捕获PARP 1相关蛋白的鉴定 为了了解被捕获的PARP 1复合物的性质，我们使用两个正交系统从被捕获或不被捕获的PARP 1细胞中产生基于质谱的PARP 1蛋白相互作用：(1)内源性蛋白快速免疫共沉淀质谱(RIME)。 12 (2)体内APex2过氧化物酶介导的近端蛋白标记 13 。我们使用了耐PARPI的PARP 1缺陷细胞系。 3 、CAL 51 PARP 1 –/– ，我们在其中引入了任意一种野生类型。 PARP 1 (PARP 1 威汤哥 )或诱捕缺陷 PARP 1 Del.p.119K120S 转基因 3 (无花果) 1A )与RIME的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或Apex2-EGFP的近距离标记融合。我们建立了表达所需PARP 1融合蛋白的单细胞克隆(扩展数据图)。 1A )。验证这些转基因，我们发现任何一个PARP 1的表达 威汤哥 -EGFP或PARP 1 威汤哥 -apex2-gfp蛋白重新建立的PARPI敏感性 PARP 1 –/– 细胞(图1. 1B，c )，而PARP 1的表达 Del.p.119K120S -EGFP没有。我们还使用了PAR结合的pbz mRuby 2探针和紫外线(Uv)微辐射实验来证明prp 1。 威汤哥 -apex2-EGFP定位于其产生PAR的DNA损伤位点。在PARPI存在的情况下，PARP 1被保留在损坏的地点(如图所示)。 1D
图1：捕获的PARP 1相互作用蛋白的鉴定。 a 、示意图描述了通过RIME或与质谱相关的邻近标记来鉴定被捕获的PARP 1蛋白-蛋白质间的结构。将细胞置于PARPI+MMS(使诱捕)或MMS(无陷阱)作用1h后，质谱分析鉴定PARP 1-相互作用/近端蛋白。生物素-苯酚。 b ，克隆形成实验，说明PARPI敏感性的恢复 PARP 1 –/– CAL 51细胞 a 。PARP 1蛋白在不同克隆中的表达显示在扩展数据图中。 1A c 中所示的集落形成试验的数量。 b 数据是两个生物复制的平均值。 d 、PARP 1 威汤哥 -Apex2-EGFP蛋白定位于DNA损伤部位，产生PAR，并可被PARPI捕获。表达PARP 1的细胞 威汤哥 -apex2-EGFP转染PAR传感器，PBZPAR结合区与mRuby 2融合(左)。PARP 1 威汤哥 -apex2-EGFP和PBZ-mRuby 2在紫外微辐射位点积累。暴露于100 NM的他拉唑巴利可导致PARP 1的持续积累。 威汤哥 -4月2日-EGFP(中)，但废除标准生产(右)。数据代表两个独立的实验，结果相似。二甲基亚砜。 e ,f ，在PARP 1-捕获条件下富集的PARP 1相互作用(按PSM比((talazoparib+MMS))和MS评分确定)。散点图显示了PARP 1 威汤哥 -EGFP( e )和PARP 1 Del.p.119K120S -EGFP( f )Rime。 g ，在PARP 1下富集的PARP 1相互作用--PARP 1的捕获条件 威汤哥 -4月2日-EGFP近距离标签。在三个独立的实验中进行了RIME和邻近标记。 h ，绘制了PARP 1的PSM与MS评分的关系图。 威汤哥 -apex2-EGFP近距离标记显示p97是PARP 1中发现的最丰富的蛋白质之一。 威汤哥 -4月2日-EGFP近距离标签。
源数据
由于prp 1在dna损伤后易位至染色质，我们首先使用基于rime的免疫共沉淀法。 12 ,14 鉴定与捕获的PARP 1相关的蛋白质(图1)。 1A )。表达PARP 1的细胞 威汤哥 -EGFP或PARP 1 Del.p.119K120S -EGFP暴露于PARP 1-捕获条件下(MMS+Talazoparib)，然后通过甲醛交联来稳定蛋白质的相互作用。他拉唑巴利(Talazoparib)诱捕DNA结合的PARP 1，而用MMS制造DNA损伤。捕获后，分离染色质结合蛋白，用GFP-陷阱珠免疫沉淀PARP 1相关复合物。然后用质谱法对这些蛋白质进行鉴定。我们还包括了对父母的分析。 PARP 1 –/– 缺乏EGFP来识别非特异性结合到GFP-陷阱珠的蛋白质的细胞(扩展数据图)。 1B )。非特异性珠结合蛋白被从鉴定的蛋白质列表中删除(见方法)。结果，我们在表达野生型PARP 1的细胞中鉴定出50个PARP 1相关蛋白(无论是否存在PARPI；补充表)。 1 )和144个PARP 1相关蛋白在表达PARP 1的细胞中的表达。 Del.p.119K120S -EGFP(补充表) 2 )。在这两个数据集中，PARP 1是迄今为止其质谱(MS)评分所确定的最丰富的蛋白质。 1E，f )。