5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞耐药性的影响

二维码

发表时间：2022-01-14 10:24作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

药物耐受性的机制仍然缺乏了解，并已与基因组相关，但也与非基因组过程。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是肿瘤学中应用最广泛的化疗药物，与耐药有关.作为DNA复制的抑制剂，5-Fu改变了所有的RNA途径.在这里，我们表明，5-氟尿嘧啶处理导致氟化核糖体的产生，表现出改变的翻译活性。5-Fu被整合到肿瘤细胞、结直肠移植物和人类肿瘤中成熟核糖体的核糖体RNA中.氟化核糖体似乎是功能性的，然而，根据其5‘-非翻译区域的性质，它们显示出对mRNAs的选择性翻译活性。因此，我们发现持续的翻译IGF-1RMRNA编码最有效的细胞存活效应之一，促进了5-氟脲嘧啶(5-Fu)处理的大肠癌细胞的存活.总之，我们的结果表明，“人造”氟化核糖体通过促进存活基因的翻译，有利于耐药细胞表型。

导言

对化疗的部分反应会导致疾病的复发。在治疗过程中，一种称为耐药细胞的癌细胞亚群表现出一种暂时性的耐药能力，导致了治疗耐药性。1,2。虽然对药物耐受性的机制了解甚少，但它们与非基因组过程有关，包括表观遗传学、树干和休眠。2,3,4.

翻译调控在控制基因表达方面起着重要作用，并导致包括癌症在内的疾病的发生。5,6。在核糖体中，核糖体RNA(RRNAs)通过监控密码子的识别、协调核糖体亚基活性和通过其核酶活性催化肽键的形成，在翻译过程中起着核心作用。RRNAs含有200多个自然发生的化学修饰，它们稳定rrna的结构，并产生非修饰核苷酸所不提供的额外的分子相互作用。7,8,9。RRNAs的化学修饰被证明直接有助于翻译调节。6,10,11。我们和其他人表明rrna化学修饰有助于核糖体功能的微调和对癌细胞核糖体翻译活性的调节。12,13,14,15。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是肿瘤治疗中应用最广泛的化疗方法.5-氟尿嘧啶的药效是部分的，通常与抵抗有关。16。5-Fu虽然被发现并被用作dna复制的抑制剂，但它改变了所有的rna途径。16,17,18,19,20。事实上，5-Fu处理导致5-氟尿嘧啶(5-Urd)掺入到包括rrna前体在内的各种细胞rna中。16。然而，在核糖体RNA前体中掺入5-FURD对核糖体产生和功能的影响尚未得到分析，其对细胞表型的影响也没有得到分析。在此，我们发现5-Fu在多种模型中被整合到成熟核糖体的rRNAs中，包括癌细胞、小鼠异种移植和人结直肠肿瘤标本。含有5-Fu的核糖体似乎具有功能，但根据其5‘-非翻译区的性质，它们对mRNA亚基有选择性的翻译活性。我们发现，在5-Fu处理下，促进生存的mRNA的翻译。IGF-1R基因是持续的，并促进5-氟尿嘧啶处理的结直肠癌细胞的生存.总之，我们的结果表明，氟化核糖体通过促进存活基因的翻译而有利于耐药细胞表型。

结果

5-Fu处理可部分维持核糖体的产生。

先前的研究表明，在高浓度时，5-Fu能改变核糖体的生物发生，而不会抑制rrna的合成。20,21。为了进一步研究这一问题，我们对临床相关浓度为5-Fu(10-50 M)的大肠癌HCT 116细胞进行了治疗。22,23，导致生长抑制和细胞死亡。24和补充图。1A)。在此浓度范围内，5-Fu处理可导致核仁增大，核仁帽形成，核仁标记物分散，而RNA POL I抑制剂放线菌素D处理的细胞则相反。1A和补充图。1B，c)。这种核仁重组揭示了核糖体生物发生的改变，尽管没有前rRNA合成的抑制，并通过透射电镜证实(补充图)。1D)。经5-Fu处理后，经Northern杂交和RNA荧光原位杂交(FISH)分析，47个S/45S前rRNA水平不变，证实5-Fu不影响RNA PolⅠ活性。1B和附图。1E，2A，b).

