在2015年5月至2019年3月间，对38例45例癌症患者进行了PD-1抑制剂治疗，然后是IRRDC研究小组。使用的pd-1抑制剂要么是nivolumab(n=34，75%)，要么是彭布鲁克利祖马布( n =11，25%)( 方法 )。所有患者均有生殖细胞株RRD，诊断为体质MMRD( n =28，74%)，Lynch( n =8，21%)，或PPD( n =2，5%(补充表) 1 )。MMRD患者治疗年龄中位数为12.1岁(3.1~28.1岁)，林奇综合征患者为15.7岁(8.5~43.4岁)(p=0.07)。将7种肿瘤类型分为3大类：中枢神经系统(CNS)肿瘤(CNS)。 n =31，69%；播散性：2，6%)，非CNS实体瘤( n =11，24%；传播：7，64%)和血液恶性肿瘤( n =3，7%) 1A )。多数( n 43例(93%)的肿瘤在一线治疗失败后进展/复发。3例胃肠道癌患者术后直接行ICI，2例伴有同步CNS肿瘤，1例有转移性疾病。结果的截止日期是2019年10月。
图1：生殖细胞DNA复制修复缺陷患者不同癌症类型对ICI的临床反应。 a 肿瘤类型分布于38例45例肿瘤患者中。 b ，所有非血液病性恶性肿瘤放射反应的瀑布图。根据RANO和RECIST准则(方法)，值显示了基线测量中2维的最佳部分变化。箭头指向有代表性的T2加权FLAIR和T1加权增强MRI序列在两位病人中显示耀斑和部分反应。
25/45例(55.5%)肿瘤有反应和/或稳定的疾病，大多数(n=20；80%)在中位随访1.87年时持续。中央放射检查(RANO和RECIST标准； 方法 28 ,29 完全缓解6例(17%)，部分缓解9例(25%)，稳定期7例(19%)，进展性疾病14例(39%)。 1B )。在7例同时发生恶性肿瘤的患者中，两种肿瘤的反应均出现在1例患者中，至少1例在4例患者中(如图所示)。 2A )。3例恶性血液病患者(白血病、T-非霍奇金淋巴瘤)开始ICI治疗后中位时间为4.5个月。三种肿瘤的反应有显着性差异( P 非中枢神经系统肿瘤反应最高(100%)，其次为中枢神经系统肿瘤(64%)，血液病反应最低(0%)。
图2：按肿瘤类型划分的患者预后和生存率。 a 、游泳者按患者和肿瘤类型绘制。 b ，Kaplan-Meier(KM)估计所有患者的总生存期( c )根据肿瘤类型对总的生存率的KM估计。CNS肿瘤的中位生存期为21.6个月。非CNS实体瘤未达到中位生存期。给出了双面对数秩检验p-值. d ，KM对继续ICI治疗的CNS肿瘤的无进展性和整体生存率的估计。注：中位生存期延长至24个月(估计3年OS=49.1%)，尽管最初的放射治疗进展中位数为9.9个月(估计3年的PFS=32%)。给出了双面对数秩检验p-值.
值得注意的是，12例(27%)肿瘤早期表现为水肿和强化，提示肿瘤周围炎症或肿瘤进展。 1B 和 2A )。这种现象发生在治疗开始起的34天内(7-74天)，被称为肿瘤“火焰”。 30 这些病人表现为急性临床恶化与头痛，骨，或腹痛，取决于他们的肿瘤的位置。8例(CNS 6例，非CNS实体瘤2例)停止治疗，死亡。重要的是，4例患者(3例CNS和1例非CNS实体瘤)继续接受ICI治疗，并给予足够的支持。由于这一现象暗示了假性进展，因此对这些肿瘤进行了更详细的研究。
3年总生存率(OS)为41.4%(95%CI：38.5~44.2)。 2B 18例(47%)患者在上一次随访时还活着(如图所示)。 2A )。考虑到他们癌症的难治性，这是值得注意的。按肿瘤类型分析显示，非CNS实体肿瘤比CNS肿瘤有更好的生存率(图一)。 2C 和补充图。 1D P =0.01)。然而，复发/进展性中枢神经系统肿瘤的OS为39.3%(95%CI：36.3~42.3)，PFS为26.9%(95%CI；23.2，30.6)，与其历史上快速死亡的结果相比，这是一个显著的改善(图)。 2C，d 和补充图。 1B 6 ,7 ,27 。所有非CNS实体肿瘤持续ICI患者均有持续的反应，平均随访2.6年(范围：0.38~3.5)。值得注意的是，13例CNS肿瘤患者在最初的ICI治疗中经历了放射治疗的进展，其生存时间延长(中位数9.6个月；范围1.5~27个月)(见图)。 2A，d 和补充表 1 )。对免疫治疗的晚期和持续反应的合理解释是这些癌症中强制性的突变积累。 8 产生新的免疫原性肿瘤抗原和反应。临床变量，如年龄，性别，种族，先前治疗，或选择ICI药物与结果无关(附图)。 2 ).
