEP的性能比较，使用了六组黑色素瘤患者数据集的单侧Wilcoxon检验。条形图中的虚线表示p-数值=0.05。c四种模型场景与三种先验方法的性能比较采用单边Wilcoxon检验，对所有411个样本进行融合。这四种模型场景根据MIA的两个主要元素(分别表示MHC-I和估计)的组合，选择不同的特征基因进行响应预测。条形图中的虚线表示p-Wilcoxon检验值=0.05。d对411个样本的MIAS和其他三种方法的成对集成预测的性能。热图图中的颜色标度表示预测性能的统计意义，−log 10(p-数值)，由单侧Wilcoxon检验计算。每个方法的性能的统计意义也列在其名称后面的括号内。此图中所有面板的源数据都在源数据文件中提供。

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接下来，我们将MIA方法的性能与最近提出的其他三种方法IMPRES的性能进行了比较。16潮17，和GEP75，由Wilcoxon-Mann-Whitney检验(图1.6B)和AUC(附图)。5)。结果表明，在大多数数据集中，MIAS方法的预测性能优于以往的三种方法。黑色素瘤中MIA的预测是建立在前100位免疫阳性MHC I相关基因的基础上的，这些基因主要是通过整合两个元素来选择的(参见Eq)。(8方法：(A)他们的MHCⅠ关联评分(表示MHC-I)；(B)它们的表达与黑色素瘤免疫评分(表示估计值)的相关性。为了确定MIA方法中的这两个元素是如何比以前的三种方法具有更好的预测性能，我们考虑了四种方案，即根据这两种元素的组合选择特征基因来计算ssGSEA富集分数(见方法)，以预测所有的411例黑色素瘤样本的反应。第一个方案表示MHC-I+估计，这是我们的MIA方法，它的特征基因是根据这两个元素来选择的。因此，MIA方法的特征基因是那些与黑色素瘤免疫浸润相关的顶级MHC I相关基因。第二种方案表示MHC-I+nESTIMATE，仅根据MHC-I关联评分选择前100位基因。因此，在这种情况下，100个MHC I相关基因可能并不都与黑色素瘤中的免疫浸润有关。第三种方案表示NMHC-I+估计，仅根据估计元素选择前100位免疫阳性基因。因此，本方案中的100个免疫相关基因可能并不都与MHC-I通路和抗-PD1应答有关。第四种情况是NMHC-I+nESTIMATE，随机选择100个基因进行预测(也就是说，这两种基因都没有被用来选择基因)。接下来，我们通过Wilcoxon-Mann-Whitney检验，将这四种情景的预测性能与三种先验方法的预测性能进行了比较。6C)。结果表明，我们的MIAS方法(MHC-I+估计)的预测性能明显优于其他三种方案，说明这两种因素对MIAS的预测性能都有重要的影响。我们还发现，第三个NMHC-I+估计方案的预测性能与GEP相当.类似于第三种情况，即标志性基因只与免疫浸润水平相关，GEP的预测是基于18个炎症基因的表达水平。75。虽然潮汐在预测中使用的特征也与免疫浸润水平有关，但它比第三种方案和GEP有更好的性能，这可能是因为它的两种不同类型的特征分别与T细胞浸润功能障碍和排斥有关。17。然而，潮汐的预测性能仍然比我们的MIAS方法差得多。MIAS在抗PD1反应预测中表现更好的一个解释是，它的特征基因是那些与黑色素瘤免疫浸润相关的顶级MHC I相关基因。

此外，与MIAS、TEAD和GEP相比，IMPRES的预测涵盖了免疫反应机制的不同方面。IMPRES的预测是基于免疫检查点基因表达之间的15对成对关系。16，采用神经母细胞瘤的回归和进展训练数据，而非黑色素瘤患者样本，用抗PD1治疗。因此，15对转录相关可能并不是所有的预测抗-PD1反应在黑色素瘤。尽管如此，我们认为MIA和IMPRES分数的集成可以提高整体预测性能，因为它们是相辅相成的。我们使用Wilcoxon-Mann-Whitney检验对综合数据集(例如所有411个样本)的综合分数的预测性能进行了评估(图1)。6d)和AUC(附图)。6)。结果表明，综合得分优于两种方法。相反，在综合预测MIAS和其他两种先验方法时，性能没有得到改善。