Northern杂交分析也证实了核糖体在转录后阶段的成熟发生了改变，并表明在第2位点(补充图)，rRNA的前处理受到了损害。2A-C)。然而，尽管有这样的影响，导致18 S和28 S rRNA的晚期rRNA中间体仍然被检测到(补充图)。2C)表明核糖体的产生在一定程度上是维持的。这一点得到[32脉冲追逐实验表明，在5-Fu处理下，核糖体的产生时间可达48小时(如图所示)。1C和补充图。二维空间)。因此，在临床相关浓度为5-Fu的情况下，尽管严格的质量控制，核糖体的每一步加工都能够进行，从而使核糖体的生产得以维持在相当高的水平。

5-氟尿嘧啶与核糖体结合

5-Fu曾被证明被转化为5-futp并被整合到RNAs中。16。因此，我们想知道核糖体是否在其rRNAs中含有5-FURD，并将其输出到细胞质中。为了检验这一点，我们发展了一种定量液相色谱-质谱-高分辨质谱(LC-MS-HRMS)方法，使我们能够在500毫米KCl蔗糖垫上测定5-FURD结合到细胞质核糖体rRNA中的数量。2A，有关详细信息，请参阅方法。25)。我们发现HCT 116核糖体含有大量的5-FURD，经5-100 M的5-Fu处理24h后，每核糖体含有7-14个5-FURD分子。2B)。我们进行了两个实验，排除5-FURD信号来自非核糖体RNA.首先，我们从凝胶纯化的18 S和28 S rRNA(补充图)中测定了5-FURD.3A)从其它细胞RNA中分离出18 S和28 S rRNA。其次，由于在500 mm KCl蔗糖垫上直接纯化核糖体可能导致少量的mRNA污染，我们测定了与普罗霉素解离的核糖体亚基中的5-FURD。3B，c)。我们的数据表明，普罗霉素处理核糖体亚基完全解离了少数亚基，这些亚基经直接纯化后仍在500毫米KCl蔗糖垫上组装(附图)。3B)。与在500 mm KCl蔗糖垫上直接纯化的核糖体亚基相比，用普罗霉素分离的核糖体亚基中每核糖体5-FURD的数量是相同的(附图)。3C)，表明我们的方法得到的数据反映了5-FURD掺入rRNA的情况.接下来，我们将分析扩展到其他癌细胞株上：(I)CRC细胞具有不同的分子图谱，反映不同的病理特征，显示不同的组合。克拉斯, BRAF和TP 53突变，微卫星不稳定性(MSI)和CIN状态(补充表)1)和(Ii)三阴性乳腺癌细胞株和(Ii)胰腺癌细胞系。5-FURD经10 M-5-Fu处理24h后，将5-FURD结合到纯化的细胞质核糖体rRNA中(图5-Fu)。2C)。总之，这些数据表明，经过5-Fu处理后，含有氟化rRNA的核糖体被完全组装并输出到细胞质中，表明细胞的质量控制系统能够耐受5-FURD的存在。

接下来，我们研究了体内肿瘤中是否能发现含氟核糖体。首先，我们分析了HCT 116裸鼠移植瘤的rRNA。5-Fu治疗效果的证明是肿瘤生长减少(补充图)。三维空间)。最后一次治疗后从肿瘤细胞收集的成熟rRNA中检测到5-FURD，其水平接近培养细胞的水平(见图)。二维空间)。我们将这一观察扩展到类似于HT 29和SW 480细胞株的异种移植物(如图所示)。2E，f)。因此，5-氟尿嘧啶掺入核糖体可以复制在一个普通的异种移植动物模型.最后，我们分析了以5-Fu为基础的治疗患者大肠癌细胞的rRNA，并利用大量的RNA来优化检测(补充图)。3E)。在5-氟尿嘧啶治疗的5例标本中，有2例在rRNA中检出5-FURD(每核糖体分别为3.80和4.50 5-FURD)。2G)接受5-氟尿嘧啶治疗的病人作为阴性对照。总之，这些数据表明5-FURD被大量地整合到5-Fu处理的细胞的rRNA中，而基于5-Fu的化疗导致在动物模型和人类肿瘤细胞内产生氟化核糖体。

