腹膜脓毒症患者骨骼肌内质网应激与未折叠蛋白反应

我们提供了腹膜脓毒症患者骨骼肌未折叠蛋白反应的描述性特征和C57BL/6J小鼠的脓毒症模型。接受开放手术的患者被纳入横断面研究，并采集血液和骨骼肌样本。采用实时定量PCR和组织化学染色方法，对炎症性损伤的代表因子-普氏染色和分化68簇(CD 68)的关键标记物进行了检测。CD 68 mRNA表达随脓毒症患者和动物骨骼肌感染而增加(P<0.05)。p < 0.05). Mainly the inositol-requiring enzyme 1α branch of the UPR was upregulated as shown by elevated X-box binding-protein 1 (XBP1u) and its spliced isoform (XBP1s) mRNA (p < 0.05, respectively). Increased expression of Gadd34 indicated activation of PRKR-Like Endoplasmic Reticulum Kinase (PERK) branch of the UPR, and was only observed in mice (p < 0.001) but not human study subjects. Selected cell death signals were upregulated in human and murine muscle, demonstrated by increased bcl-2 associated X protein mRNA and TUNEL staining (p < 0.05). In conclusion we provide a first characterization of the UPR in skeletal muscle in human sepsis.

脓毒症的特点是器官功能障碍，由宿主对感染的反应失调所介导。1, 2。脓毒症器官功能不全可能影响骨骼肌，增加幸存者持续获得性肌肉无力综合症(即脓毒症所致肌病)的风险。3。从长远来看，相当大比例的病人不完全从脓毒症引起的肌病中恢复过来，导致生活质量严重受损。4。脓毒症所致的肌病的特点是发电能力下降，生物能量和肌肉质量受损。3。在分子水平上，肌病与各种异常有关，包括线粒体功能障碍、促炎细胞因子的局部效应以及肌原纤维蛋白的连续降解、蛋白酶体蛋白水解机制的上调以及蛋白质合成的改变。3。此外，急性胰岛素抵抗和高血糖与脓毒症患者骨骼肌功能障碍有关。5,6,7。然而，对脓毒症所致肌病病理生理学的了解尚不完全。

内质网(ER)是一个亚细胞膜网络，是维持细胞过程所必需的。8。炎症或代谢应激对ER稳态的扰动可诱导细胞蛋白质的转运，导致折叠缺陷的增加，并可引起一种称为ER应激的疾病。8。这就启动了已定义的信号级联的激活，即未折叠的蛋白质反应(Prm)。8。PRKR样内质网激酶(Perk)或肌醇要求酶1α(IRE 1α)等感应蛋白与葡萄糖调节蛋白78 kDa(又称结合蛋白BIP)结合后仍无活性。在ER应激下，BIP与其结合伙伴分离，导致这些传感器蛋白随后被激活。IRE 1α激活导致X-盒结合蛋白1(XBP1u)非典型剪接到其转录活性异构体(XBP1s)，诱导ER伴侣表达增加，并激活ER相关蛋白降解途径(ERAD)。在无法解决ER应激的情况下，诱导细胞死亡是另一种策略。8。ER压力是慢性低级别炎症和胰岛素抵抗所定义的病理的一个公认的贡献者。8,9,10。我们推测，在全身大炎症条件下，ER应激可能在骨骼肌中发挥作用。作为一种高度保守的途径，prm可能会将炎症与脓毒症引起的骨骼肌无力联系起来，正如一些动物模型所暗示的那样。11,12,13。然而，迄今为止，脓毒症患者的骨骼肌中还未证实普遍定期性激活。因此，我们的目标是先提供在人类脓毒症患者骨骼肌普遍定期审议的调控数据，并将这些结果与补充性动物模型进行比较。

