SGL特异性T细胞体外共受体的表达
我们首先利用负载生物验证的合成sgl类似物的cd1b四聚体，确定sgl特异性T细胞直接表达哪种共受体。25。我们检测了5名美国健康献血者、5名患有潜在结核病感染(LTBI)的南非青少年和5名没有LTBI(补充表)的南非青少年外周血单个核细胞(PBMC)。1，补充表2，以及附图。1)26。为了确保抗原特异性T细胞的准确识别，我们采用了一种双四聚体标记策略，结合用两种不同的氟色标记的SGL-CD1b四聚体，并将SGL特异性T细胞定义为两种四聚体染色，同时用模拟负载的CD1b四聚体未标记。1A，补充图。1)。盖茨定义SGL-CD1b四聚体阳性细胞是基于染色的SGL特异性T细胞和荧光负一(FMO)对照(图)。1A)25。代表染色从一个人显示(图)。1B)。各组间SGL-CD1b四聚体阳性T细胞频率无显着性差异(P>0.05)。p=0.4，附图。1).
图1：SGL特异性T细胞体外共受体表达。将SGL-CD1b四聚体引入多参数流式细胞术检测SGL特异性T细胞共受体的表达。a用电子偶联染料(ECD)、异生藻蓝蛋白(APC)和荧光负一(FMO)阴性对照(左、中)的双四聚体染色确定四聚体阳性门，用供体PBMC稀释的SGL特异性T细胞株(A05)作为阳性对照(右)。b一名南非青少年献血者的代表性染色。c用冷冻保存的PBMC对三组健康受试者SGL-CD1b四聚体阳性T细胞的共受体表达进行定量研究：美国对照组，低风险接触M.tb。n5)、南非潜伏结核病青少年(IGRA-阳性，n=5)，以及没有潜伏结核病的南非青少年(IGRA-阴性，n=5)。Box图将数据集的最小和最大描述为最小和最大，不包括离群点，每个协受体组(双阳性(DP)、CD4、CD8和双阴性(DN))内的中间和四分位范围内的四聚体阳性细胞(灰色)，以总阳性细胞的百分比表示。每个点代表一个个体的百分比，实线连接每个个体。将各组细胞百分比与CD3+T细胞总数(白色)进行比较。(带Bonferroni校正的双边Wilcoxon符号秩检验，**=0.003或0.004，n=15)。dBox图将数据集的最小和最大描述为数据集的最小和最大数目，不包括异常值、每个协受体组SGL-CD1b四聚体阳性细胞的平均荧光强度(MFI)的中位数和四分位数范围(MFI)。每个点代表一个样本的MFI，而实线连接每个个体。比较各组间的MFI(双边Friedman检验与后特设Dunn检验，*)。p < 0.0001, ** = 0.003, n=15)。eBox图将数据集的最小和最大描述为数据集的最小和最大，不包括异常值、每个协受体组中四聚体阳性细胞CD3的平均荧光强度(MFI)的中位数和四分位之间的范围。每个点代表一个样本的MFI，而实线连接每个个体。比较各组间的MFI(双边Friedman检验与后特设Dunn检验，*)。p=0.05，n=15)。
Sgl-CD1b特异性T细胞表现出CD4和CD8双阳性细胞(Dp)的18倍富集。p=0.003)，CD4 T细胞增加1.5倍(p=0.003)相对于CD3+T细胞。同时CD8细胞减少5.6倍(p=0.003)，CD4和CD8双阴性(DN)细胞减少2.8倍(p=0.004)(图1。1C)。此外，与DN SGL-CD1b特异性T细胞相比，表达多种共受体的SGL-CD1b特异性T细胞显示出更高的四聚体MFI。p < 0.0001) (Fig. 1D)。我们考虑了四聚体MFI差异可以通过TCR表达差异来解释的可能性。我们发现在DP，CD4和CD8 T细胞中CD3ε的表达没有差异(见图)。1E)。然而，与其他组相比，我们确实检测到DN T细胞中的CD3εMFI降低了4%(p=0.05)(图1。1E)。另外，我们量化了这些供者的所有DP、CD4、CD8和DN T细胞中CD3ε的表达水平，发现CD4和DN T细胞表达的CD3水平高于CD8 T细胞，这与文献报道一致。p < 0.0001 and p分别=0.004，附图。1)27。综上所述，这些数据揭示了表达CD4共受体的SGL特异性T细胞在外周血中以最高频率存在的层次结构，在MFI最高时用SGL-CD1b四聚体染色，其次是CD8和DN T细胞。
共受体增强sgl特异性tcr的功能亲和力
影响tcr抗原亲和力的因素有：抗原提呈分子亲和力、tcr表达水平以及细胞表面CD4和CD8共受体的表达。3,28,29。这些因素对活细胞中TCR结合强度的综合影响被称为“功能性亲和力”，因为这种相互作用具有多价性和多方面性。3。我们的体内外数据表明，表达CD4共受体的SGL特异性T细胞可能比表达CD8的细胞具有更高的功能亲和力。为了直接验证这一假设，我们用LTBI对来自南非成年人的sgl特异性T细胞株进行了检测。25。A01 T细胞内的SGL-CD1b四聚体染色细胞几乎全部表达异二聚体CD8ɑβ共受体，而A05 T细胞株则明显偏向CD4表达(补充图)。2)。A05的SGL-CD1b四聚体MFI比A01高5.5倍(p=0.03)(附图。2).
