Btnl 2阻断剂对多种小鼠模型的抗肿瘤作用 鉴于文献中令人信服的人类遗传和翻译数据，我们假设抗体介导的阻断btnL 2将增强抗肿瘤免疫应答。为了验证这一点，我们建立了针对小鼠btnl 2的大鼠单克隆抗体库，并进行了体外功能筛选，确定了一个能够挽救btnl2fc介导的抑制CD4的单个克隆(mAb-2，简称btnl2mAb)。 + T细胞(附图) 1A )。为了进一步验证这一抗体，我们用crispr-ca 9技术制作了btnl2-ko小鼠，并删除了该抗体的第1-3外显子。 BTNL 2 基因(附图) 1B )。我们发现BTNL 2单抗-2抗体可用于免疫印迹和流式细胞术分析(附图)。 1C-E )。由于BTNL 2单抗-2也识别出95 kD的非特异性蛋白，我们进行了膜质分离实验，发现95 kD的非特异性蛋白仅在细胞质中表达(附图)。 1D )。这些数据也表明，这种非特异性蛋白不会影响mAb-2的体内功能。值得注意的是，两者都是腹腔内(I.P.)和静脉注射(i.v.)给荷瘤小鼠注射抗BTNL 2单抗可显著抑制Lewis肺癌(LLC)肿瘤的生长。 1A )。同样的抗肿瘤作用也被发现如下。向CT26(小鼠结肠腺癌)或A20(小鼠B细胞癌)荷瘤小鼠注射BTNL 2单抗。 1B，c )。在A20肿瘤模型中，7只小鼠中有5只在抗BTNL 2单抗治疗后，所有宏观肿瘤负担均出现完全反应。然后我们在这些小鼠的对侧侧翼重新植入一个20的肿瘤，没有发现任何肿瘤重新植入后植入的证据，表明长期抗肿瘤免疫记忆的发展是对抗btnL2单克隆抗体治疗的反应(图一)。 1D )。静脉输注A20肿瘤细胞后，一种广泛转移的疾病负担模型，抗BTNL 2单抗显著延长了荷瘤小鼠的存活时间(图1)。 1E )。其次，我们发现联合抗BTNL 2 mAb和抗Pd-1mAb与单一治疗相比具有加性的抗肿瘤作用，抗BTNL 2 mAb和抗Pd-1mAb具有相似的抗肿瘤作用。 1F-h
图1：抗BTNL 2单克隆抗体对多发性肿瘤有治疗作用. a 腹腔注射同型大鼠IgG 1对照抗体或抗BTNL 2单抗(2 0 0μg/鼠)(左侧)或静脉注射抗体(2 0 0μg/鼠)(右面)后，小鼠的原代LLC肿瘤生长动力学。( n =13， P 左面板=0.0009，以及 n =14， P < 0.0001 for right panel). b , c 一级CT 26( b , n =每组14， P < 0.0001) or A20 (c , n =每组17， P < 0.0001) tumour growth kinetics of mice after intraperitoneal injection of antibody (200 μg/mouse) was shown. d 抗BTNL 2单抗治疗组小鼠 c 在小鼠对侧侧再植入肿瘤20例，观察小鼠肿瘤生长动力学。 n =每组12， P < 0.0001). e 小鼠静脉注射2×10 6 A20肿瘤细胞，随后腹腔注射同类型对照抗体或抗BTNL 2单克隆抗体，如材料和方法( n =每组15， P < 0.0001) (200 μg/mouse). Mice survival was shown. f 以小鼠腹腔注射对照抗体、抗BTNL 2单抗、抗Pd-1mAb或抗Pd-1mAb+抗BTNL 2单抗，观察小鼠原代A20肿瘤生长动力学。(200μg/鼠抗BTNL 2单抗和100μg/鼠抗Pd-1mAb) n =每组13， P =0.0005用于控制和α-BTNL 2， P < 0.0001 for Control vs α-BTNL2 + α-PD-1, 4 × 106 A20细胞皮下注射)。 g 肿瘤图像 f 展示了。 h 肿瘤重量显示( n =每组13， P < 0.0001 for Control vs α-BTNL2 + α-PD-1, 4 × 106 A20细胞皮下注射)。所有数据均为平均±S.E.M。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 based on Two-way ANOVA for (阿-d , f )，原木等级(Mantel-Cox)检验( e )和单向方差分析( h )。数据代表三个独立的实验( 阿-戊 )和两个独立的实验( F-h ).