病人特征

所有科目的基线数据见表。1并可在Suppl中找到相应亚组的基线数据，用于mRNA分析。表2。我们发现两组在年龄、性别、体重指数(BMI)、全身炎症指标、肾脏和肝功能、代谢状况等方面存在显著差异(表)。1P<0.05)。脓毒症患者年龄明显大于对照组(P<0.05)，体重指数(BMI)高于对照组(P<0.05)，且男性更倾向于男性(P<0.05)。然而，这些数据在脓毒症和胰岛素抵抗患者之间是可以比较的，因为这些预定义的亚组是按年龄和体重指数逐个匹配的(表)。1和补编。表2P>0.05)。与胰岛素抵抗和对照组相比，脓毒症患者血浆炎症标志物明显增加，肾和肝功能受损，反映了脓毒症相关器官功能障碍(表)。1P<0.05)。此外，脓毒症患者增加了胰岛素抵抗(HOMA-IR)的稳态模型评估(HOMA-IR)，可与胰岛素抵抗患者相媲美，可能同时反映了急性胰岛素抵抗和5例(38%)先前存在的2型糖尿病(T2D)患者的情况。由于脓毒症患者是在手术后采集空腹血样，因此不能排除手术干预本身可能导致HOMA-IR升高，尤其是Homa-IR是对脓毒症患者胰岛素抵抗的一个相对模糊的估计。为了支持急性代谢反应，我们发现脓毒性骨骼肌中葡萄糖转运蛋白4(GLUT 4)的转录本明显低于对照组(p=0.042；Supl)。无花果。1)。否则，与其他两组相比，具有长期胰岛素抵抗特征的受试者的hbA1c水平显著升高，表明存在慢性高血糖(表)。1、补编。表2P<0.05)。对照组未发现炎症或胰岛素抵抗的标记物升高(表)。1、补编。表2).

半数以上的患者患有潜在的恶性肿瘤，而各群体在这方面具有可比性(表)1、补编。表2(P>0.05)。值得注意的是，与对照组和胰岛素抵抗者相比，脓毒症患者的肿瘤进展较慢.因此，对照组患者在纳入研究项目之前更有可能接受过放疗或化疗(表)。1).

剖腹手术的适应证见上腹部。表3。除原发性肝或胆汁性肝恶性肿瘤外，对照组与胰岛素抵抗组的适应症相似，而胰岛素抵抗组则有较丰富的表现。自然，脓毒症组手术指征不同，从吻合口不足、胃肠道穿孔到腹腔脓肿(上腹部脓肿)。表3)。在所有研究小组中，约有一半的病人曾接受过开腹手术(表)。1、补编。表2(P>0.05)。

骨骼肌炎症

我们发现骨骼肌是对脓毒症的全身免疫反应的一个部位，其表现为分化68(CD 68)mRNA表达显著增加，这是骨骼肌损伤相关的局部巨噬细胞浸润的标志。14,15,16,17,18，以人类为单位(图1.1)和鼠(图1.1(B)脓毒症(P<0.05)。证实局部骨骼肌炎症，我们发现脓毒性肌中趋化因子C-C基序配体2(CCL 2)转录本增加(p<0.05；图1)。1a)。髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(ELane)mRNA对中性粒细胞浸润无明显影响(P>0.05)。1A和补编。无花果。2分别)。

骨骼肌炎症的标志。用RTqPCR技术检测人炎症标志物的基因表达。a)和鼠(b)骨骼肌。数据作为规范化日志给出。2-与各对照组的中位数比较，翻倍的变化作为参考。人类数据图表示每组匹配对象的n=10(特征见补编)。表2)，动物数据图表示每组5-6只动物。CD 68在患者肌肉组织中的代表性染色及半定量评价(英文)c)巨噬细胞数量的差异(*p<0.0 5，χ)2-测试)。箭头表示CD 68阳性细胞(褐色着色)。光盘控制饮食，CD/CD 68分化群68，HFD高脂肪饮食，CCL趋化因子C-C基序配体，艾尔胰岛素抵抗MPO髓过氧化物酶RTqPCR定量实时PCR，p<0.05。