为了进一步分析蛋白质的优先级，我们使用MMS+Talazoparib处理的MMS+Talazoparib细胞的MS评分和多肽谱匹配(PSM)富集率(PSM)与单用MMS处理的细胞进行比较。如所料，MMS+Talazoparib可提高PARP 1表达细胞的PARP 1 PSM富集率。 威汤哥 -EGFP，但不表达PARP 1的人 Del.p.119K120S -EGFP(分别为2.5对1.1)。陷阱-缺陷PARP 1 Del.p.119K120S -EGFP突变体似乎与融合复合物亚基Pds5A相互作用，而不考虑PARPI的存在。 1F )，表明突变体PARP 1与染色质之间存在一定的相互作用，与捕获无关。突变型和野生型PARP 1似乎也与染色质相关蛋白(例如chd 4)相互作用，但与PARP 1相比。 Del.p.119K120S -EGFP，PARP 1 威汤哥 -EGFP显示小的泛素修饰蛋白SUMO 1相对富集(PSM比为5在PARP 1中)。 威汤哥 对PARP 1中的 Del.p.119K120S )和SUMO 2(PARP 1中的PSM比为4) 威汤哥 与PARP 1中的身份不明 Del.p.119K120S ；图1. 1E
作为一种正交MS方法，我们采用Apx 2介导的邻近标记法。Westernblotting证实PARP 1 威汤哥 -apex2-EGFP在生物素-苯酚存在下的生物素生物素化反应(扩展数据图)。 1C )，在捕获条件下进行PARP 1标记(扩展数据图)进一步增加。 1C )。在严格的条件下纯化生物素化蛋白并进行质谱分析。对我们的工作的一个警告是，我们无法生成与Apex2-EGFP融合的有陷阱缺陷的PARP 1；这阻止了我们在邻近标记中使用这种控制。我们使用表达PARP 1的细胞 威汤哥 -EGFP用珠子过滤掉非特定的相互作用。由于这种过滤，我们在邻近标记分析中发现与PARP 1相关的蛋白质的数量(即360)高于Rime(无论是否存在PARPI；补充表)。 3 )。一种字符串网络分析，使用表示被捕获的PARP 1互动体网络的高字符串截止(0.7)(扩展数据图)。 2A )，富含与PARP 1介导的碱基切除修复相关的蛋白(PCNA、HMGB 1、LIG 3、PARP 1和极点)； P < 0.01; Extended Data Fig. 2A，b )，使我们对分析有很高的信心。基因集本体论分析还发现了与剪接体和核糖体生物发生有关的蛋白质的丰富(补充表)。 4 )。我们还鉴定了许多特征良好的PAR基化靶点(例如PCNA、NCL、FUS和ILF 3；参考文献3)。 15 ,16 )，加强了我们鉴定真正的PARP 1-近端蛋白的想法。值得注意的是，“内质网中的蛋白质加工”( P < 10−3 )和“蛋白酶体”( P < 0.01) seemed to be enriched in the gene-set ontology analysis, observations we focus on later in this manuscript. The MS and PSM scores showed a positive correlation and identified that PARP1, p97, UBA1 and TOP2A were among the most abundant proteins (Fig. 1g，h )。在PARP 1中表现出高富集率的蛋白质--捕获条件--例如USP 7--通常被鉴定为MS分数较低，表明丰度较低。由于缺乏诱捕的突变体无法进行类似于Rime分析的比较，对于Apex 2分析，我们在进一步的考虑中将高MS评分优先于高PSM比率，因为它将在dna损伤位点代表更高的化学计量比。其中最丰富的标记蛋白是泛素样修饰激活酶1(Uba 1)，它以前与dna损伤部位的泛素化事件有关。 17 和过渡内质网ATP酶p97，它是由泛素控制的过程的中心成分。P97的ATP依赖解折叠酶活性从染色质中提取蛋白质，然后再进行蛋白酶体的降解或再循环。 9 ,10 ,11 ,18 ,19 ,20 。此外，p97通过泛素化事件识别客户蛋白，主要涉及k48和k6残基的泛素化。 21 ,22 。此外，PARP 1中还发现了p97。 威汤哥 ，但不是在PARP 1中 Del.p.119K120S ，Rime分析，强化了它可能与被捕获的PARP 1相互作用的想法。
捕获PARP 1依次被SUMO化和泛素化 我们的Rime分析表明，被捕获的PARP 1与SUMO 1和SUMO 2有关，而我们的邻近标记分析则发现泛素化和p97与捕获的PARP 1有关。这就提出了被捕获的PARP 1被SUMO化和泛素化修饰的假设。这一假说与观察到，在MMS+PARPI培养的细胞中，染色质相关的PARP 1以多种高分子量形式存在，可以想象地代表SUMOylated和/或泛素化PARP 1，而这些形式在核可溶部分中是缺失的(图1)。 2A