其次，我们检测了BTNL 2在小鼠肿瘤微环境(TME)中的表达。有趣的是，与LLC细胞相比，我们在55 kDa处观察到一条在LLC肿瘤中强烈诱导的蛋白带，而72 kDa带在植入后没有变化。表达 BTNL 2 与原代肿瘤细胞相比，移植LLC和CT 26肿瘤组织中的mRNA表达明显增强，与原代肿瘤细胞相似。 Pd-L1 MRNA诱导(附图) 2A，b )。值得注意的是， BTNL 2 MRNA诱导比 Pd-L1 LLC肿瘤的诱导，这至少部分解释了抗BTNL 2单抗治疗相对于抗Pd-1mAb治疗对LLC肿瘤生长的显著影响(补充图)。 2C )。有趣的是，抗Pd-1mAb治疗后LLC肿瘤中BTNL 2蛋白表达显著增加(补充图). 二维空间 )，反映了先前的报告，即抗pd-1治疗后btnl 2的表达被上调。 48 。用糖基化抑制剂PNGase F处理后，72 kDa BTNL 2带的强度降低，而先前观察到的55 kDa BTNL 2带出现，说明55 kDa BTNL 2带代表天然的非糖化形式的BTNL 2(附图)。 2E )。在BTNL 2(N210S，N296S，N427S和N432S)上对4个预测的糖基化位点进行定点突变后，通过SDS-PAGE观察到BTNL 2的分子量回归到预测的分子量，表明BTNL 2在这四个位点上都发生了糖基化(附图)。 2F )。TME的流式细胞分析表明BTNL 2主要在CD 45上表达。 - 肿瘤细胞占CD 45的48.47% + 白细胞也表达BTNL 2(补充图)。 2G
BtnL 2抑制肿瘤浸润γδT17 Btnl 2属于丁酪氨酸样蛋白家族，许多丁香蛋白和丁酪氨酸样蛋白在调节γδT细胞的发育和分化过程中起着重要的作用。 27 ,28 ,29 ,30 ,31 ,32 ,33 ,34 。有趣的是，抗BTNL 2单抗治疗后，γδT17对CT26和A20肿瘤的浸润及血清IL-17A浓度均较同型对照抗体治疗明显减少(图1)。 2A，b )。我们还静脉注射MC 38和CT 26细胞，发现与对照组相比，抗BTNL 2单抗治疗能显著延长荷瘤小鼠的存活时间(补充图)。 3A-d )。据报道，在ct 26肿瘤中有不同类型的免疫细胞浸润，我们检查了抗btnl2mAb阻断后其他免疫细胞在ct 26肿瘤中的浸润情况是否有差异。 49 ,50 。值得注意的是，肿瘤浸润的IL-17A或IFN-γ产生CD4的数量没有显着性差异。 + T细胞、Treg细胞或NK细胞(补充图)。 3E-g )。其次，我们发现野生型(WT)BTNL 2-FC和N4S-BTNL 2-FC重组蛋白均能诱导脾细胞γδT细胞产生IL-17A(附图)。 4A 还有无花果。 2C IL-1β与IL-23共处理可增强此效应(图1). 二维空间 51 。值得注意的是，糖基化位点突变体N4s-BTNL2-FC比WT-BTNL 2促进了γδT17的数量和IL-17A的产生，无论与IL-1β和IL-23共同刺激与否(见图)。 2C，d )。与此相一致的是，n4s-btnl2-fc促进了IL-17A转录因子的更高的基因表达。 RORC 比WT-BTNL-2-FC(图1)。 2E )。这与非糖基化BTNL 2主要在TME(补充图)中诱导的结果一致。 2A
图2：抗BTNL 2单抗治疗可减少γδT 17细胞的肿瘤浸润. a , b 经同类型对照抗体或抗BTNL 2单抗治疗(2 0 0μg/鼠)后，浸润皮下CT2 6中产生IL-17A或IFN-γ的CD3+γδT淋巴细胞。 a )和A20( b )用流式细胞仪对肿瘤进行分析。 a , n =15， P γδT=0.014 + 伊-17A + γδT的NS细胞百分比 + 干扰素-γ + 细胞百分比 b , n =14， P < 0.0001 for γδT+ 伊-17A + γδT的NS细胞百分比 + 干扰素-γ + 细胞百分比)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-17A。 