我们认为A01和A05之间所观察到的四聚体MFI的差异可能是由于其TCRs的差异所致。事实上，a01和a05各表达一个不同的tcr，对于CD1b-sgl复合物来说，它们可能有不同的亲缘关系，而不依赖于协受体(表)。1)。为了解决这一问题，我们从一位具有A05 TCR表达结构的血库供体中克隆和转导了多克隆T细胞(如图所示)。2A)。将表达结构中TCR的恒定区域替换为小鼠TCR恒定区，以定量表达外源TCR。在成功转导的T细胞中，如外源性TCR的表达和抗小鼠TCR-β链常数区染色所示，88%的细胞与SGL-CD1b四聚体共染色，表明TCR的表达足以与SGL-CD1b四聚体结合。2A)。为了进一步证明sgl-cd1b四聚体染色的特异性，我们还将一种特异性的tcr导入Jurkat细胞。30(补充图。3)。这些GMM特异性的Jurkat细胞强烈地结合GMM-CD1b四聚体，而它们基本上不能结合SGL-CD1b四聚体和模拟负载的CD1b四聚体(补充图)。3)。我们还试图在原代T细胞中表达A01TCR，但要成功地进行四聚体染色，就需要异常高水平的TCR表达。这些数据支持了我们的假设，即A01和A05在四聚体染色上的差异很大程度上可能是由于它们的TCR。然而，通过使用含有CD4、CD8和DN的转导多克隆T细胞，我们可以专门研究与TCR无关的协受体的作用。
图2：共受体增强SGL特异性TCR的功能亲和力.a原代T细胞用慢病毒载体从A05 T细胞中导入TCR。在未转染外源性TCR的原代T细胞中，用SGL-CD1b四聚体或mTCRBC抗体(TOP)染色0%。细胞经TCR转导后，用SGL-CD1b四聚体和mTCRBC抗体(底部)染色。b流式细胞图描述了CD4，CD8或DN转导T细胞的百分比。Boxart描绘了sgl-CD1b或mTCRBC mTcrbMFI与a05 tcr传递的每个CD4、CD8和DN T细胞的中间和四分位范围(双向方差分析，后特发邓恩检验，*)。p < 0.0001, n=86 520)。数据代表了A05 T细胞株TCR的两轮独立的原代T细胞转导。c通过限制性稀释法克隆，从原代T细胞转化物中获得单细胞克隆.比较用SGL-CD1b四聚体染色的典型CD4(黑色)和CD8(白色)T细胞克隆(左)。A无四聚体控件也表示(灰色)(左)。Box图将最小和最大描述为数据集的最小和最大数目，不包括异常值、CD4(黑色)和CD8(白色)克隆的SGL-CD1b MFI的中位数和中间四分位范围(双边Mann-Whitney检验)，p=0.019，n=16)。d用IFN-γELISPOT法检测CD4(黑色)和CD8(白色)T细胞克隆的抗原特异性活化。误差条表示标准偏差，误差条的中心是三层井的平均值。Sgl由1g/ml连续稀释至10倍。−7数据代表两个独立的实验。
在经A05 TCR转导的T细胞中，表达CD4最多的是四聚体MFI，其次是CD8和DN T细胞。p < 0.0001) (Fig. 2B)。在mTCRBC中也发现了这种相对的层次结构，表明外源性tcr表达后的表达水平也因共受体的表达而不同。p < 0.0001) (Fig. 2B)。为了探索这些发现是否具有普遍性，我们使用针对gmm的CD1b限制tcr重复了这些实验。30。我们再次观察到，CD4+T细胞被最高的MFI染色，表达CD3、ϵ的水平最高，其次是CD8和DN T细胞(附图)。4)。我们使与A05 TCR转导的T细胞受到稀释克隆的限制，试图产生一个与外源TCR表达水平相当的克隆。然而，我们注意到sgl-CD1b四聚体在较高的MFI上染色的CD4克隆始终高于CD8克隆(p也表达了较高水平的mTCRBC(p=0.005)(图1。2C)。这些数据提示CD4 T细胞可能内在地表达较CD8 T细胞更高水平的外源性TCR，或在传递慢病毒载体方面具有内在优势。最后，我们通过测定在滴加量的SGL存在下IFN-γ的产生，评估了A05 TCR介导的CD4和CD8 T细胞在T细胞活化方面的差异。A05-CD4 T细胞克隆显示为EC。500.0006 g/ml，比A05-CD8 T细胞克隆值低100倍。二维空间)。值得注意的是，在本实验中使用的克隆在SGL-CD1b四聚体结合和TCR表达方面也有差异(见图)。2C)。综上所述，这些数据表明，与CD8 T细胞相比，CD4 T细胞表现出四聚体结合和TCR表达的增加，尽管表达相同的TCR，但在限制抗原浓度时，CD4 T细胞对激活的敏感性增强。
CD8足以增强sgl特异性tcr的功能亲和力。