图2：被捕获的PARP 1是SUMO化和泛素化的。 a ，PARP 1-捕获条件在染色质组分中诱导出PARP 1的高分子量形式。 PARP 1 −/− (Ko)及 PARP 1 威汤哥 将HEK 293细胞置于PARP 1诱捕器(MMS+Talazoparib)中，将其分为核可溶组分和染色质结合组分。PARP 1的高分子量(MW)形式在捕获后的染色质组分(RAN 8)中更为普遍。 b ，PARP 1捕获导致PARP 1泛素化。转染HEK 293细胞后，转染Ub-Strep-HA表达载体，分别加入0.01%MMS、100 NM他拉唑比、10μM veliparib或10μM UKTT 15。在变性条件下制备染色质组分，免疫沉淀泛素化蛋白，检测PARP 1的存在。 c ，如 b 将Ub-Strep-HA表达载体转染HEK 293细胞，并与MMS、Talazoparib或5μMmln-7243联合作用。大分子量泛素形式的PARP 1的存在减少了mln-7243暴露(第7车道与第5车道)。这些实验的输入控制如扩展数据图所示。 3A b ,c 、EV，空向量。 d ，被捕获的PARP 1被子化。HEK 293 PARP 1 威汤哥 和PARP 1 −/− 转染HA-SUMO 2表达载体后，再用0.01%的MMS或100 NM的他拉唑比处理细胞。从染色质中纯化HA-SUMO 2修饰蛋白，免疫印迹法检测PARP 1。PARP 1 SUMO基化的高暴露斑在扩展数据图中显示。 3B e ，SUMO化和泛素化抑制剂阻止了PARP 1的修饰。类似于 c 以MLN-7243(5μM)或ML-792(1μM)作用于细胞的染色质部分，免疫沉淀得到泛素化蛋白库，免疫印迹法鉴定PARP 1亚型的存在。 f ，对PARP 1进行修改，并以相扑依赖的方式与RNF 4进行交互。 PARP 1 威汤哥 和 PARP 1 –/– HEK 293细胞在5μMmln-7243或1μMml-792存在下被诱捕，PARP 1在自然条件下用PARP-1-Trap珠免疫沉淀。对PARP 1的Westernblotting结果显示，经修饰的PARP 1亚型在ML-792暴露下被取消，而不是mln-7243。SUMO的取消阻止了PARP 1与RNF 4的相互作用，而泛素化的抑制则稳定了两者之间的相互作用。数据代表两个生物复制。免疫沉淀，WB，westernblot。
源数据
我们首先评估泛素化的PARP 1是否存在于PARPI中，而PARPI具有不同的捕获特性。我们使用了以下PARP抑制剂：(1)有效的PARP 1捕获器talazoparib；(2)veliparib，一种能有效抑制PARP 1催化活性但具有最小捕获性的临床PARPI；(3)最近描述的一种结构衍生物UKTT 15，它能够诱导PARP 1捕获。 4 。细胞经MMS+PARPI处理后，通过泛素-链霉亲和素-血凝素(Ub-Strep-HA)分离，从染色质组分中分离出泛素化蛋白库。在这一组分中，PARP 1的高分子量亚型在Talazoparib或UKTT 15暴露的细胞中比暴露于天冬氨酸的细胞中更为普遍(如图所示)。 2B )，提示PARP 1的诱捕作用增强了PARP 1的泛素化。我们在E1泛素激活酶抑制剂mln-7243(亦称TAK 243)的存在下，重复Ub-Strep-HA下拉实验。用抗PARP 1抗体进行Westernblotting显示，捕获条件导致了高分子量PARP 1亚型的形成；当细胞暴露于mln-7243时，这些亚型几乎完全消失，与这些代表泛素化PARP 1的高分子量异构体一致(见图)。 2C 以及扩展数据图。 3A )。在相互变性免疫共沉淀实验中也观察到PARP 1的多泛素化反应，其中PARP 1是从转染有标记标记的HEK 293细胞中免疫沉淀而来的。 PARP 1 互补dna-表达结构(扩展数据图)。 3B )。我们还发现PARP 1上的多聚泛素链由K48连接(扩展数据图)。 3C
SUMO 1和SUMO 2在我们捕获的PARP 1中的存在表明，除了泛素化的PARP 1外，PARP 1也可能被SUMO修饰。我们表达了HA表位标记的SUMO 2，并从染色质组分中分离出变性条件下的亚基化蛋白库。被捕获的PARP 1明显被SUMO化修饰(如图所示)。 二维空间 )。我们还发现，在没有PARPI的情况下，当细胞单独暴露在MMS中(为了诱导DNA损伤和激活PARP 1)时，SUMO 2的总池出现了损耗，PARP 1的SUMO化程度也达到了最低水平，正如前面所观察到的那样。 23 (无花果) 二维空间 以及扩展数据图。 三维空间 )。然而，这种情况并没有像在PARP 1-捕获条件下那样发生。这表明PARP 1在被捕获时是被SUMO化的。有趣的是，在PARP 1-捕获条件下培养的细胞在SUMO基化抑制剂(ML-792，抑制相扑激活酶)存在下孵育时，泛素化PARP 1的高分子量降低(如图1所示)。 2E )，提示PARP 1在捕获后泛素化可能需要先前的PARP 1 SUMO化。相反，泛素化抑制剂对PARP 1亚基化没有影响(图1)。 2F )，提示被捕获的PARP 1的SUMO化是其泛素化的必要条件，而被捕获的PARP 1的泛素化不是PARP 1 SUMO化的先决条件。