氟化核糖体改变翻译

因为rRNAs及其转录后化学修饰在核糖体功能中起着核心作用，因为5-Fu诱导了翻译调节的改变。24,26,27我们推测氟化核糖体可能表现出修饰的翻译活性。为了研究这一问题，我们首先考虑了在翻译过程中是否可以将氟化核糖体加入到mRNA上，通过分析蔗糖梯度法(图1)对核糖体进行主动翻译时rRNA 5-FURD的含量。3A和补充图。4)。在积极翻译核糖体(即多体核糖体)中容易检测到5-Fu，表明氟化核糖体可以进行翻译(图1)。3A)。接下来，我们评估了5-Fu掺入rRNA是否影响核糖体的翻译能力。我们使用我们最近开发的体外杂交翻译试验。14,28，其中只有核糖体暴露于5-Fu，以评价纯化的氟化核糖体在控制环境下的活性(图1)。3B)。为了了解核糖体活性的变化，用一组不同功能的荧光素酶报告mRNAs评价了氟化核糖体的翻译能力，其翻译依赖于不同的5‘UTR：(I)来自珠蛋白和GAPDH mRNAs的两个含有短5’UTR的管家基因的mRNAs，(Ii)来自IGF-1R和c-Myc mRNAs的5‘UTR的促癌基因的mRNA，以及(3)两个病毒基因的mRNA，它们含有来自蟋蟀麻痹病毒(CRPV)和脑脊髓炎病毒(MCEV)的长且结构化的未捕获5’UTR的病毒基因，它们通过一个内部核糖体进入位点启动翻译。结果表明，氟化核糖体的翻译不受损伤。第二，它们表现出与对照核糖体不同的选择性翻译起始效率，并根据所使用的报告mRNA上游5‘UTR的性质而不同(图5’UTR)。3C)。事实上，珠蛋白和GAPDH的翻译效率较低，这一结果与5-Fu处理的细胞蛋白质合成降低的结果一致。24，以及附图。5A)。此外，含有IGF-1R和C-Myc5‘-UTR被氟化核糖体翻译的效率更高。这些差异表明，5‘UTR的翻译效率随5’UTR的性质而不同，说明氟化核糖体的翻译起始步骤与正常核糖体不同。为了巩固这一假说，我们在一个携带CRPV基因间IRES的mRNA上进行了翻译测试，该基因是一个直接与核糖体结合的元件，在没有任何细胞翻译起始因子(EIFS)的情况下启动翻译。氟化核糖体在CRPVmRNA上的翻译活性降低，强烈支持氟化核糖体在结构或功能上的不同(图1)。三维空间)。CRPV基因间IRES翻译起始的这一缺陷与不依赖于帽的启动机制无关，因为氟化核糖体在翻译含有mRNA的EMCV IRES时效率更高，这是另一种与帽无关的翻译起始模型(图)。三维空间).

接下来，我们关注的是IGF-1R5‘UTR是人类基因组中最长的5’UTR之一，含有多种调节元件，其活性可能受到5-Fu的影响，其中包括IRES元件。29,30。首先，我们将IRES元素映射为IGF-1R5‘UTR通过进行一系列删除(补充图。5B，c)，并将其定位在最后的84个核苷酸(954-1040区)，并验证了1-953区没有IRES活性，这与以前的研究结果一致。29。在5-Fu处理的细胞中，IRES活性IGF-1R当使用全长5‘UTR或仅使用最小IRES(区域954-1040)时，5’UTR均有所增加(如图所示)。3E)。相反，对1-953区(∆IRES)没有观察到任何影响。此外,C-MYC5‘UTR IRES活性未受影响(附图)。5D)，表明某些IRES元素的活动不受5-Fu和C-MYC翻译涉及到另一种机制。以确定IRES元素是否可以在IGF-1R翻译调节，我们用单顺反子法测试同样的结构，其中5‘UTR直接放置在报告mRNA的5’端，并盖上(图1)。3F)。我们发现，5-Fu处理后，全长5‘UTR和最小IRES的翻译活性均有显著提高，1-953区的翻译活性显著提高。IGF-1R5‘UTRGAPDH5‘UTR不受5-Fu的显著影响，但我们观察到高浓度的5-Fu有下降的趋势(图1)。3F).