n =15， P < 0.0001 for a ). c 脾细胞在平板包被的FC、WT-btnL 2-fc或n4s-btn2-fc重组蛋白(10μg/ml)中培养48h，然后用流式细胞仪分析γδT 17和Th17(用细胞活化鸡尾酒(用bregeldin A)刺激细胞4 h，用活CD 45进行门控。 + , n =9， P < 0.0001 for Fc vs WT-BTNL2-Fc γδT+ 伊-17A + 细胞百分比， P < 0.0001 for Fc vs N4S-BTNL2-Fc γδT+ 伊-17A + 细胞百分比， P =0.003对于WT-BTNL 2-FC与N4s-BTNL 2-FCγδT + 伊-17A + CD4细胞百分比 + 伊-17A + 细胞百分比)。 d FACS排序 γ δT细胞在平板包被FC、WT-btnL 2-fc或N4s-btnL 2-fc+IL-1β和IL-23存在下培养24h，用ELISA法分析IL-17A的产生情况(P<0.0 5)。 n =7， P Fc=0.0003对WT-BTNL 2-FC， P < 0.0001 for Fc vs N4S-BTNL2-Fc, P 对于IL-1β+IL-23+FC与IL-1β+IL-23+WT-BTNL 2-FC=0.0456， P IL-1β+IL-23+FC=0.0098，IL-1β+IL-23+N4s-BTNL 2-FC)。 e 流式细胞术(FACS)分离的γδT细胞在平板包被Fc、WT-btnL 2-fc或n4s-btn2-fc+IL-1β和IL-23存在下培养24 h，并进行实时PCR分析。 RORC 表达( n =10， P Fc=0.0184对WT-BTNL 2-FC， P < 0.0001 for Fc vs N4S-BTNL2-Fc). f 用1 0 0μg/鼠中和抗体中和IL-17A，得到CT2 6肿瘤生长动力学。 n =每组16， P =0.018)。 g 以小鼠腹腔注射对照抗体或抗BTNL 2单抗(200μg/鼠)和Fc或IL-17A-FC重组蛋白后，初步观察到CT26的肿瘤生长动力学。( n =每组15， P < 0.0001). Fc or IL-17A-Fc recombinant proteins (5 μg/mouse) were intraperitoneal injected at day 1, 4, 7, 10 and 13 after tumour implantation. Right panel indicates the purified Fc and IL-17A-Fc recombinant proteins analyzed by western blot. All data are mean ± s.e.m. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 based on Mann–Whitney test for (a，b )，单程方差分析( C-E )和双向方差分析( f , g )。数据是三个独立实验的代表。
为了进一步研究IL-17A在BTNL 2阻断后肿瘤消退中的作用，我们在荷瘤小鼠体内中和IL-17A，发现这完全消除了BTNL 2阻滞的抗肿瘤作用。 2F )。为了进一步证实IL-17A在BTNL 2阻断中的重要作用，我们纯化了小鼠IL-17A-FC重组蛋白。 2G ，右面板)，并发现重组IL-17A-FC治疗也消除了BTNL 2阻断的抗肿瘤作用(图1)。 2G ，左面板)。这些结果表明，TME中的BTNL 2作用于局部γδT细胞，诱导γδT细胞产生IL-17A，进而促进肿瘤免疫抵抗。