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为证实骨骼肌CD 68在蛋白水平上升高，我们对13例组织学检查质量良好的患者(对照组、IR组和脓毒症组分别为13例、19例和11例)进行CD 68染色，发现脓毒症组CD 68染色明显高于对照组和IR组(P<0.05)。1c)。

骨骼肌普遍定期审议

与胰岛素抵抗或控制条件相比，脓毒症患者普遍不稳定，如激活高度保守的IRE1α分支所示(见补编)。无花果。3)。值得注意的是，我们发现两位患者骨骼肌中XBP1u和XBP1smRNA水平均显著升高(图二)。2)和老鼠(图1.2(B)腹膜脓毒症(P<0.05)。为了证实XBP 1在蛋白水平上的表达增加，我们对一小部分患者进行了免疫组织化学染色，观察到脓毒症患者肌肉组织中有更丰富的核定位。无花果。4)。相反，激活转录因子(ATF)mRNA 4和6，代表普遍定期审议的其他两个主要分支的激活(补编)。无花果。3两种情况下骨骼肌均未见明显增加(P>0.05)。2(A)腹腔脓毒症中ATF 4而ATF 6 mRNA表达增加(p<0.05和p>0.05)。2b)。生长停止和DNA损伤诱导蛋白34的mRNA均无表达(Gadd34；p=0.76；Supl.无花果。5(A)NOR BIP(p=0.42；图1)。2(B)在人骨骼肌中有明显的调节。但在小鼠腹腔脓毒症中两者均明显升高(P<0.05)。2B和补编。无花果。5b)。此外，c-jun N-末端激酶(JNK)在人骨骼肌中的表达无明显变化(p=0.072；增生性P>0.05)。无花果。5c)。

人普遍定期审议激活指标的基因表达分析(英文)a)和鼠(b)骨骼肌。数据以归一化对数2倍变化的形式给出，与相应控制组的中位数相比较，作为参考。人类数据图表示每组匹配对象的n=10(补编)。表2)，动物数据图表示每组5-6只动物。ATF激活转录因子比普结合蛋白，又称葡萄糖调节蛋白78 kDa；光盘控制饮食，HFD高脂肪饮食，光盘控制饮食，HFD高脂肪饮食，艾尔胰岛素抵抗XBP1sX盒蛋白1剪接，XBP 1X盒蛋白1；*p<0.05。

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细胞死亡的替代指标

我们采用TdT介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)染色法检测一小部分非脓毒症对照组和脓毒症患者的细胞死亡事件(n=6和n=7)。与非脓毒症对照组相比，TUNEL阳性细胞在感染性人体肌肉中更为丰富。3A，p<0.05)，不仅限于与肌管相对应的细胞核，而且也存在于间质间隙。在脓毒症条件下，我们进一步观察到人和动物骨骼肌bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA的增加(图二)。3B，c，p<0.05)。而C/EBP同源蛋白(CHOP)在患者中的表达无显着性差异(P>0.05)。3(D)脓毒症条件下，小鼠骨骼肌表达明显下降(p<0.05)。3e)。免疫荧光法检测人骨骼肌CHOP蛋白时，染色强度无明显差异(P>0.05)。无花果。6).

骨骼肌细胞凋亡指标。TUNEL染色及阳性细胞半定量评价(英文)a)人骨骼肌中脓毒症与其他各组比较(*P<0.05，χ2-测试)。箭头表示TUNEL阳性细胞(褐色染色)，这是代表细胞发生凋亡。细胞凋亡标记基因bax和CHOP的基因表达分析b,d)和鼠(c,e)骨骼肌。数据以归一化对数2倍变化的形式给出，与相应控制组的中位数相比较，作为参考。人类数据图表示每组匹配对象的n=10(补编)。表2)，动物数据图表示每组5-6只动物。Bax/BaxBcl-2相关X蛋白，光盘控制饮食，印章/切碎C/EBP同源蛋白HFD高脂肪饮食，艾尔胰岛素抵抗TUNELTDT-介导的dUTP-生物素缺口末端标记；*p<0.05。