用PIAS 4和RNF 4对捕获的PARP 1进行顺序修改 被捕获的PARP 1的SUMO化和泛素化模式暗示了相扑E3连接酶和相扑靶向泛素连接酶(STUbL)的协同作用。我们评估PIAS4(相扑E3连接酶)和RNF 4(STUbL)是否负责。PIAS 4曾被认为是PARP 1非捕获状态下的相扑E3连接酶。 24 RNF 4与调控PARP 1的转录活性有关。 25 )以及参与修复拓扑异构酶裂解复合物，这也代表了一个“捕获的”核蛋白复合物。 26 。被捕获的PARP 1的染色质共同免疫共沉淀显示与RNF 4的相互作用增加(如图所示)。 2F )，与我们的假设一致。这种PARP 1-RNF4的相互作用在抑制SUMO化后减弱，并在泛素化抑制剂作用下稳定下来，这表明了连接酶与底物的相互作用(如图1所示)。 2F
为了描述被捕获的PARP 1的SUMO化和泛素化之间的关系以及SUMO E3连接酶PIAS 4在这一过程中可能起的作用，我们使用了 PIAS 4 –/– HCT 116和 RNF 4 –/– MCF 7细胞株 26 。转染两种细胞株，构建PARP 1基因表达载体。在MMS+PARPI中培养细胞后，从染色质中免疫沉淀PARP 1。对SUMO 2和-3抗体的Westernblotting表明PIAS 4对捕获的PARP 1的有效SUMO化和泛素化是必需的(如图1所示)。 3A 以及扩展数据图。 4A-C )。野生型PIAS 4在 PIAS 4 –/– 细胞逆转了这些作用，但当我们表达dna结合缺陷型pias 4(sap结构域被删除)或不具有催化活性的p.c342A pias 4突变体时，没有实现这种作用。 27 (无花果) 3B，c 以及扩展数据图。 4D )。有趣的是，虽然PARP 1泛素化在 RNF 4 –/– 细胞(证实RNF 4活性是这种修饰的原因)，PARP 1 SUMO化作用增强(如图所示)。 三维空间 以及扩展数据图。 4E-g )。类中野生型rnf 4的重新表达。 RNF 4 –/– 细胞也逆转了这些效应，但在表达相扑相互作用的母题删除的细胞中，情况并非如此。 28 或不具有催化活性的P.H156A突变型RNF4(图1. 3E，f 以及扩展数据图。 4H )。在MMS+PARPI(ExtendedData图)中，我们还通过过表达野生型RNF 4来观察到强烈的RNF4依赖的PARP 1泛素化。 5A )，当我们表达一种显性-负E2结合突变型RNF 4(p.M136S/R177A)时，没有观察到这种效应。使用 RNF 4 –/– 细胞和RNF 4的显性阴性突变体，我们发现RNF 4对捕获的PARP 1的泛素化有80%-95%的作用。我们还发现 RNF 4 基因减少被捕获的PARP 1的泛素化(扩展数据图)。 5B )。这些数据共同建立了RNF 4作为STUbLE3连接酶捕获的PARP 1。虽然PIAS 4和RNF 4在被捕获的PARP 1的SUMO化和泛素化中占大多数，但两者 PIAS 4 –/– 和 RNF 4 –/– 细胞中有部分PARP 1亚基化和泛素化，提示其他连接酶也可能参与PARP 1的修饰。
图3：被捕获的PARP 1以PIAS 4和RNF 4依赖的方式被修改。 a ，PARP 1在体内以PIAS 4依赖的方式被SUMO化。野生型 PIAS 4 –/– 将标志-PARP 1表达质粒转染HCT 116细胞，诱捕细胞，观察染色质结合PARP 1的SUMO化和泛素化作用。SUMO 1的水平(扩展数据图)。 4A )，SUMO 2和泛素在 PIAS 4 –/– 单元格(见扩展数据图。 4B c 分别用于泛素的总输入和印迹的定量。 b , PIAS 4 –/– 用不同表达PIAS 4的载体转染HCT 116细胞48 h，然后在0.01%MMS和PARP 1免疫沉淀存在下，30 min(10 M)处理HCT 116细胞。 c ，SUMO 2和-3(顶部)-和泛素(底部)修饰的PARP 1在 b . b ,c ，数据表示两个生物复制。SAP，PIAS 4，缺失SAP结构域；C342A，催化死亡PIAS 4。 d ，类似于 a ，从野生型和野生型的染色质中纯化了捕获的PARP 1。 