表达CD4、CD8或两种共受体的原发性T细胞除了其共受体可能影响sgl-CD1b复合物的功能亲和力外，还表现出其他生物学差异。31。为了解决这一问题，我们将A05 TCR导入DNJurkat T细胞株和稳定表达CD8αα的等基因T细胞株中。与原代T细胞一样，A05 TCR也足以在Jurkat T细胞中进行SGL-CD1b四聚体染色。3A)。在CD8αα表达的Jurkat T细胞中，SGL-CD1b四聚体MFI比DN T细胞高1.59倍。p=0.03)(图1。3B)。值得注意的是，与DN T细胞相比，CD8αα中mTCRBC的表达也高出1.74倍，表明A05 TCR的表达水平较高(p=0.03)(图1。3B)。为了进一步研究这一点，我们在将CD8αα表达分层为对数梯田后，对SGL-CD1b MFI进行了分析。3C，左)。CD8嗨Jurkat细胞的MFI最高，是CD8的1.32倍。医学博士Jurkats和2.35-比CD8高出2.35倍罗氏尤尔克茨p=0.0002)(图1。3C(中)当我们比较mTCRBC的表达水平时，我们发现CD8嗨Jurkat细胞的MFI最高，其次是CD8。医学博士和CD8罗氏尤尔克茨p=0.0002)(图1。3C，右)。这些数据支持了我们的假说，即共受体的表达足以增加SGL-CD1b四聚体的功能亲和力，其机制之一是增加TCR复合物在细胞表面的表达。
图3：CD8足以增强SGL特异性TCR的功能亲和力.a从A05 T细胞株经TCR转染DN和CD8 Jurkat细胞株。未转导的CD8 Jurkat细胞不受SGL-CD1b四聚体或小鼠T细胞受体链常数区(MTCRBC)特异性抗体(TOP)的影响。细胞经TCR转导后，用SGL-CD1b四聚体和mTCRBC抗体(底部)染色。bCD8和DN Jurkat细胞表达TCR共受体的梯度。盖茨包括真正的“CD8”(左，上)和“DN”(左，下)细胞，分别只表达CD8或没有共同受体。值得注意的是，表达CD8的Jurkat细胞呈梯度表达，而DN Jurkat细胞则表现出低水平的CD4共受体表达。比较DN和CD8 Jurkat细胞SGL-CD1b MFI的分布(双边Mann-Whitney，p=0.03，n=4)。A无四聚体控制也代表(右)。比较DN和CD8 Jurkat细胞mTCRBC MFI的分布(右)(Mann-Whitney，p=0.03，n=4)。Box图将最小和最大描述为数据集的最小和最大数目，不包括异常值、MFI的中间和四分位数范围。cCD8细胞SGL-CD1b MFI的分布嗨(最惠国为104–105)，CD8医学博士(最惠国为103–104)，和CD8罗氏(最惠国为0-103)Jurkat细胞被评估(双边Friedman试验与后特别邓恩试验，p=0.005，n=3)。CD8细胞mTCRBC MFI的分布嗨、CD8医学博士，和CD8罗氏然后将Jurkat细胞进行比较(右)(双边Friedman试验和后特设Dunn试验，p=0.005，n=3)。Box图将最小和最大描述为数据集的最小和最大数目，不包括异常值、荧光强度的中值和四分位数范围。数据是三个独立实验的代表。
糖脂特异性T细胞表达不同的TCR序列
为了直接在体内分析CD4和CD8特异性T细胞，我们使用sgl-cd1b和gmm-cd1b四聚体对4名新诊断为活动性肺结核的南非成年人进行了单细胞分类。32。在本实验中，我们包括GMM特异性T细胞和以已知TCRs为对照的T细胞株，以验证我们的四聚体分选策略。盖茨定义CD1b四聚体阳性细胞的依据是未被四聚体染色的对照组，以及SGL-和GMM特异性T细胞株(补充图)。1)。为了验证我们的分类策略，我们首先用已知的TCR评估从T细胞中恢复的TCRs。我们注意到，从这些井中恢复的V基因、J基因和CDR 3与已知的TCRs(来源数据)相匹配。此外，由于一些研究强调TRAv 1-2在gmm特异性tcrs中的富集，我们接下来比较gmm-cd1b四聚体分类细胞和来自同一个体的大量T细胞中TRAv 1-2的频率，以验证可靠地分离出脂类抗原特异性T细胞的四聚体分类策略。30,33,34。我们发现10%的TCRs表达TRAV 1-2，与之相比，只有2.9%的T细胞表达TRAV 1-2。p=0.0005)(附图。5，补充表3)。我们还能够识别在不同的GMM特异性TCR库中描述的TCR V基因，如TRAV 17、TRAV 8、TRAV 12和TRAV 13(补充图1)。5)30,33,34.