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聚类相关分析与Kaplan-Meier估计

为了进一步了解脓毒症中普遍定期治疗途径中潜在的相互作用，我们进行了一项聚类相关分析，其中包括脓毒症患者的mRNA转录本(Suppl)。无花果。7a)。CD 68转录本与CCL 2(r=0.85；p<0.001)和多个普遍定期审议蛋白(JNK(r=0.63；p=0.022)、BIP(r=0.80；p=0.019)和ATF 6(r=0.70；p=0.007)的表达密切相关。此外，CD68mRNA与bax呈正相关(r=0.57，p=0.041)。与XBP1u(r=0.32，p=0.29)、XBP1s(r=0.29；p=0.33)、ATF 4(r=0.04；p=0.90)、Gadd34(r=0.40；p=0.20)无显著相关性。补充图7B描述了小鼠脓毒症骨骼肌的聚类相关关系，并与转录本的聚类进行了比较。对照组、胰岛素抵抗组、人骨骼肌和小鼠骨骼肌mRNA表达的聚类相关矩阵可在Supl中找到。无花果。8.

为了进一步评估骨骼肌炎症是否与患者预后有关，我们进行了一项探索性的后卡普兰-梅耶分析，研究了患者生存与CD 68丰度的关系。+骨骼肌细胞浸润。然而，浸润细胞较多的患者死亡率与低浸润细胞者相比无显着性差异(分别为5/6和2/5；p=0.06；图1)。4)，可能是由于受试人数少和权力不足所致。

基于人骨骼肌CD 68免疫染色的Kaplan-Meier估算腹膜脓毒症患者28天生存曲线。CD 68阳性细胞浸润较多者28d生存率较低，而对数秩检验无统计学意义(p=0.06)。CD 68，分化簇68。

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我们提供的新发现表明，腹膜脓毒症，在人和小鼠，是与骨骼肌巨噬细胞浸润和局部激活未折叠蛋白反应。

动物模型提示ER应激在脓毒症中起关键作用。11, 13。为了支持这一点，最近在脓毒性休克患者中的一项研究揭示了明确的ER应激标记物的血浆mRNA与器官衰竭的关系。19。此外，Jiao等人的群体。能在内毒素模型中显示普遍定期审议的关键蛋白，如Bip和Chop，在伴有全身炎症的大鼠膈肌中增加，同时伴有减弱的肌肉收缩力。13。因此，ER应激通路可能成为治疗炎症性肌病的新靶点。12, 20。我们的数据提供了证据，表明骨骼肌存在局部炎症协同反应，并伴有系统性高级别炎症。后者受腹腔脓毒症患者巨噬细胞浸润和骨骼肌CD 68 mRNA表达增强的支持。因此，我们扩展了焦等人的研究结果。13表明炎症代谢性标志物CD 68与肌肉组织中普遍定期定量指标的表达有着显著的相关性。CD 68是巨噬细胞组织浸润的指标，巨噬细胞被认为是骨骼肌对组织损伤反应的关键调节因子。21, 22。然而，局部炎症和巨噬细胞浸润是双刃剑，具有增强损伤和促进组织再生的潜力。23。我们没有评估巨噬细胞的极化状态，因此，在人类脓毒症的这一阶段，巨噬细胞的浸润是否主要代表一种更不适应或再生的反应，需要在今后的研究中加以阐明。此外，通过我们的研究设计，我们无法得出因果关系。根据我们的数据，只能假设骨骼肌局部对脓毒症的炎症反应导致了ER应激，从而引发了普遍定期审议。12, 20.