RNF 4 –/– MCF 7细胞PARP 1泛素化水平降低 RNF 4 –/– 细胞，而SUMO 1-(扩展数据图。 4E )和SUMO 2-化增强(见扩展数据图)。 4F，g 用于泛素的总输入和印迹的定量)。 e , RNF 4 –/– 将不同rff 4表达质粒转染MCF 7细胞48 h，并进行处理。 b . f ，SUMO 2和-3(顶部)-和泛素(底部)修饰的PARP 1在 e . e ,f ，数据表示两个生物复制。SIM，RNF 4和H156A，RNF 4和H156A，催化死亡RNF 4。 g PIAS 4介导PARP 1亚基化。重组PARP 1与缺口DNA、SUMO 1或SUMO 2、SAE 1和-2、Ubc 9共同孵育，PIAS 4浓度升高。PIAS 4导致SUMO的浓度依赖性增加(扩展数据图)。 5C )。*免费SUMO 2。 h ，RNF 4在体外以相扑依赖的方式介导PARP 1的泛素化。PARP 1亚基化反应与泛素、UBE 1、Ubc5H和RNF4的浓度增加有关。SUMOylatedPARP 1是一种较好的泛素化底物。*游离泛素。 a ,d ,g ,h ，所显示的数据代表了两个具有相似结果的独立实验。EV，空载体；IP，免疫共沉淀；WB，westernblot；WT，野生型。
源数据
最后，我们用体外SUMO化和泛素化反应检测了PARP 1 SUMO化和泛素化事件的相互依赖性。在合成的缺口DNA底物SUMO 1或SUMO 2、SAE 1(SUMO E1)、Ubc 9(SUMO E2)和PIAS 4浓度增加的情况下，重组PARP 1与PARP 1的浓度依赖。 第三代 以及扩展数据图。 5C )。泛素UBE 1(UbE1)、UbC5H(UbE2)的加入和RNF 4浓度的增加导致PARP 1泛素化(如图1所示)。 3H )。相反，RNF 4在不存在SUMO化的情况下表现出更低的PARP 1泛素化活性(图1)。 3H )。总的来说，这些数据表明了一个逐步的过程，在这个过程中，PARP 1最初被PIAS 4所取代，然后是STUbLRNF 4驱动的泛素化。
P97与改性陷阱PARP 1的相互作用 虽然上述实验表明PARPI捕获PARP 1与随后的PARP 1 SUMO化和泛素化有联系，但这些修饰的功能意义仍有待确定。我们的质谱分析表明，在PARP 1-捕获条件下，PARP 1与p97之间的相互作用增强。p97是一种ATP酶，参与从染色质中去除泛素化底物蛋白。因此，我们推测被捕获的PARP 1的SUMO化和泛素化是从染色质中摄取p97 ATP酶和去除被捕获的PARP 1的必要前奏。
我们证实了p97和PARP 1之间的相互作用(PLAS；图1)。 4A )和免疫共沉淀实验(扩展数据图)。 6A )。然后，我们证实PARP 1-p97的相互作用在PARP 1野生型细胞中以诱捕依赖的方式增强，而在表达DNA结合缺陷的PARP 1突变体的细胞中没有增强。 4B，c )。UKTT 15，但不是veliparib，也导致PARP 1-p97相互作用增加，与PARP 1的催化抑制相反，PARP 1捕获对这种相互作用很重要。 6B
图4：PARP 1与p97以诱捕依赖的方式相互作用。 a 、PLA对CAL 51细胞内源性PARP 1和p97的影响。 b 在DNA损伤后，PARP 1-p97相互作用增强。表达PARP 1的CAL 51细胞 威汤哥 -EGFP或PARP 1 Del.pK119S120 EGFP暴露于诱捕条件下，PARP 1-GFP在自然条件下免疫沉淀。数据代表两个生物复制。 c ，PARP 1-p97 PLA(抗PARP 1和抗p97)在表达PARP 1的CAL 51细胞中表达。 威汤哥 -EGFP或PARP 1 Del.pK119S120 -EGFP。给出了几何平均和95%置信区间(CI)； n =2,016个来自三个独立实验的细胞。 d 、PARP 1-p97 PLA在CAL 51细胞中的诱捕作用。PLA单用p97抗体(顶)或p97+PARP 1抗体(下)。 a ,d ，鳞片，5μm。数据代表三个生物复制。 e ，聚乳酸的数量 d 。给出了几何平均和95%CI； n =2,035个来自三个独立实验的细胞。 f P97的抑制增加了泛素化的PARP 1的存在。表达Ub-Strep-HA的HEK 293细胞在10μM CB-5083存在或不存在的PARP 1-捕获条件下培养，泛素化蛋白在变性条件下免疫沉淀(见扩展数据图)。 6C 对于输入控件)。数据代表三个生物复制。 g ，将野生型p97-Myc或p97p.E578q-Myc转染HEK 293细胞，转染标志-PARP 1结构，并加入染色质组分的诱捕条件和PARP 1免疫共沉淀条件。数据代表两个生物复制。 