总之，这些实验表明，5-Fu掺入rRNA可以改变核糖体从不同的5‘UTR启动mRNA翻译的能力。总之，他们强调，氟化核糖体可能有助于5-Fu诱导的翻译重新编程，这是我们之前观察到的。24.

IGF-1R促进5-Fu耐药

上述数据表明，氟化核糖体有利于翻译选定的mRNAs，包括诸如IGF-1R和C-Myc，这可能促进细胞早期存活并导致抵抗力。4,31,32。我们专注于IGF-1R一种在肿瘤发生中起主要作用的基因，其对细胞存活的贡献已在包括结直肠癌在内的各种模型中得到了很大程度的证实。31,33,34,35。因为5-Fu处理会导致全球蛋白质合成减少(24，补充图。5A)，我们最初评估了是否IGF-1R5-Fu对HCT 116细胞的mRNA翻译也有影响。IGF-1R通过检测对照组和5-氟脲嘧啶处理细胞中细胞质mRNA的吸收量来评价mRNA的翻译效果(见图)。4A和补充图。6)。我们的数据显示IGF-1R5-Fu处理的细胞中存在与重蛋白多体相关的mRNAs，而肌动蛋白和GAPDH mRNAs的mRNAs表达减少，表明IGF-1R与内务管理的mRNAs相比，mRNA有选择性地受到青睐，这一结果与报告mRNAs获得的体外翻译数据一致(见图)。3C)。在蛋白水平上，5-Fu处理24h和48h后，肌动蛋白、GAPDH和组蛋白H3蛋白水平相对稳定，IGF-1R水平升高(图二)。4B，c)。接下来，为了确定IGF-1/IGF-1R通路是否对5-Fu暴露的CRC细胞的存活有影响，先用5-Fu处理24小时或48h，然后再用IGF-1处理。5天后监测细胞增殖，发现IGF-1对对照细胞无影响，但对5-Fu处理的细胞生长有促进作用(图1)。4D，e，以及附图。7A)。为了进一步验证我们的发现，hct 116细胞被5-Fu和iGF-1R激酶抑制剂nvp-AEW 541共同处理。36，用活率法检测细胞的反应(图一)。4F)。与未处理细胞相比，与未处理细胞相比，抑制IGF-1R对细胞存活率的影响更大，表明5-Fu处理细胞比未处理细胞更依赖于激活的IGF-1/IGF-1R通路，而IGF-1/IGF-1R通路是细胞对5-Fu耐受的最佳途径。总之，我们的结果揭示了在5-Fu作用下，IGF-1/IGF-1R通路在细胞亚群的存活中起作用，并强烈支持5-Fu驱动的IGF-1R合成的维持作用。

图4：胰岛素样生长因子-1R对5-氟尿嘧啶处理的大肠癌细胞的存活和恢复有促进作用.