Homa-IR升高和GLUT 4表达降低对脓毒症所致胰岛素抵抗的影响6。ER应激已被证明与组织葡萄糖摄取减少有关，并且表明使用新的药理学普鲁普调节剂可以治疗糖尿病。24。因此，由于骨骼肌是胰岛素作用的主要部位，代谢紊乱可能在我们受试者的普遍定期审议激活中发挥替代或协同作用。在脓毒症研究对象中，对高度保守的iRE 1α分支的激活作用仅在脓毒症研究对象中观察到，而在长期胰岛素抵抗对照中则没有观察到。因此，我们在患者和动物身上的发现表明，主要是局部巨噬细胞浸润，而不是高血糖/胰岛素抵抗，与肌肉普遍定期审议的诱导有关。

激活IRE 1α可促进JNK活性，增强炎症反应12。后者得到我们相关分析的支持，显示CD 68与促炎转录本的关联.在局部炎症条件下，IRE1α激活的主要作用是通过提高ER折叠能力恢复蛋白质稳态和细胞功能。12。另一种效果是通过减少未折叠蛋白/错折叠蛋白的负荷，减少一般蛋白质的合成，从而降低ER应力。20。然而，在无法解决的ER压力下，诱导细胞死亡是另一种策略。8。我们发现CD 68与Bax作为细胞凋亡的指标有显著的相关性。这一观察结果与焦氏等人的研究结果相关联。13并提出了局部炎症对骨骼肌细胞死亡诱导作用的假说。活化的JNK能诱导CHOP的表达，从而诱导细胞凋亡12, 20。我们发现在脓毒性肌肉中Bax的mRNA表达明显增加，这与TUNEL分析发现的细胞死亡的结果一致。相比之下，CHOP蛋白在脓毒症患者中保持不变。然而，这与最近的发现是一致的，即在脓毒性休克5天后，CHOP在人血浆中的表达没有改变。19。相比之下，CHOP在我们的脓毒性啮齿动物模型的骨骼肌中被下调，而GAD 34则增加。我们只能推测人类和小鼠骨骼肌对脓毒症的反应差异的原因，但可能的解释是疾病过程中组织取样的时间点不同。然而，我们需要承认，凋亡是一个复杂的过程，涉及几种不同的激活途径和翻译后蛋白修饰--这一复杂性并不能通过我们有限的标记来很好地反映出来。此外，TUNEL阳性染色不仅限于肌管核，而且还延伸到间质细胞、可能的卫星细胞、内皮细胞或免疫细胞，这可能与观察到的效应有关。因此，我们最终只能从我们的数据中指出，脓毒症的局部炎症反应与普遍定期审议激活和骨骼肌细胞死亡增加有关，但我们无法推断出因果关系。

器官炎症的加速可能与更严重的脓毒症过程有关。因此，我们进行了一个探索性的Kaplan-Meier分析，寻找在骨骼肌组织学中CD 68阳性细胞增加的患者与低数量患者之间的生存差异。我们发现各组之间没有显着性差异，可能是由于患者数量少。值得注意的是，由于我们没有事先计划这一分析，生存分析的动力不足，限制了生存评估的有效性。要充分评估脓毒症患者骨骼肌炎症和普遍定期审议激活与预后的关系，就需要更大的队列。关于局部巨噬细胞浸润的现有数据相互矛盾，因为一些发现与坏死细胞死亡相关的危重病患者骨骼肌中CD 68阳性细胞。18，而其他人则没有25。与其他人相比，我们只包括患有腹膜脓毒症的受试者，因此，我们研究了一个相对一致的样本。这可能有助于解释不同的发现。未来的研究将需要证实我们的发现，增加巨噬细胞浸润和凋亡骨骼肌的脓毒症患者。