接下来，我们对TME中产生IL-17A的细胞进行了研究，发现肿瘤浸润的IL-17A产生细胞主要是CT26和A20肿瘤中的γδT细胞。 3A，b 17 而Vγ4和Vγ6γδT细胞是多种小鼠肿瘤模型中主要的产生白细胞介素17A的γδT细胞。 18 ,19 ,20 ,21 。令人惊讶的是，我们发现大多数肿瘤浸润的γδT17细胞是Vγ1γδT细胞。 3C，d )。Vγ1γδT细胞被报道为一种在某些情况下产生IL-17A的细胞，例如在致命的肺曲霉菌病感染中。 17 ,52 。据报道，IL-17A产生的γδT细胞为CD 27阴性，我们确实发现这些皮下浸润的γδT 17细胞不表达CD 27，这与先前的报道是一致的。 3C，d 21 ,53 ,54 。Vγ1γδT细胞的耗竭对皮下肿瘤也有治疗作用，在Vγ1γδT细胞衰竭后，BTNL 2阻断的抗肿瘤作用与对照组相当，提示BTNL 2阻断的抗肿瘤作用依赖于Vγ1γδT细胞(如图1所示)。 3E )。此外，我们发现Vγ1γδT细胞耗竭可减少CT26肿瘤浸润细胞分泌IL-17A，抗BTNL 2治疗后IL-17A分泌与对照组相似(图1)。 3F )。这些数据进一步证实，Vγ1γδT细胞是肿瘤组织中主要产生IL-17A的γδT细胞，BTNL 2阻断剂的抗肿瘤作用依赖于对Vγ1γδT 17细胞的调控。这一发现也与先前报道的Vγ1γδT细胞在肿瘤发生中的促肿瘤作用相一致。 55 。BTNL 2通过Vγ1γδT细胞调控肿瘤发生，其可能机制之一是BTNL 2通过Vγ1γδTCR直接结合Vγ1γδT细胞。为了探索这一假说，我们首先研究了BTNL 2是否能特异性地结合Vγ1γδT细胞。有趣的是，我们确实发现BTNL2-FC结合了Vγ1γδT细胞，而没有发现Vγ2和Vγ7γδT细胞(补充图)。 4B )。与BTNL 2抑制CD4活化的结果一致。 + T细胞，btnl-2-fc也与CD4结合。 + T细胞(附图) 4B )。为了研究BTNL 2是否与Vγ1γδTCR结合，我们在293个T细胞中重组了TCR Vγ1.1和TCR Vδ6.3，因为据报道，γδT细胞中Vγ1.1与Vδ6.3成对。 56 ,57 。我们没有发现BTNL 2与TCR Vγ1.1Vδ6.3结合，结果表明γδT细胞上的受体不是TCR Vγ1γδTCR(补充图1)。 4C
图3：肿瘤浸润的IL-17A细胞主要为Vγ1γδT细胞. a , b 从CT26和A20皮下肿瘤中分离出浸润细胞，并进行流式细胞仪分析。 n =17， P < 0.0001). c , d 肿瘤浸润细胞 c )，A20( d )分离，然后用流式细胞仪进行分析。 n =16 c 和 n =16 d ). e Vγ1γδT细胞被中和抗体(80μg/鼠)耗尽，CT2 6肿瘤生长动力学。 n =每组13， P =0.0351用于控制和控制+α-Vγ1， P < 0.0001 for control vs α-BTNL2, NS for control+α-Vγ1 vs α-BTNL2 + α-Vγ1). The depletion effect of Vγ1 γδ T cells in the IEL was shown in the right panel (n =7， P < 0.0001). f CT26肿瘤的处理方式为 e 用ELISA法检测TME浸润细胞分泌IL-17A的情况。 n =12， P < 0.0001 for control vs α-BTNL2, control+α-Vγ1 and α-BTNL2 + α-Vγ1). All data are mean ± s.e.m. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 based on two-sided Mann–Whitney test for (a , b )，双向方差分析( e )和单向方差分析( f )。数据是三个独立实验的代表。