5-Fu处理导致细胞存活相关mRNAs的翻译上调

接下来，我们想知道5-Fu诱导的翻译改变是否能促进与细胞存活或药物耐受性相关的细胞功能。5-氟尿嘧啶(5-Fu)对10 M或50 M5-Fu作用24h的细胞进行多体分析，评价5-Fu对细胞mRNA翻译的影响(附图)。8A，补充图。9)。简单地说，与积极翻译核糖体相关的mRNAs(即多聚体)被纯化(补充图)。8B)并进行RNA-Seq分析，比较5-Fu处理细胞与未处理细胞各转录本的多体水平(图1)。5A，b，补充数据1)。我们发现，5-氟尿嘧啶处理改变了部分mRNA的翻译，分别占被分析的mRNAs的7%和10%，分别占10 M和50 m5-Fu处理细胞的7%和10%。5A，b)，大多数翻译改变的mRNA被上调(10 M，702上升，275下降；50 M：937上升，477下降，分别占72%和66%)。在10~50μm~50 m5-Fu条件下，差异翻译的mRNAs数量增加(977 Vs 1414)，这些mRNAs大多是这两种条件下常见的，表明存在剂量依赖性反应(图1)。5C)。基因本体(GO)对所有翻译改变的mRNAs进行的浓缩分析(图1)。5D，补充图。8C和补充数据2)10μm和50μm处理细胞表现出相似的Go期富集现象。P53途径的富集、DNA损伤反应和凋亡均有明显的表现，这反映了众所周知的5-Fu的细胞毒活性。接下来，对GO术语进行聚类，其中Go术语与相同的函数相关(如图所示)。5E，f结果表明，在50 m5-Fu作用下，下调的mRNAs主要对应于反映细胞增殖的基因类别，如细胞周期或细胞和细胞器的生物发生，也与应激诱导的增殖停止相一致(图1)。5E，补充数据3)。有趣的是，大多数翻译改变的mRNAs在10 M和50 m5-Fu条件下都被上调。5A，b)。这些转录上调的mRNAs与促进细胞存活的生物学功能有关，如新陈代谢、细胞通讯、信号转导和意外的细胞表型变化(如发育、形态发生或细胞分化)(图一)。5F和补充数据3)。这一观察强调，在翻译水平上，当观察到与细胞周期阻滞和细胞死亡相关的应激反应时，促生存相关的通路被同时上调。因此，我们专门寻找可能有助于细胞存活的基因。为此，我们建立了促进细胞存活和肿瘤进展的基因列表，包括与CRC突变或拷贝数改变相关的基因，或与凋亡负调控因子和细胞周期功能正调控因子相关的基因。有趣的是，编码存活蛋白的mRNAs在翻译上调的mRNA类别中比在翻译下调的mRNAs中发现的要多，无论是在10 M和50 M 5-Fu条件下(10 M，上升27比18下降；50 M：38 vs 30，补充数据)。4)。事实上，转录上调的mRNAs存活基因的细胞功能主要是凋亡负调节因子、细胞周期正调控因子和细胞信号因子(补充数据)。5)。总之，这些数据表明，5-Fu处理会导致编码具有细胞存活功能的蛋白的mRNAs翻译量意外增加，这可能有助于观察到的一组细胞的药物耐受性。

讨论

在本研究中，我们发现嘧啶类似物5-Fu在体外和体内都被整合到核糖体中，包括在人类肿瘤中。我们使用了最近开发的LC-HRMS方法。25目的：定量测定5-FURD在RNA分子中的掺入量.这一方法使我们能够证明5-FURD在显著水平上与核糖体结合，表明细胞能够耐受非天然核糖体的产生。这一发现出乎意料，因为核糖体的组装和成熟需要rrna-rrna和rrna-蛋白质的多个相互作用和rrna折叠，而rrna折叠可能受到5-furd的限制或抑制，而且由于这些步骤受到严格的质量控制，导致不正确折叠和组装的rrna降解。37，正如我们在本研究中报告的前rRNA物种水平的下降所证明的那样。可以预见，5-FURD只在成熟核糖体的rRNA区富集，而rRNA的存在并不显著抑制rRNA的成熟和折叠。因此，细胞质功能核糖体包含多达15个5-FURD的每核糖体分子，这一数字可能被低估，因为只有一小部分核糖体群体在我们实验的时间框架内被更新。我们观察了5例人CRC标本中2例rRNA中的5-FURD，提示在肿瘤核糖体中可出现5-Fu掺入。我们排除了在3份样品中缺乏5-FURD检测的可能性，这是由于我们测定的灵敏度阈值所致。这是可能的，只有在某些肿瘤发生，取决于肿瘤细胞代谢或其他分子特征，仍有待确定。此外，其他参数可能影响5-Fu的掺入和检测，如化疗方案或治疗与手术之间的延迟。由于这些原因，而且由于我们的分析是在少数样本上进行的，因此在现阶段我们无法推断合并的频率。最重要的是，我们还需要确定5-Fu掺入肿瘤细胞核糖体与肿瘤对治疗的反应和疾病结局之间是否存在联系。虽然在rRNA中加入氟会导致一种非自然的修饰，并且可以被认为是有害的，但我们发现氟化核糖体在进行翻译时是有功能的。然而，它们的活性被改变，并表现出根据其5‘UTR的性质启动mRNA翻译的选择性能力。氟似乎改变rRNA功能的发现并不出人意料，因为rRNA的化学修饰，包括2‘-O-甲基化和假铀化，表明(I)有助于翻译调节和效率。13,14,15,38和(Ii)建立不能由非修饰分子提供的分子相互作用。7,9。我们观察到的翻译起始效应表明，5-FURD掺入丰富或接近核糖体中对核糖体与mRNA或翻译因子相互作用至关重要的区域，或在核糖体的功能域，如A、P和E位点。因此，如果在核糖体的特定区域存在，即使是数量有限的5-FURD分子也会对核糖体的行为产生很大的影响。例如，在IRES依赖翻译的情况下，5-furd可能被选择性地富集在rps 25、rpl 40或RACK 1蛋白附近的rrna区域，这些区域被证明参与了ires依赖的翻译。39,40,41，或在提议支持IRES翻译的18个SRRNA区域内，例如扩展段ES7。42或959-964区域，该区域被提议与ibf-1rmRNA相互作用。43。新的工具将需要精细地映射5-FURD在rRNA中的位置，并提高我们对其在原子水平上对核糖体功能的影响的理解。