目前这项研究的局限性在于其观察性质，因此，我们不能直接探讨机制或因果关系。此外，我们对人骨骼肌普遍定期审议的结果可能受到一种潜在的选择偏差的影响，因为多种病理可导致ER应激。具体来说，胰岛素抵抗和脓毒症患者都比对照组年龄大，BMI高，男性比例高，有可能导致观察到的普遍定期审议激活和骨骼肌炎症。然而，胰岛素抵抗和脓毒症患者在这方面具有可比性，因此，这些群体之间普遍定期审议记录表达的差异不太可能归因于患者人口结构的差异。此外，对照组和腹膜脓毒症患者的HbA1c作为慢性血糖状态的指标具有可比性，而胰岛素抵抗和脓毒症患者的Homa-IR升高，反映出这些组的胰岛素抵抗更严重。

恶性肿瘤是另一个潜在的偏见因素，在癌症恶病质小鼠模型中，骨骼肌普遍定期审议的激活增加。26。值得注意的是，研究组肿瘤分期不同，对照组和IR组中有一小部分患者接受了癌症治疗，但脓毒症患者未接受治疗，这可能会影响结果。由于肿瘤在腹膜脓毒症患者中进展较慢，我们认为肿瘤相关的肌肉消瘦不太可能导致脓毒症中普遍定期反应标志物的增加，因为我们预计在疾病和癌症治疗更深入的患者中会出现更高水平的普遍定期审议。

我们能够复制我们的主要发现，普遍定期审议激活和凋亡的小鼠腹膜脓毒症模型。我们选择腹膜污染和感染(Pci)模型来治疗腹膜脓毒症，因为它重复性好，操作方便，很大程度上反映了人类的疾病。27, 28在我们学院里很有名气。其他腹膜脓毒症模型，如盲肠结扎和穿刺(CLP)、自体PCI或腹腔注射细菌或LPS等，由于手术创伤、不同的微生物组成或缺乏人源性物质和细胞，可能会产生不同的结果，值得进一步探索。在实验研究中，有限的动物数据转移到临床环境中仍然是一个普遍关注的问题。29值得临床脓毒症队列进一步研究。

我们的结果仅限于人类腹直肌和鼠腓肠肌肌肉。众所周知，不同类型的骨骼肌表现出不同的基因表达模式。30这可能部分解释了观察到的人类和小鼠数据的差异，并限制了我们的结果在其他肌肉群中的普遍性。脓毒症诱导后24 h严格采集动物标本，确诊脓毒症后24h内未采集标本，但大多数脓毒症患者已住院两天。这意味着患者在组织取样前可能处于炎症状态较长的时间，在分析中引入了一种潜在的偏见。此外，尽管在前5天接受腹部手术的患者被排除在外，但大约有一半的患者曾接受过剖腹手术，疤痕和伤口愈合过程可能有扭曲的结果。然而，先前剖腹手术患者的比例在研究组之间是相当的，因此不太可能有系统的偏倚。此外，组织标本的有限尺寸阻碍了蛋白质水平的量化以及参与普遍定期审议激活的磷酸化和切割事件的研究。因此，可能没有激活perk和atf 6轴，包括atf 4，因为翻译后修改是激活这些通路的主要事件。8。同样，小尺寸的组织标本和较低的RNA产量阻止了对更多转录本的分析，以支持我们的观察，并对所涉及的确切途径作出更详细的假设。此外，由于缺乏数据和较少的研究对象，我们无法提供关于骨骼肌功能和长期发病率的临床结果。这一点和普遍定期审议指导治疗的潜在效果需要今后进行调查。最后，我们的数据仅代表高加索人和腹膜脓毒症患者，不能推广到其他种族或脓毒症实体。

总之，我们为腹膜脓毒症引起的骨骼肌局部炎症和IRE1α分支的共同激活提供了第一证据。我们的发现可能对ICU获得的肌肉无力具有临床意义，因为ER应激可能有助于其病理生理学。今后的研究需要阐明ER应激和普遍定期审议作为潜在治疗目标的确切作用。