此外，我们发现mias和前面的三种方法在预处理数据集中的表现都很差，但在处理数据集上的表现要好得多，除了gide数据集之外。71。为了探讨治疗前和治疗前的差异，我们比较了他们估计的免疫浸润评分。26并发现预处理数据集的免疫浸润水平均显著低于治疗前数据集(附图)。7)。我们还比较了所有治疗前和治疗前的免疫浸润细胞的组成，用ssgea富集了29个免疫细胞基因的分值来计算。15，并发现大多数在治疗中的样本比治疗前的样本有更多的浸润免疫细胞(补充图)。8)。这与预期的抗-PD1可以增强免疫反应是一致的。正如上述段落所述，MIAS、THED和GEP的预测是基于与免疫浸润相关的特征基因。因此，这些方法在预处理数据集中性能较差的原因可能是由于这些样本的免疫渗透水平较低。其他类型的数据，如突变负担，可能需要整合，以便在预处理样本中进行更可靠的响应预测。

以上结果表明，MIAS评分可以作为建立抗PD1响应预测的综合机器学习模型的一个有用的特征。计算黑色素瘤样本MIA分数的R脚本可在GitHub存储库(Https://github.com/perwu/MIAS)。我们还利用收集到的411例黑色素瘤样本(290例治疗前和121例治疗中)的MIAS和IMPRES评分作为数据特征，并应用支持向量机分别对治疗前和治疗中的黑色素瘤患者样本进行综合反应预测。通过五重交叉验证计算的这些预测指标的准确率列在补充表中。1。这些预测器(也可在Https://github.com/perwu/MIAS)可以帮助人们直接利用转录数据预测SKCM患者样本的反应。

我们的MHC I关联网络方法成功地识别了已知与抗PD1反应相关的基因和通路。这一预测也得到了几个独立的基准基因集的全面验证，其中包括6个与肿瘤抗细胞毒性T细胞耐药相关的CRISPR基因集，以及在临床试验中测试的抗PD1联合治疗的36个化合物的靶点。此外，最近被证明能够增强抗-pd 1的肿瘤反应的几种化合物的靶基因也在我们的关联预测(补充数据)的首位。1A)，例如编码的蛋白质的抑制剂。GSK3B, CDK 4，和PTK 2。特别是，最近的几项研究也交叉验证了我们的预测。首先，Litchfield等人。76分析了从7个肿瘤类型的12个已发表的队列中收集的多达1000个经icb治疗的患者样本的基因组数据，并表明拷贝数丢失。TRAF 2与响应相关联，并且CCND 1扩增与电阻有关。TRAF 2和CCND 1在我们的关联预测列表中分别排在前4.42%和6.5%。第二,SETDB 1(我们预测的前15.13%)与转座子编码抗原的mhc i表达和CD8+T细胞识别有关。77。放大SETDB 1在人类肿瘤中与免疫排斥和对ICB的抗药性有关SETDB 1丢失可使肿瘤对抗PD1敏感。77。第三，巴拉菌素，一种抑制蛋白质编码的LGALS 3(我们预测的前8.78%)，可以增强抗-pd 1的临床和免疫效果。78。所有这些都表明，我们的方法可以有效地识别与抗Pd-1治疗相关的基因和通路。

近年来，CRISPR/Cas9和RNA干扰筛选技术被应用于免疫治疗反应相关基因的鉴定，而不需要任何先前的生物学信息。然而，当不使用以前的生物信息时，必须使用CRISPR/Cas9和RNA干扰筛选来评估所有基因。相反，通过整合我们的预测，我们只需要筛选出预测最高的基因。我们的分析还表明，一些基于CRISPR的屏幕的结果之间有限的重叠可能与所使用的不同技术或细胞来源有关。相反，我们预测的顶级基因与所有基于crispr的基因集都有很大的重叠，这表明我们的方法可能相对不偏袒基于crispr的方法。