BTNL 2阻断减少MDSC的肿瘤内积累 Mdscs曾被证明是促进肿瘤的γδt17细胞的重要下游靶细胞群。 18 ,21 + Ly6G - Ly6C 高 )和粒细胞(CD11b) + Ly6G + Ly6C 低层 )MDSCs，具有相同的单核细胞和中性粒细胞表面标记。 58 ,59 。我们发现，与对照组相比，抗BTNL 2单抗治疗后中性粒细胞的肿瘤浸润明显减少(图1)。 4A )。我们还检测到两种不同的CD 45 + Ly6G − 受抗BTNL 2单抗处理影响较大的亚群体：CD 45中表达群体显著减少，CD 45高表达群体在抗btnL 2单抗治疗后显著增加。为了方便起见，我们将这两个种群命名为“1”和“2”，发现它们分别与肿瘤大小呈正相关和负相关(图一)。 4A )。我们怀疑‘1’群体代表MDSCs，事实上，我们发现90%以上的‘1’群体高度表达单核细胞MDSCs标记CD11b和Ly6C(补充图)。 5A )。在其余细胞中，~1%为树突状细胞(DC)，6%为巨噬细胞(附图)。 5B )。有趣的是，几乎所有肿瘤浸润的中性粒细胞都与粒细胞MDSCs相一致，这表明它们是相同的细胞(附图)。 5A )。这些数据表明BTNL 2阻断剂可减少单核和粒细胞MDSCs对肿瘤的浸润。与这一发现相一致的是，CD 45 + CD11b + GR-1 + 在抗BTNL 2单抗治疗后，MDSC的数量实际上减少了，这在CT 26肿瘤模型中是正确的。 4B )。考虑到“2”群体的侧向散射特征，我们怀疑这些细胞主要是淋巴细胞。事实上，我们发现85%的‘2’人口是由CD8组成的。 + 、γδ + 和CD4 + T细胞(图1. 4C )。CD 45浸润 + CD8 + 与对照抗体相比，抗BTNL 2单抗治疗后TME中的T细胞显著增加(图1)。 4D )。重要的是，CD8 + 干扰素-γ + 阻断BTNL 2后，T细胞数量显著增加(图二)。 4E )。BTNL 2抑制导致MDSC浸润减少，而CD8增加。 + 干扰素-γ + T细胞，在TME在A20肿瘤模型中。 4F，g )。CD8耗竭 + 用抗cd8a中和抗体治疗荷瘤小鼠T细胞，抗btnl 2的抗肿瘤作用完全消失，提示CD8。 + T细胞是BTNL 2阻断后的主要肿瘤细胞。 4H，i )。为了进一步研究mdSCs在btnl 2阻断抗肿瘤作用中的作用，我们用cd11b中和抗体耗尽了荷瘤小鼠的mdSCs，但没有使用抗gr-1 mAb，因为我们检测到CD8。 + 淋巴细胞在TME中表达Ly6C(补充图)。 5C )。MDSCs的耗竭完全消除了以前观察到的CD8的增加。 + 干扰素-γ + T细胞肿瘤浸润及BTNL 2阻断对肿瘤的治疗作用(图二)。 4H-j )。与以往报道一致，MDSCs在体外系统中明显抑制CD8+T细胞和OVA肽刺激的OT-1 CD8+T细胞的增殖(附图)。 5D，e )。与此相一致的是，IL-17A中和也导致mdc降低，CD8增加。 + 干扰素-γ + T细胞在TME中的浸润(图1)。 4K )。重组IL-17A-FC蛋白可阻断btnL 2阻断剂介导的MDSC的减少和CD8的升高。 + 干扰素-γ + TME细胞浸润(附图) 5F，g )。这些结果进一步证明btnl 2阻断的抗肿瘤作用至少部分是通过减少γδt17细胞在tme中的浸润，从而减少mdscs的肿瘤浸润，进而导致细胞毒性CD8的增加而实现的。 + T细胞浸润。
图4：抗BTNL 2单抗治疗可减少MDSCs的肿瘤浸润。 阿-戊 用流式细胞仪对皮下CT 26肿瘤的浸润细胞进行流式细胞术(FCM)分析，并与对照抗体和抗BTNL 2单抗(200μg/鼠)进行比较。 a , n =12， P =0.0089(CD 45) + Ly6G + 细胞百分比， P =0.0012的“1号”细胞百分比， P “2号”细胞百分比=0.0055； b , n =12， P =0.0001； d , n =13， P CD8α=0.002 + ，NS为CD4 + 和γδTCR + ; e , n =13， P =0.0014)。 c ‘2号’细胞群被CD4进一步封闭。 + 、CD8 + 或γδTCR + ，并对不同细胞群体的百分比进行了分析。 f , g 经同类型对照抗体或抗BTNL 2单抗(200μg/鼠)处理后，分离出20株肿瘤浸润细胞，并进行流式细胞仪分析。 