h ，表达PARP 1的CAL 51细胞 威汤哥 -EGFP或PARP 1 Del.p.119K120S -EGFP转染p97 E578Q-Strep-Myc 18 h，在诱捕条件下进行分馏。用检测内源性和外生表达p97的抗体检测染色质PARP 1-EGFP免疫共沉淀物。数据代表两个生物复制。 i PARP 1-p97共定位被泛素化(5μM mln-7243)或SUMO基化(1μM ML-792)抑制剂所抑制.PARP 1-p97 PLA(抗PARP 1和抗p97)病灶数。给出了几何平均和95%CI； n =1,316个来自三个独立实验的细胞。 c ,e ,i , ****P < 0.0001; NS, not significant; ordinary one-way analysis of variance (ANOVA). j ，p97适配器UFD 1介导p97与被捕获的PARP 1之间的交互。染色质结合免疫共沉淀。数据代表三个生物复制体：sicon，控制短干扰RNA(SiRNA)；siudd 1，sirna to。 民主联盟1 ；和siNPL 4，siRNA到 NPL 4 . k ，按 j ，PARP 1-p97相互作用被P97固存剂CUET破坏。数据代表两个生物复制。EV，空载体；IP，免疫共沉淀；WB，westernblot；WT，野生型。
源数据
Cb-5083是一种小分子，能抑制p97 ATP酶的活性，并诱导p97底物捕获效应。 29 我们发现CB-5083引起PARP 1-p97相互作用增加(图1)。 4D，e )，提示PARP 1可能是p97底物。阻断p97的催化活性导致其底物泛素化异构体的积累。 30 ,31 ，这也是被困的PARP 1的情况(图1)。 4F )。在变性条件下，PARP 1的相互免疫共沉淀也观察到了这一点。 4F 以及扩展数据图。 3B，c )。我们通过表达一个p97显性阴性的p97突变体(p.E578q)，复制了p97抑制的底物捕获效应。 18 ,32 ,33 (无花果) 4G )，与捕获的PARP 1是p97底物一致。此外，我们还证明了p97p.e578q突变体的表达增强了prp1-p97的相互作用。 PARP 1 –/– 用野生型PARP 1重组的细胞，但不含诱捕缺陷的PARP 1。 Del.pK119S120 (无花果) 4H )。这一结论得到了共定位免疫荧光实验的进一步支持，其中p97 p.E578q和捕获的PARP 1病灶。 34 被发现有很大的重叠(扩展数据图)。 6d
泛素化是p97相互作用的介质。 6 ,7 。当细胞暴露于泛素化(mln-7243)或SUMO基化(ML-792)抑制剂(这减少了捕获PARP 1泛素化)时，如图所示。 2E )，PARP 1-p97相互作用减弱(图1)。 4I 以及扩展数据图。 6E )。P97使用NPL4-UFD1复合物识别和处理其泛素化的底物，NPL 4和UFD1中的泛素结合结构域主要起泛素结合受体的作用(参考文献1)。 35 ,36 )。当UFD 1耗尽时，被捕获的PARP 1和p97之间的相互作用减少(图1)。 4J )。当NPL 4被耗尽时，情况就不是这样了，尽管，正如预期的那样，任何一个亚基的耗尽都减少了p97对染色质的整体吸收(图一)。 4J )。此外，只有UFD 1的耗尽导致被捕获的PARP 1的大量积累(图1)。 4J )。这表明，被捕获的PARP 1的加工是UFD 1，而不是NPL 4依赖的。尽管按照规范，udd 1被认为是npl 4的一种特殊的异二聚体，但这些观察结果似乎与先前的工作相一致，表明npl 4和udd 1可以相互独立地识别底物。 7 ,8 ,10 。我们还评价了被批准的滥用酒精药物二硫苯并呋喃的代谢物cuet的效果，该药物通过破坏npl 4锌指基来将p97从染色质中分离成不活跃的团块。 37 ,38 因此，它充当了一个使整个p97池失活的工具。与cb-5083相比，cet具有与cb-5083不同的作用机制，因为它能通过形成团聚体而使p97池失活。 NPL 4 -或 民主联盟1 -基因沉默。我们发现，PARP 1-p97的相互作用几乎完全被CUET暴露所消除(如图所示)。 4K )。这些观察表明，p97系统及其泛素结合辅助因子ufd 1(p97-uf1)识别被捕获的PARP 1，并与其相互作用。
捕获PARP 1受p97活性调控 我们采用了“陷阱追逐”的实验方法来评估p97是否能从染色质中清除被捕获的PARP 1(图1)。 5A )。细胞经MMS+PARPI诱导诱捕(TRAP)后，在含有PARPI和p97-复合物抑制剂(Case)的新鲜培养基中培养。通过染色质分馏或测量PARP 1与磷酸化H2AX(γH2AX PLA)的接近程度来评估捕获PARP 1的数量。 39 )在追逐过程中的不同时间点。首先，我们跟踪了捕获的PARP 1在 PIAS 4 –/– 和 RNF 4 –/– 细胞(图1. 3A，d )。双管齐下 PIAS 4 –/– 和 RNF 4 –/– 细胞对染色质结合的PARP 1的解析度较慢，尤其是在后期(如图所示)。 5B，c 以及扩展数据图。 7a，b )，这与这种相扑/泛素连接酶促进被捕获的PARP 1复合物的解离的观点是一致的。