免疫治疗反应的分子决定因素 为了更好地了解ICI反应的分子决定因素，在治疗前和治疗期间从患者那里收集活检标本和血液样本，进行集中分析( 方法 )。肿瘤整体外显子分析( n =39，图1。 3 )单核苷酸变异数变异率高，包括超超突变(中位数233.8/Mb；范围3.4-912)，与肿瘤基因型有关。MMRD-单纯癌症( n =16)与MMRD+PPD癌相比，SNV(中位数，15.8突变/Mb)显著减少(P<0.05)。 n =23，中位数为每毫巴391.4个突变； P < 0.0001; Fig. 4B P =0.03)。起源于生殖细胞PPD、大肠癌(P13；ICI.29)和胶质母细胞瘤(P17；ICI.33)的两种癌症均已获得体细胞MMRD，导致超超突变(图一)。 2A 和 3 ).
图3：从39个可用的成对肿瘤和生殖细胞外显子中总结出基因组特征，以及它们的临床相关性。 肿瘤的排列顺序按总单核苷酸变异(SNVS)每兆位使用半对数规模。错配修复缺陷(MMRD)的肿瘤状态根据MMR基因突变状态，通过全外显子测序(WES)或基因检测确定。肿瘤多聚酶链反应校对缺陷(Ppd)状态是通过已知的存在而确定的。 极/POLD 1 PPD的驱动程序突变和/或宇宙签名状态(宇宙签名10)。使用DeconstructSigs软件包( 方法 )已经进行了颜色编码，并在onco-图下面提供了值。
宇宙特征分析，反映潜在突变过程的印记 31 ，显示信号6在生殖细胞林奇综合征患者的肿瘤中富集。 P 而在这些肿瘤中未检出10和14信号。此外，Signal 6在MMRD中得到了丰富-仅仅是癌症( P 标记10和14在MMRD+PPD癌中富集( P < 0.002). Last, signatures 10 and 14 were individually associated with response to ICI (P =0.03)。重要的是，信号11，这是常见的检测到治疗相关的高突变的成人胶质瘤，对ici没有反应。 32 ，仅在一例同步白血病和胶质母细胞瘤患者(P27)中检出，他们以前曾接受过髓母细胞瘤的烷化剂治疗。这些发现突出了突变信号在复制修复缺陷型癌症中的独特诊断和预后作用。 31
由于肿瘤固有特征(如SNVS、indels和微卫星特异性indels)对ICI反应的贡献存在疑问，我们试图确定这些基因组特征中是否存在独立的角色及其潜在的驱动机制。高snv/mb(≥中位数：275.38/mb)与应答和生存均显著相关，表明极端突变负担甚至对一组一致高突变的癌症也有相关性(P<0.05)。 P =0.005，图1。 4A 以及扩展数据图。 1A-d )。反应和存活也与更高的肿瘤新抗原负荷有关(扩展数据图)。 1E )。克隆突变富集 33 预测响应(扩展数据图)。 2 )。值得注意的是，复制修复缺陷状态可以预测反应和存活。MMRD+PPD患者突变负担较高( P < 0.0001), and these tumors were enriched among the responders (n =17/21)与无反应者比较( n =3/10)( P < 0.001) (Fig. 4B
图4：基因组生物标记物、生存和对PD1阻断的反应。 a 、单核苷酸变异(SNVS)对Mb的响应和总体存活率(OS)。生存分析采用中位SNV负荷。 b ，SNVS作为MMRD(蓝色)和MMRD+PPD(橙色)状态(左)的函数，与SNV和复制修复缺陷状态均有反应关系。 c 、微卫星Indels(MS-indels)的响应和总体生存(OS)。生存分析采用中位MS-Indel值。 d 、MMRD+PPD和MMRD单用肿瘤的总MS-Indel计数。 e ，Kaplan-Meier(KM)使用SNVS/Mb和MS-indel联合估算所有复制修复缺陷型癌症。对于所有响应者和非响应者的方格图，数据表示为中间+/-四分位数范围。采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验，比较应答者与非应答者的统计学意义.生存分析采用Kaplan-Meier法，对数秩检验进行分组比较。所有p值都是双面的.(MMRD：错配修复缺陷；PPD：聚合酶校对缺陷；MS-indel：微卫星插入/缺失)。
最近的研究表明，mmrd肿瘤全基因组ms-indels的程度与对ici的反应有关。 3 ,34 ,35 ...事实上，在我们的整个队列中，由MS-MuTect计算的总MS-indels( 方法 36 ，是肿瘤反应的预测值( P 病人存活率(p=0.006；图1)。 4C )。这是因为在编码微卫星和新抗原的过程中，这些微卫星和新抗原的编码存在移码错误，这些微卫星和新抗原强烈地预测了结果(扩展数据图)。 3 ).