我们的中心性分析显示，一些癌症基因就像分子网络中的枢纽，能够通过直接和间接解除对MHC I通路的管制来驱动免疫逃逸。因此，一些网络中心性方法也可以用来识别与抗-PD1反应和抗药性相关的基因和通路。Lesterhuis等人的体内研究结果。79支持这个观点。Lesterhuis和他的同事利用从小鼠模型中应答和无反应肿瘤的基因表达数据推断出的基因网络来确定与抗CTLA-4反应相关的枢纽基因和模块。他们表明，用选定的药物针对其中一些已识别的枢纽基因，可以显着地提高CTLA-4阻断小鼠模型的效果。然而，小鼠识别的靶点可能不适用于人类肿瘤，从小样本构建的共表达网络可能含有许多假阳性和阴性。80。尽管如此，这一证据表明，基因网络中某些枢纽基因的突变或解除管制可能有助于对免疫疗法的抗药性；重要的是，其中许多基因及其途径是有针对性的。然而，中枢基因通常参与控制正常细胞功能的多种其他途径。因此，要确定枢纽基因作为肿瘤中与抗PD1特异性相关的治疗靶点，仍需要使用其他数据(如肿瘤与正常样本之间的差异基因表达数据)或抗PD-1治疗患者的基因表达数据等对网络方法预测的枢纽基因进行优先排序(如图1所示)。1B)或免疫浸润相关数据在癌症(图一)。1C).

靶向治疗是针对重要的调控失调的分子通路或突变蛋白，这些蛋白质是恶性细胞生长和存活所必需的。由于许多靶向药物的免疫调节作用，靶标疗法与ICB的结合已经引起了越来越多的兴趣。首先，靶向治疗会导致肿瘤死亡，从而导致新抗原的释放，从而提高icb的疗效。81。其次，靶向治疗可以恢复与免疫抑制机制相关的解除管制的途径，如T细胞功能障碍和排斥，以克服抵抗力，扩大ICB的临床用途。在最近一项针对第一点的研究中，Colli等人。81估计可能受益于免疫靶向联合治疗的实体肿瘤的比例。他们调查了数以千计的TCGA基因组图谱，这些病例的特定突变是以当前药物为目标的，而且非同义突变的负担超过了对ICB作出反应的建议阈值。与Colli等人的工作不同，我们的方法处理了第二点。我们的预测方法也可以很容易地与患者的突变负担数据相结合，以确定潜在的治疗目标和符合上述两种免疫靶向综合疗法的临床益处的化合物。

最近，一些努力测试了可能的药物组合与检查点抑制剂。然而，对所有可能使用pd-1/pd-l1抑制剂的药物组合的测试，可能会超过符合条件的癌症患者的人数，这些患者可以参加临床试验，因此在临床试验中是不可行的。33。随着药物靶向信息的整合，我们的方法可以有效地识别可能在增强抗PD-1治疗反应的通路中起作用的化合物。然而，要准确预测药物在联合治疗中可能的治疗效果是很困难的，原因有几个，包括目标依赖性药物结合亲和力，药物作用机制不明确，以及药物的不同靶点所引起的不同类型的表型效应(阳性或阴性)。19。然而，我们的方法可以作为一种快速的方法，初步筛选出少量的潜在药物以供进一步评估，并有助于减少筛选中的搜索空间。82。此外，我们的方法可能有助于降低药物发现成本，通过发现一些已批准的药物的新用途，与抗-PD1联合治疗癌症患者(即药物重新用途)。