n =15， P =0.0005 f ，和 n =13， P =0.0131 g ). h CD8 + 用材料和方法中所述的中和抗体(用100μg/鼠抗CD8或抗CD11b单抗)对T细胞或CD11b+细胞进行了灭活，并给出了同型对照抗体或抗BTNL 2单抗处理的CT26肿瘤生长动力学。 n =每组16， P =0.004用于控制和α-BTNL 2， P < 0.0001 for control vs control+CD8 depletion and control vs control + CD11b depletion, NS for control+CD8 depletion vs α-BTNL2 + CD8 depletion and control+CD11b depletion vs α-BTNL2 + CD11b depletion). i CD8+T细胞或CD11b+细胞被中和抗体(100μg/鼠)耗竭，脾细胞用流式细胞术检测CD8+T细胞和CD11b+细胞。 n =10和16， P < 0.0001). j 经CD11b细胞耗竭对照抗体或抗BTNL 2单抗(抗CD11b单抗100μg/鼠和抗btnL 2 mAb 2 0 0μg/鼠)处理后，用流式细胞仪对皮下CT2 6肿瘤中的浸润细胞进行分析。 n 每组=13，对照组NS=α-BTNL 2)。 k 经IL-17A中和及同类型对照抗体或抗BTNL 2单抗(抗IL-17A单抗100μg/鼠和抗BTNL 2 mAb 2 0 0μg/鼠)处理后，用流式细胞仪对皮下CT2 6细胞进行分析。 n =每组15， P =0.0103对α-BTNL2MDSCs百分比， P 对照组为0.0738%，α为IL-17A，NS为α-IL-17A对α-BTNL 2+α-IL-17A， P =0.0007(对照组vsα-btnl 2和对照组vsα-IL-17A CD8α)。 + 干扰素-γ + α-IL-17A和α-btnL 2+α-IL-17A CD8α细胞百分比 + 干扰素-γ + 细胞百分比)。所有数据均为平均±S.E.M。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 based on two-way ANOVA for h ，邓恩的多重比较测验 k ，双边Mann-Whitney检验 j 双面不成对 t -测试 阿-戊 , f , g , i 。数据是三个独立实验的代表。
BTNL 2的肿瘤表达在抗肿瘤免疫逃逸中起重要作用。 其次，通过检测BTNL-2-KO小鼠的表型，探讨BTNL 2的生理作用。与对照组相比，BTNL2-KO小鼠在6个月大鼠的存活和体重方面没有任何明显的异常(补充图)。 6a，b )。有趣的是，BTNL 2蛋白仅在小鼠胃肠道中表达，特别是在小肠上皮细胞中有较强的表达(附图)。 6C，d )。BTNL 2缺陷小鼠的组织学检查显示了大肠炎症以及结肠隐窝结构的丢失(补充图)。 6E )。与这些发现一致的是，促炎细胞因子的表达，包括 肿瘤坏死因子α 和 IL-1β ，BTNL-2-KO小鼠结肠组织中，与对照组相比显著增加(附图)。 6f )。肠上皮淋巴细胞计数显示BTNL-2-KO小鼠γδT_(17)细胞明显减少，而IFN-γ产生的γδT细胞群无明显变化(补充图)。 6g )。提示BTNL 2是肠内γδT细胞分化的生理调节因子，可被肿瘤细胞用来逃避抗肿瘤免疫监视。
然后，我们探讨了基因BTNL 2缺陷对抗肿瘤免疫反应的影响。野生型LLC肿瘤在BTNL2-KO小鼠中的生长明显弱于对照组小鼠，但差异无统计学意义(图二)。 5A )。BTNL 2基因缺失的LLC肿瘤细胞(BTNL 2-KO LLC)在体内的生长速度明显低于野生型LLC肿瘤，但与BTNL 2-KO LLC细胞的体外增殖无明显差异(图1)。 5B-d )。一致地，btnl 2-ko llc肿瘤浸润γδt17细胞和mdSCs的数量显著减少，而浸润CD8的细胞数则显著增加。 + 干扰素-γ + T细胞，与野生型LLC肿瘤相比(图1)。 5E )。BTNL 2-KO LLC瘤在对照组小鼠和BTNL 2-KO小鼠的肿瘤生长无明显差异(图1)。 5F )。这些数据表明BTNL 2的肿瘤细胞自主表达在TME的免疫监视中起着重要的作用，我们认为非肿瘤细胞表达的bTNL 2在这一过程中起着次要的作用。重要的是，由于抗pd-1治疗缺乏反应，先前的研究已经将llc肿瘤模型归类为非免疫原性“冷”小鼠肿瘤。 60 ,61 。对该肿瘤的显著治疗作用表明，抗体介导的抑制BTNL 2可能与抗PD-1/PD-L1 ICBS联合使用，并且可能为以前被认为“冷”的肿瘤的免疫治疗打开大门。