由于MS-indels与SNVS之间没有显著的相关性(附图)。 3 )我们假设，虽然SNV和MS-indels在所有复制修复缺陷型癌症中都是独立的免疫原，但MSindels对于确定仅存在较低SNV的MMRD癌症的结果可能特别重要。为了验证这一点，我们分别分析了MMRD和MMRD+PPD肿瘤。 4D 和补充图。 4 )。总MS-indels在应答者高于非应答者，且与仅MMRD的癌症患者的生存率显著相关( P 在mmrd+ppd癌中不存在(如图所示)。 4D )。相反，高SNV和总indels不能预测仅MMRD的癌症的反应( P >0.1，扩展数据图。 4C 和补充图。 4B )。结合这两种复制修复缺陷型癌症(MMRD-Only和MMRD+PPD)的预测模型显示，高SNVS和总MSindels共同强烈地预测了生存率的提高(图一)。 4E 和补充图。 三维空间 P =0.0024)。
为了确定突变和MS-indels是否驱动一个更同质的癌症类型的反应，我们在CNS肿瘤中询问了这两个基因组标记物。这两个组件独立地促进了响应和生存(扩展数据图)。 5 这些基因组特征在CNS和非CNS实体肿瘤之间没有差异(补充图)。 5A-d )。重要的是，克隆突变 33 尤其是对中枢神经系统肿瘤的反应和存活有很强的预测作用(扩展数据图)。 2 ).
总的来说，这些数据表明SNVS和MS-indels在确定复制修复缺陷型癌症的免疫治疗反应中具有双重作用(补充图)。 3D，g )，包括中枢神经系统肿瘤(附图)。 6 ).
免疫微环境与治疗反应 接下来，我们研究了肿瘤亚组是否影响肿瘤的微环境和对治疗的反应.采用免疫组织化学方法检测免疫细胞浸润(CD3、CD4、CD8和CD 68)和检查点配体(PD-L1)的表达。所有免疫指标均由两名病理学家进行独立评分，并具有较强的一致性( 方法 ；补充图。 7 ).
Pd-L1的表达与反应和生存率的改善有关( P =0.04，图1。 5A )。总之，肿瘤微环境中淋巴细胞浸润的增加与反应有关(扩展数据图)。 6 )。具体来说，高CD8-T细胞浸润预示着反应和OS的改善。 P =0.0002，图1。 5B )。所有非CNS实体瘤，包括仅伴有MMRD的肿瘤，均含有较高的MSI，CD8+T细胞浸润率较高(附图)。 5 )，并对ICI作出了回应。这证实了以前关于MMR缺乏的胃肠道肿瘤有较高的CD8+T细胞浸润的报道。 37 。在传统上被认为是“免疫特权”的CNS肿瘤中也存在高T细胞浸润。 22 (无花果) 5B )。突变负担高的CNS肿瘤，MMRD+PPD不仅增加了CD8+T细胞浸润，而且Pd-L1的表达也显著增高(图一)。 5D，e )。相反，本研究中所有肿瘤的CD 68表达均较低至中等(无>30%)。此外，CD 68与反应或生存之间没有关联(图1)。 5C )。提示在MMRD+PPD和高基因组MS-Indels诱导的超超突变背景下，免疫微环境的激活增加，与CD8+T细胞反应密切相关，可以解释CNS肿瘤中所见的显著反应。事实上，在这些中枢神经系统肿瘤中，CD8+T细胞的高浸润与OS的改善有关( P =0.039；扩展数据图。 7b
图5：肿瘤免疫微环境、生存期及对pd-1阻滞的反应。 a Pd-L1在所有复制修复缺陷型癌症中的表达、反应和存活。切断细胞的≥占细胞总数的1%(中位数)； 方法 b ，CD8的表达，反应和生存的复制修复缺陷的癌症。≥占细胞总数的3%(中位数)； 方法 c ，CD 68的表达、反应和存活。阻断≥占细胞总数的12.5%(中位数)； 方法 )。为( a ), (b )和( c )组织学显示胶质母细胞瘤的放大倍数为20倍。 d ,e 、免疫标记物与SNV及复制修复缺陷状态的关联。 f 联合免疫(pd-L1和CD8表达)和基因组(TMB和MS-indels)与复制修复缺陷型癌症的整体生存率。对于所有响应者和非响应者的方格图，数据表示为中间+/-四分位数范围。采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验，比较应答者与非应答者的统计学意义.生存分析采用Kaplan-Meier法，对数秩检验进行分组比较。所有p值都是双面的.