图5：PARP捕获由PIAS4-RNF4-P97轴调制. a ，陷阱追踪实验原理图。 b ，被捕获的PARP 1是以PIAS 4依赖的方式处理的。野生型捕猎实验 PIAS 4 –/– HCT 116细胞PARP 1诱捕后，细胞在含他拉唑巴布的培养基中被追逐。在指定的时间点采集样品进行染色质分馏和Westernblotting。 c ，被捕获的PARP 1是以依赖于RNF 4的方式处理的。野生型捕猎实验 RNF 4 –/– MCF 7细胞 b . b ,c ，数据表示两个生物复制。WB，Westernblot，WT，野生型。 d 、PARP 1-γH2AX PLA陷阱追踪实验的典型共焦显微图像。 e ，PARP 1-γH2AX PLA病灶持续存在于PARPI加p97抑制剂的细胞中。年陷阱追踪实验中PARP 1-γH2AX PLA(抗PARP 1+抗γH2Ax)焦点的数目 d ; n =5,736个来自三个独立实验的细胞。 f ，PARP 1-γH2AX PLA焦点在RNF 4沉默的细胞内持续存在。聚乳酸焦点数 n =1,235个来自三个独立实验的细胞：sikon，控制siRNA；sirff 4，siRNA，to RNF 4 . g ，PARPI诱导的RAD 51和γH2AX病灶持续存在于p97抑制剂的存在下。有代表性的共聚焦显微镜图像来自陷阱追逐实验(TRAP，Talazoparib过夜；Chase，含p97抑制剂的介质)。γ、H2AX和RAD 51病灶染色。黑匣子代表的是在他拉唑巴利治疗后被追逐的细胞，与前两列不同，后者没有经过他拉唑巴布的预处理。 d ,g ，鳞片，5μm.DMSO，二甲基亚砜. h ,i ，γH2AX( h )和RAD 51焦点( i )从实验中 g ; n =1750个来自三个独立实验的细胞。 e ,f ,h ,i 给出了几何均值和95%CI。**** P < 0.0001; NS, not significant; ordinary one-way ANOVA.
源数据
然后，我们用此方法研究了p97活性的作用，包括他拉唑巴布+CB-5083或CUET在实验的追逐阶段，并通过染色质分馏监测捕获的PARP 1(扩展数据图)。 7C )或解放军(如图所示)。 5D )。经MMS+Talazoparib处理后，在γH2AX附近检测到大量PARP 1。 5D 实验的“陷阱”部分是成功的，除去诱捕剂后，被捕获的PARP 1数量减少(例如，PARP 1-γH2AX PLA信号消失)。PARP 1-γH2AX PLA信号在一种药物(即PARPI或p97抑制剂)存在时也会减弱。相反，当细胞在两种抑制剂--PARPI(Talazoparib)和p97抑制剂(CB-5083或CUET)存在的情况下被追逐时，被捕获的PARP 1数量仍然存在(图1)。 5D，e )。与RNF 4是参与被捕获PARP 1加工的上游因子的观点一致，我们还发现 RNF 4 导致PARP 1-γH2AX PLA病灶的持续存在。 5F )。此外，我们还评估了一个显性阴性RNF4p.M136S/R177A突变体的表达对PARP 1诱捕的影响(扩展数据图)。 7D )，一个p97 p.E578Q突变体(扩展数据图)。 7e-g )或UFD 1耗尽(扩展数据图)。 7H )。这三种干预措施都导致了染色质部分中更高水平的被捕获PARP 1，证实了这些蛋白在捕获PARP 1加工过程中的重要性。
在同源重组熟练的细胞中，捕获的PARP 1激活RAD 51介导的DNA修复，通过评估核RAD 51病灶来监测。γH2AX和RAD 51细胞暴露16h后，γH2AX和RAD 51病灶减少，当PARPI通过洗涤从培养液中去除时，γH2AX和RAD 51病灶减少，提示被捕获的PARP 1所致的DNA损伤已得到解决(如图1所示)。 5G-I )。当我们在这个追逐期使用p97抑制剂(CB-5083或CUET)时，γH2AX和RAD 51病灶持续存在，表明潜在的被捕获的PARP 1相关损伤无法得到有效的解决。仅在p97抑制剂存在下孵育细胞未诱导γH2AX和RAD 51灶，提示γH2AX和RAD 51病灶在PARPI实验中的持续存在，其次为p97抑制剂，确实是由PARPI引起的。对病灶分辨率的影响也不能通过细胞周期的改变来解释，因为细胞在p97抑制剂作用3h后，细胞周期分布没有明显变化(扩展数据图)。 8a，b )。我们还注意到，当我们使用荧光恢复后光漂白(FRAP)监测PARP 1的交换。 威汤哥 -EGFP在有PARPI存在的紫外激光条纹上 40 ，p97抑制剂(cb-5083)的加入使frap(Prp 1)略有减慢。 威汤哥 -EGFP-恢复的一半时间( t 1/2 )在他拉唑巴存在时为4.9±1.3 s，而在他拉唑巴布+cb-5083存在时为7.8±1.4 s； t -测试 P < 0.05; Extended Data Fig. 8C，d