图5：肿瘤表达的BTNL 2在抗肿瘤免疫逃逸中起重要作用。 a 将未白蚁对照小鼠或BTNL2-KO小鼠植入WT LLC细胞，观察小鼠肿瘤生长动力学。 n =每组12人)。 b 荷瘤小鼠皮下植入WT LLC细胞或BTNL 2-KO LLC细胞克隆(3×10) 5 /小鼠)，肿瘤生长动力学显示( n =每组14， P =0.0001适用于LLC-WT和LLC-BTNL 2-KO-1和 P < 0.0001 for LLC-WT vs LLC-BTNL2-KO-2). c 采用抗BTNL 2单抗-2进行流式细胞仪分析，对WT或BTNL 2-KO LLC细胞进行分析。肿瘤图像 b 显示(下面板)。 d WT-LLC细胞或BTNL-2-KOLLC细胞体外培养一定时间，细胞计数显示细胞增殖。 e 从WT LLC肿瘤或BTNL 2-KO LLC肿瘤中分离细胞，并进行流式细胞仪分析。 n =每组14， P =0.0022的LLC-WT和LLC-BTNL 2-KO-1γδT17细胞百分比和 P LLC-WT与LLC-BTNL 2-KO-2γδT17细胞百分率=0.0006， P =0.0189对于LLC-WT和LLC-BTNL 2-KO-1 MDSCs细胞百分比和 P =0.0064的LLC-WT和LLC-BTNL 2-KO-2 MDSCs细胞百分比， P LLC-WT与LLC-BTNL 2-KO-1 CD8α=0.0011 + 干扰素-γ + 细胞百分比 P LLC-WT与LLC-BTNL 2-KO-2 CD8α=0.0001 + 干扰素-γ + 细胞百分比)。 f 用WT或BTNL 2-KO LLC细胞移植小白鼠或BTNL 2-KO小鼠，观察小鼠肿瘤生长动力学。 n =每组12， P < 0.0001 for control mice were implanted with WT vs BTNL2-KO LLC cells, NS for control mice or BTNL2-KO mice were implanted with BTNL2-KO LLC cells and control mice or BTNL2-KO mice were implanted with WT LLC cells). All data are mean ± s.e.m. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 based on two-way ANOVA for a , b，d , f 和邓恩的多重比较测试 e 。数据是三个独立实验的代表。
BTNL 2在人肿瘤中的表达与患者预后及γδT17浸润的关系 BTNL 2基因多态性与肺腺癌易感性 40 ,41 ，据报道，γδT 17细胞在人结直肠癌的进展中发挥着关键作用，其机制是通过招募mdscs来实现的。 23 。因此，我们检验了BTNL 2表达水平与这两种癌症患者预后之间可能存在相关性的假设。表达低水平BTNL 2的肺腺癌和结肠腺癌患者与高表达BTNL 2的患者相比，其生存率有明显提高(见图)。 6a，b )。我们扩大了我们的研究，以包括其他类型的癌症，并发现BTNL 2确实是广泛表达的，在所有检查的人类癌症样本中检测到了BTNL 2的表达(补充图)。 7a，b )。在癌旁未受影响的组织中，BTNL 2的表达明显低于肺腺癌和结肠腺癌的表达，与Pd-L1的表达模式非常相似。 7C-e )。重要的是，38%的肺腺癌组织中有中至高水平的BTNL 2表达，而pd-L1的表达水平较低。这一发现表明，BTNL 2可能是该亚类患者的辅助治疗靶点(图1)。 6C