我们之前描述了5-Fu在结直肠癌细胞中诱导的一种主要的翻译重组，它与miRNA的机制有关。24。在这里，我们描述了5-Fu诱导的翻译重新编程的RNA-Seq-基础上的多体分析。5-氟尿嘧啶暴露后，大多数翻译改变的mRNAs被上调，表明5-Fu允许维持或增加这些mRNAs的翻译。本文中描述的rrna的氟化是另一种机制，通过这种机制，5-Fu有助于细胞的翻译重新编程。24。除了以miRNA为基础的翻译调控外，IRES依赖的翻译还出现了另一种机制，即5-Fu可以对其进行调节.IRES-专门的全基因组分析将是必要的，以评估哪些ires元素可能对5-Fu敏感。44。还可能涉及其他机制，如5-FURD与mRNAs和tRNAs的结合.

我们确定，5-Fu改变的翻译机制有助于维持表达水平。IGF-1R基因，从而促进细胞存活。这表明，如果阻止氟化核糖体的产生，5-Fu的细胞毒性效率可能会提高，这一方法可以使用最近开发的核糖体生物合成抑制剂进行有效的测试，其抗肿瘤活性正在揭晓。45,46,47.

药物耐受性是一个关键阶段，因为它代表了发生基因组和非基因组事件的机会之窗，并为细胞提供了耐药表型。我们表明，持续的IGF-1R合成是5-Fu处理后细胞存活的一个重要因素。令人惊讶的是，我们的数据表明5-Fu对IGF-1/IGF-1R通路敏感，因为5-Fu处理的细胞对IGF-1或IGF-1R抑制剂比未处理的细胞更敏感。目前尚不清楚这是否与翻译调控的变化直接相关，但提示靶向IGF-1/IGF-1R通路可能提高5-Fu的疗效。这一数据也证实了IGF-1/IGF-1R通路可能与药物耐受性有关。此外，在5-Fu处理的细胞中，几种编码抗凋亡功能、代谢功能和细胞分化功能蛋白的mRNAs被上调，这可能是细胞治疗逃逸的原因之一。事实上，代谢适应和表型可塑性与细胞的药物耐受性以及少数细胞在静止或缓慢增殖状态下生存药物压力的能力有关。4,48。我们的数据进一步支持翻译控制可能代表非基因组机制导致药物耐受性，并将需要单细胞分析。49,50。5-Fu是目前应用最广泛的化疗方法，对提高其疗效提出了较高的要求。我们的数据突出了理解对5-Fu的药物耐受机制的潜在好处，到目前为止，这一点还没有得到充分的描述。此外，虽然我们的研究集中在rna中的一个碱基类似物上，但其他与rna结合的化合物，如platin衍生物或任何可能干扰rna代谢的药物，现在也应被认为是核糖体结构和活性的修饰剂。51，也可能有助于改变细胞的翻译调节。

总之，我们的研究扩展了帮助细胞在药物挑战下生存的基因表达机制的光谱，方法是在表观遗传学、应激反应、代谢适应和干细胞或休眠表型中加入翻译调节。1,2,4,52,53,54。这些发现也揭示了暴露于药物会导致“人造”生物复合物的产生，这是无法预料的，这需要进一步的研究来充分理解药物的反应，并提出新的治疗策略。