学习设计

本研究旨在研究脓毒症患者骨骼肌局部损伤的普遍定期性及其与分子代用品的关系。为此，我们调查了先前一项人类研究中的血液和骨骼肌样本，其中包括接受治疗性剖腹手术的腹膜脓毒症患者。31。CD 68是骨骼肌损伤时巨噬细胞浸润的公认指标14,15,16,17,18，被选为全身炎症肌肉炎症反应的关键替代物。

普遍定期审议是由慢性低级别炎症和胰岛素抵抗所定义的病理过程中公认的驱动因素。9因此，我们包括胰岛素抵抗患者，但没有并发脓毒症作为“阳性对照”。未发现脓毒症和胰岛素抵抗的患者作为“阴性对照”。两组患者均行正中位剖腹手术，以确定手术适应证。在组间比较分析中，我们包括了每组10名患者，每个病例与脓毒症和胰岛素抵抗患者的年龄和体重指数相匹配。

我们收集了标准实验室和临床测量的基线数据。用qRTPCR方法检测具有代表性的普伐他汀转录本和炎症反应通路的基因表达。所有受试者均行组织化学和免疫组织化学染色。建立多微生物腹膜脓毒症小鼠模型，进行补充验证。31.

主体与伦理

这次调查是对以前的一项研究中获得的样本进行的二次分析。31。该研究议定书得到耶拿大学医院教师道德审查委员会的批准(3247-09/11)，并符合1975年“赫尔辛基宣言”的道德准则。所有方法均按照有关准则和规定进行。所有当事人或其法律代表都给予书面知情同意。我们包括年龄在18岁或18岁以上的接受治疗性剖腹手术的患者，他们在入学前5天内没有接受过其他手术治疗。如前所述，脓毒症组中的受试者符合德国脓毒症学会指南的标准，符合诊断脓毒症的标准32。我们将患者纳入胰岛素抵抗组，如果他们知道有抗糖尿病治疗的T2D，符合美国糖尿病协会T2D标准或全国胆固醇教育成人治疗小组III代谢综合征标准33, 34。如果适用，则在手术前停止使用抗糖尿病药物。对照组未达到诊断脓毒症或胰岛素抵抗的标准。一般排除标准是过去两个月内的化疗、长期免疫抑制治疗、器官移植史、活动性类风湿炎症疾病、药物或酒精滥用(女性每天饮酒超过20克、男性每天摄入40克以上)、先前存在的慢性肾病或肾功能衰竭合并原发性血液透析和已知的肝硬化。

人体血液和组织样本

胰岛素抵抗者和手术对照者接受了一夜快速治疗，并在开腹前于清晨采血。由于腹部脓毒症急诊手术的逻辑原因，患者于术后第二天早上抽取血液，在禁食期至少8小时后取血。所有临床实验室参数均在经认证的大学医院实验室进行测量。9。用HOMA-IR法测定全身胰岛素抵抗。35。取腹直肌正中切口后取骨骼肌组织标本，立即冷冻在液氮中，保存在−80°C。36。有一小部分直接分离并储存在加湿腔中进行组织学分析，直到将其嵌入组织-Tek O.C.T.TM化合物(日本樱花Finetek)，并立即储存在−80°C。用3000×离心法制备血清g在4°C下保存10 min，然后存放在−80°C。

动物模型

我们根据德国关于保护动物的立法进行了所有调查和实验，并从耶拿弗里德里希-席勒大学区域动物福利委员会获得了进行这项研究的许可(注册号为02-038/12)。31。所有方法都是按照相关准则和条例进行的，并按照“到达准则”进行报告。

6周龄雄性C57BL/6J小鼠在标准化实验室条件下饲养标准饲料(对照饮食，CD)或34%脂肪饲料(高脂饮食，HFD，ssniff EF R/M D 12492模式)。持续了12周。以hfd作为肥胖诱导胰岛素抵抗的模型。31。每两周测量一次体重，以确保足够的摄食和体重发育。12周后，将CD动物随机分为三组：CD基线组(CD)、HFD基线组(HFD)、CD败血症组(CD 24h)。