图6：BTNL 2在人肿瘤中的表达与患者预后相关。 a , b Kaplan-Meier估计肺腺癌的总生存率( a )和结肠腺癌患者 b 基于BTNL 2的表达水平 n =91 a 和 n =99 b )。根据材料和方法所描述的免疫组化评分系统，对BTNL 2高表达组(≥9)和低BTNL 2表达组(评分<9分)进行比较。 c 结果表明，肺腺癌组织中BTNL 2和Pd-L1表达模式不同，≥5为中、高表达，≤4为低表达。M-h‘表示BTNL 2中至高表达水平。 d 从肺腺癌和癌旁标本中分离出细胞。 n 2 3)，流式细胞仪染色。 e 采用westernblot方法对23对肺癌患者和癌旁组织标本的裂解物进行了分析，并对标记蛋白进行了检测。BTNL 2高表达，PD-L1低表达的样本数标记为红色。 f 用4号患者的癌组织标本对与重组HI-hBTNL 2蛋白共同孵育的BTNL 2抗体进行了检测，并对BTNL 2进行了Westernblot分析(下面板)。 g 用westernblot分析了27对肝癌患者癌旁和癌旁组织的裂解物，并对其进行了蛋白质分析。BTNL 2高表达的样本数标记为红色。所有数据均为平均±S.E.M。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 based on Log-rank (Mantel-Cox) test for a 和 b 和双边曼恩-惠特尼试验 d 。数据 E-g 是三个独立实验的代表。
在肺腺癌组织中，BTNL 2主要由癌细胞表达(附图)。 7F )。新分离的肺腺癌组织中γδT17细胞的丰度也显著高于癌旁组织，更重要的是，几乎所有癌旁组织中BTNL 2的蛋白水平都比癌旁组织高得多(如图1所示)。 6d-f )。值得注意的是，在23例(1、3、7、9、13、15和20)标本中，肿瘤组织中BTNL 2的表达明显高于癌旁组织，而pd-L1的表达无显着性差异。这一发现表明，BTNL 2可能比pd-L1更能代表这些肿瘤中免疫逃避的关键机制(图一)。 6E )。有趣的是，27例肝癌组织中有9例BTNL 2表达高于癌旁组织(1、14、15、18、19、22、24、25和26)，而10例(3、4、5、6、8、10、13、16、17、20)肿瘤组织中BTNL 2的表达低于癌旁组织。在27例肝细胞癌标本中，25例Pd-L1的表达模式(相对表达在癌旁组织中)反映了BTNL 2的表达模式(如图所示)。 6g )。提示BTNL 2可能在肝细胞癌的肿瘤免疫逃逸中起一定作用。值得注意的是，大多数肝癌标本来自慢性乙型肝炎病毒感染患者(编号1-7，11-27)，因此BTNL 2在癌旁组织中的表达可能不反映在未感染的肝组织中的表达。
其次，我们详细分析了BTNL 2在肺腺癌中的表达模式。我们发现BTNL 2在癌旁组织中几乎不表达。 7a，b )。此外，我们还发现btnL 2的表达可靠地反映了Napsin A的表达，这是一个成熟的肺腺癌生物标志物(图1)。 7a，b )。这表明BTNL 2不仅是肿瘤免疫治疗的一个有吸引力的靶点，而且可能作为肺腺癌的一个生物标志物。
图7：BTNL 2在部分Pd-1抑制剂耐药肺癌标本中表达强烈。 a , b 免疫组织化学染色显示肺腺癌组织中BTNL 2和Napsin A的表达(切片切片用抗BTNL 2和抗Napsin A染色)。标尺=202μm a ，标尺=50μm b 。“P”代表癌旁组织，“C”代表癌组织。 c TME中BTNL 2阻滞的示意图显示，肿瘤细胞表达的BTNL 2促进了γδT 17细胞的分化，从而使MDSCs进入TME，抑制CD8+T细胞的细胞毒性功能。单抗阻断BTNL 2可使γδT 17细胞分化，并使其重新激活CD8+T细胞，发挥其对肿瘤的杀伤作用。数据 a , b 是三个独立实验的代表。