总体而言，免疫标记物高表达和基因组图谱良好的肿瘤(高SNVS或MSindels)的3年OS为87.8%(95%CI：84-91.5)，而缺乏这些生物标志物的肿瘤为33.2%(95%CI：27.2~39.2)。 P =0.005，图1。 5F
肿瘤耀斑是对治疗的一种免疫反应。 为了确定肿瘤的病因，我们首先分析了这些肿瘤的基因组和免疫标记物。发展为火炬的癌症具有预处理、基因组和免疫特性，类似于没有耀斑的应答者(扩展数据图)。 8A-d )。然后，我们比较了在治疗前和治疗中的两个病人谁有进一步的外科破伤力在耀斑。单状态反褶积的转录分析与免疫推理 方法 )显示在Flare的整体免疫细胞表达增加。值得注意的是，转录组信号显示激活的CD8+T细胞在ICI后显著增加(如图所示)。 6a，b 和补充图。 8 )。用T细胞受体克隆型分析。 6C，d 和补充图。 9 )，我们观察到，与其基线相比，Flare的T细胞储备显著增加。一个样本显示T细胞群体的克隆性和多样性都有所增加，一些原始克隆在耀斑期间扩展(图1)。6C 6d 和补充图。 9C )。此外，CD8+T细胞浸润和PD-L1在两种肿瘤中的表达均较治疗前明显增加(图一)。 6E，f 以及扩展数据图。 9 )。这些观察表明，在Flare中，有一种预先存在的(特定的)免疫反应和进一步的ICI驱动(非特异性和特异性)肿瘤诱导的免疫扩展。
图6：肿瘤耀斑反应特征。 a -d 分析2例在治疗前及发病时有肿瘤复发的患者。( a，b )治疗前和治疗前的总免疫细胞含量。 c ,d 、相应的CapTCR测序和T细胞受体克隆型(TCR)分析。每个方框代表一个特定的TCR克隆类型。使用基线和耀斑样本之间的相同颜色跟踪基线样本和耀斑之间共享的特定克隆型。 e ,f Pd-L1表达和CD8-T细胞浸润在治疗前和治疗前的变化，如患者-1(P33)肿瘤标本的典型20 X图像所示。所有免疫组化均由两名独立的病理学家进行分析。 g 、典型的流式细胞仪图显示CD+T细胞(TIGIT和4-1BB)在治疗开始前和在耀斑时从患者血液中激活。 h ，血液中4-1BB+CD8+T细胞来自无耀斑反应者、无反应者和耀斑。对于方框图，数据表示为中位数+/-四分位数范围.采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验，对应答者、非应答者和耀斑进行配对比较，具有统计学意义。所有p值都是双面的.
接下来，我们研究了这种免疫激活是否可以被系统地观察到(如图所示)。 六小时 、扩展数据图。 10 和补充图。 10 )。我们在治疗开始前和ICI开始后的前90天对多名患者的血液样本进行了连续流式细胞术分析( 方法 )。Flare与表达Ki 67(增殖标志)和4-1BB(TNF受体家族成员)的CD8+T细胞(扩展数据图)有关。 10A-d 还有无花果。 6g )。Ki 67+CD8+T细胞的检测曾被报道与pd-1阻滞的优越反应有关。 38 。4-1bb是众所周知的T细胞活化的标志，对活化的T细胞具有协同刺激作用。 39 。与无反应者相比，Flare与外周血中4-1BB+CD8+T细胞的比例较高(图1)。 六小时 )。先前的研究表明，4-1bb+CD8+T细胞与pd-1阻断反应相关。 40 。这种均匀增加的4-1BB和Ki 67+CD8+T细胞，伴随着4-1BB+CD4+T细胞群的无明显变化(扩展数据图)。 10E，f )和没有区别的响应者，无响应者和照明弹之间的后者(补充图. 10A )，支持我们的假说：CD8+T细胞表达4-1BB反映肿瘤特异性反应的扩展。综上所述，我们的数据表明PD-1阻断后的耀斑是炎症反应和肿瘤抗原反应性T细胞增殖的结果。