我们对TCGA数据的综合分析和我们的网络关联预测(补充数据)1A)同时提示抗PD-1治疗后患者反应的分子机制是上下文依赖性的和组织特异性的.其他研究也表明免疫调节是组织特异性的。83。因此，将其他高通量数据，如基因表达数据，与我们的关联预测列表中的顶级基因(补充数据)进行集成。1A)将进一步帮助优先考虑重要的生物标记物和潜在的治疗靶点，将其与抗Pd-1治疗结合起来治疗特定的癌症类型。此外，将我们的预测与个体患者数据(基因组、转录或表观遗传学)结合起来，可能有助于发展个性化的免疫肿瘤学治疗。

将我们的MHC I关联预测与特定癌症类型的TCGA转录数据相结合，可以选择标记基因来计算MIAS评分，以预测患者对该癌症类型的抗PD1的反应。在这项工作中，我们证明了这种能力在黑色素瘤。利用TCGA、SKCM转录数据，选取100个顶级免疫阳性MHC I相关基因作为黑色素瘤的基因标记，并利用来自6个队列的411份黑色素瘤样本，验证了标记基因计算的MIAS评分的预测性能。我们的MIAS方法也可以应用于其他癌症类型，选择特征基因来预测这些癌症类型中的病人反应。然而，除了解除对mhc i通路的管制外，已经证明与对抗pd 1的反应/抗药性有关的因素，如突变负担、微生物群、环境因素、生殖细胞遗传学和免疫浸润，也需要包括在反应预测中。84。因此，基于不同癌细胞的综合计算方法的发展--内在因素和外在因素--将比只考虑任何单个因素的方法表现得更好。例如，突变负担和肿瘤非整倍体评分的组合比单独评分更能预测对icb的反应。11,12。我们的分析还表明，MIAS和IMPRES分数的集成也比两种单独的方法具有更好的预测性能。

此外，我们的结果还表明，MIAS、IMRPES和潮汐能在治疗前队列中的表现均显着低于治疗组，并且在治疗前数据集中的估计免疫浸润水平也显著低于治疗数据集中的免疫浸润水平。提示抗PD1治疗可引起肿瘤微环境中转录组的显著变化，从而提高三种治疗方法对肿瘤微环境的预测能力。同样，Chen等人。85结果发现，应答者与非应答者的基因表达谱在治疗前没有显着性差异，而在治疗前则更显着。抗原提呈、T细胞活化和T细胞归巢的基因表达在接受治疗的应答者中显著上调.他们的结论是，早期治疗样本中的基因表达谱对抗-PD1治疗有很高的预测作用，但在那些治疗前样本中并不可靠。因此，我们建议其他类型的数据，如突变负担，可能需要整合，以便在预处理样本中进行更稳健的响应预测。

我们的分析还表明，一些小数据集的AUC值很高，但没有显着性。pWilcoxon检验的数值，表明一个庞大的病人数据集对于建立和评估一个模型方法是必要的。然而，综合各种因素建立综合预测模型仍有一定的挑战性，主要原因是缺乏具有多水平因子数据的大规模患者队列。84。此外，我们的反应预测是基于对大量基因表达数据的分析，这些数据主要反映不同类型细胞(包括恶性细胞、正常宿主细胞、基质细胞、多种免疫细胞和其他细胞)的平均基因表达情况。单细胞RNA-seq分析能够识别和量化给定数据集中的细胞群体.因此，将单细胞RNA-seq数据与我们的关联网络方法相结合，可以分别分析癌细胞和肿瘤细胞的基因表达，并开发出更强的反应预测因子。

虽然我们的方法不能用于识别分子相互作用尚未被很好地表征的生物标记基因，因为它是基于不完全的分子相互作用数据的，但是随着更多的数据的产生，我们的方法将提高时间。尽管如此，这些结果表明，我们的网络方法是一种有效的方法，以确定与抗-PD1治疗相关的基因/通路，并可用于筛选抗-PD1联合方案治疗癌症的潜在药物。此外，还有其他一些网络方法，如网络中心性、直接邻域关系和最短距离。19,86，也可用于识别与抗-PD1相关的基因和通路。