P97抑制增强PARPI细胞毒性 基于前面描述的长时间的PARP 1-捕获效应，我们推测p97抑制对PARPI的细胞毒性作用有调节作用。我们评估了两种p97抑制剂(CB-5083和CUET)对两种诱捕PARPI(他拉唑巴布和奥拉帕瑞布)细胞毒性的影响，并观察到p97抑制剂的存在对每个PARPI的致克隆作用具有剂量依赖性的增强作用(图1)。 6A-c )。Bliss独立性分析证实，这些药物在联合使用时会产生超加性效应(扩展数据图)。 9a，b )。这种组合效应是PARP 1-捕获依赖的，因为它在 PARP 1 –/– 细胞(图1. 6A 以及扩展数据图。 9C，d P97在DNA修复中可能发挥的其他作用。此外，p97抑制剂(在以前的PARPI组合实验中使用的浓度)对烷基化剂MMS或替莫唑胺的敏感性也没有提高。 PARP 1 威汤哥 或 PARP 1 –/– 细胞(图1. 6d，e )。这意味着p97在烷基化DNA损伤修复中可能发挥的其他作用不太可能解释它从染色质中清除被捕获的PARP 1的能力，以及此后CB-5083/CUET对PARPI的敏化能力。
图6：抑制p97增强了PARPI的作用。 a P97的抑制增强了PARPI的细胞毒性。CAL 51细胞在p97抑制剂(CB-5083或CUET)存在下暴露于PARPI(左)或奥拉帕立(右)，共14d，100 NMCB-5083和8 NMCUET暴露于CAL 51细胞。 b ,c ，cb-5083的药物反应曲线( b )和CUET( c )。另见扩展数据图。 9a，b d ,e 用于诱导PARP 1诱捕的DNA烷基化剂并不能增强CB-5083的细胞抑制作用。 PARP 1 威汤哥 和 PARP 1 –/– CAL 51细胞暴露于烷化剂MMS( d )或替莫唑胺(TMZ)； e )与他拉唑巴利(阳性对照)或CB-5083联合作用7d后，测定细胞活力。 f ，cb-5083对PARPI的合成杀伤作用有调节作用。 BRCA 2 –/– 细胞。年从克隆性生存分析中获得的存活曲线 BRCA 2 威汤哥 和 BRCA 2 –/– 不同剂量的CB-5083和他拉唑巴布处理DLD 1细胞。菌落形成图像和量化显示在扩展数据图中。 9E g 抑制p97可使小鼠肿瘤细胞对PARPI敏感。WB1P乳腺癌细胞器 BRCA 1 和 p53 功能缺失突变在指示药物存在下培养7d，在扩展数据图中显示器官的明亮视野图像。 9F h ，抑制p97使人敏感 BRCA 1 -突变型乳腺癌细胞器至PARPI。KCL014BCPO在指示药物中培养7d，在扩展数据图中显示这些细胞器的亮场图像。 9g b –h ，数据为平均±S.D。三个生物复制体。 i ，被困PARP 1的处理模型。PARP 1在DNA上被PARPI的存在所捕获，是一个逐步处理的过程。它最初以PIAS 4依赖的方式被SUMO化，然后以RNF4依赖的方式泛素化。P97通过UFD 1结合到泛素链上，p97的ATP酶活性从染色质中提取修饰的PARP 1。二甲基亚砜。
源数据
由于PARPI被批准用于治疗有同源重组缺陷的癌症，而捕获的PARP 1是同源重组缺陷细胞中的关键细胞毒性事件，因此我们评估了在ddd 1细胞中联合暴露CB-5083+talazoparib对DLD1细胞的影响。 BRCA 2 。单独使用时，cb-5083的含量较低。 BRCA 2 综合致死效应(扩展数据图)。 9E )，但它对 BRCA 2 –/– DLD1细胞比等基因野生型细胞 BRCA 2 (BRCA 2 威汤哥 )细胞与他拉唑帕林联合使用时(如图所示)。 6f 以及扩展数据图。 9F，g )。从小鼠体内提取的有机化合物 BRCA 1 和 TP 53 功能缺失突变(WB1P) 41 我们发现CB-5083进一步致敏肿瘤器官对他拉唑巴利(图一)。 6g 以及扩展数据图。 9H )。我们还评估了cb-5083和PARPI在一例三阴性乳腺癌患者来源的细胞器培养中的作用，该细胞含有致病菌BRCA 1 p.R 1203*突变。 BRCA 1 C.3607C>T)，在细胞器中为纯合子。CB-5083导致他拉唑巴利的敏感性发生显著变化(图1)。 六小时 以及扩展数据图。 9I P97抑制可能增强PARPI在人肿瘤细胞中的作用。