采用腹膜污染和感染模型诱导脓毒症。31，腹腔注射标准稀释人粪便浆(1.25L/g体重)。脓毒症12h后，小鼠皮下注射20L/g体重生理盐水，减轻脱水的影响。在基础或脓毒症诱导后24h，在深异氟醚麻醉下，心脏穿刺取枸橼酸抗凝血处死小鼠。血液样本保存在冰上，然后用2500×离心法产生血浆。g于4°C下连续10 min取骨骼肌标本作为一个完整的标本。腓肠肌立即将每只动物冷冻在液氮中，并保存在−80°C，直到测量为止。对侧腓肠肌嵌入组织-Tek O.C.T.TM复合物(日本樱花Finetek)，直接保存在−80°C进行组织学检查。

骨骼肌mRNA表达

我们用甲唑Lysis试剂和珠磨提取了Trizol mRNA。RNA必须用真空离心浓缩，用NanoDrop 1000分光光度法测定浓度(PeqLab，德国)。用Experion自动电泳系统(美国Bio-Rad实验室)检测RNA完整性.然后用Revertaid First Strand cDNA合成试剂盒(Fermentas，USA)将RNA转录成cDNA。在转基因Q(QIAGEN，德国)上进行聚合酶链反应，总反应量为20μL，采用灿烂Ⅱ型SYBR绿色qPCR主混合剂(美国Stratagene)和正、反向引物(BioMers，德国)。表达分析按报告进行31。补充部分给出了引物序列和完整方法(补充方法和补充方法)。表1).

组织学评价和染色

用LeicaCM3050S冷冻机(美国莱卡生物系统)冷冻5m厚的骨骼肌组织切片，在−80°C冻存，经H&E染色质量控制后，仅用高肌纤维质量的肌肉切片进行进一步染色。H&E和XBP 1-染色(抗XBP 1-抗体，ab 37152，Abcamm，联合王国)。9。CD 68骨骼肌染色采用PG-M1抗体(德国达科细胞瘤)和DAKO真检测系统(LSAB+)HRP/民建联+(DAKO Cytomation)进行染色，并用苏木精(Hematoxylin)进行染色。TUNEL染色采用原位细胞死亡检测试剂盒POD(Roche Deutschland Holding GmbH，德国)。方法在补充中有更详细的描述。

显微镜分析采用奥林巴斯Provis AX 70显微镜(德国奥林巴斯)和尼康月食钛-E X荧光模型(日本尼康)。CD 68、XBP 1和TUNEL染色采用盲研究者(UBM)的表观染色强度和丰度评分，顺序为0~3，显示NO、最低、中度和高染色强度。

统计分析

采用SPSS22.0(SPSSInc.，USA)和RStudio(美国RStudioInc.)的R版本3.6.2进行统计分析。图是用R包绘制的公公和Gggplot 2.

数据作为手段±SEM给出，如果没有说明，则另有说明。所有方框的方框范围从25到75百分位数，晶须表示在1.5倍的四分位数范围内的最小和最大值，在第一和第三四分位数之上和之下，离群值被描绘为点。正态分布用Shapiro-Wilks检验。为了检验方差的同质性，我们使用Levene方法。根据数据分布，我们采用了以下统计程序：单因素方差分析(ANOVA)、韦尔奇(Welch‘s)检验或kruskall-Wallis检验，并采用后专案Bonferroni-holm或Dunn-holm校正，以及χ。2-序数或标称数据测试试验。用R软件包建立了聚类相关矩阵的热图。健康采用Spearman相关系数和完全连锁层次聚类。采用Kaplan-Meier法研究脓毒症患者的生存功能，并用对数秩检验评价其意义。如果双边p<0.05，则接受另一种假设。