由于对sgl特异性tcrs的了解相对较少，我们首先比较了从sgl-cd1b四聚体分类的细胞中回收的tcr可变基因与我们的a01和a05 T细胞的tcrs(表)。1)。从SGL-CD1b四聚体细胞中回收的TCRs中，4.7%使用TRAV 8-6(A01)，1.6%使用TRAV 13-2(A05)，而体积T细胞的比例分别为2.1%和1.0%。p=0.053和p分别=0.35)(补充图。5，补充表3)。我们还发现，从SGL-CD1b四聚体分类细胞中恢复的TCRs中，有6.2%使用TRAV 21，6.2%使用TRAV 19，而体积T细胞中只有2.9%和4.2%。p=0.031和p分别=0.26)(附图。5，补充表3)。这些数据显示，SGL特异性T细胞直接在体内外表达不同的TCRs，可能对CD1b具有不同的功能亲和力。
接下来，我们检测了tcr-α链基因对CD4和CD8 sgl特异性T细胞的使用情况，以确定tcr链在这些亚群之间是否有区别。n=38和n分别=43)。总之，我们检测到的V基因中有30%是CD4和CD8的SGL特异性T细胞(补充图)。6)。在多个TCR中发现的基因中，TRAV 21和TRAV 12-2在CD8SGL特异性T细胞(p=0.06和p分别=0.12)(附图。6)。我们还发现TRAV 2、TRAV 29和TRAV 9-2在CD4 SGL特异性T细胞(p=0.10，p=0.21，p分别=0.21)(补充图。6)。这些数据表明CD4和CD8 SGL特异性T细胞的TCR储备可能是不同的。
CD4和CD8识别糖脂特异性T细胞之间的功能上不同的间隔。
为了研究CD4或CD8共受体的表达是否与不同的功能结构有关，我们使用靶向扩增23个基因来检测单个gmm-和sgl特异性T细胞表达这些转录本。n=223)和四聚体阴性T细胞(n=43)在两名活动性肺结核患者中。我们还包括具有已知功能特征的T细胞系作为阳性对照(n=6)35(补充表格)4, 5)。我们对检测到CD4或CD8转录的细胞进行了监督分析(272个细胞中有104个)。我们首先利用层次聚类来显示整体的多样性以及CD4+和CD8+CD1b限制性T细胞之间的关系。表达CD4和CD8共受体的T细胞在空间上分离，表明它们表达独特的转录谱(图一)。4A)。值得注意的是，我们检测到所有调控T的主转录因子的表达。H1 (特贝特)，TH2 (GATA 3)，TH17 (RORC)，以及T雷格 (Foxp 3)功能分布图，表示CD1b限制性T细胞以前未描述的功能多样性(图1)。4A)。值得注意的是，MKI 67我们最后分析的CD1b限制性T细胞表达率为14.2%，四聚体阴性T细胞表达率为0%，提示CD1b限制性T细胞在采集标本时增殖，而活动性肺结核患者外周血T细胞中Ki-67的表达不普遍。p=0.12)(图1。4A).
图4：体外CD4和CD8 CD1b限制性T细胞基因表达差异。aX轴和y轴上的树状图概括了细胞(Y)或基因(X)之间的相似性，其中距离与不同的水平成正比。这种关系是通过使用二进制距离度量的完全连锁层次聚类来计算的。CD4和CD8基因X-轴心已加粗线以供强调。b–e条形图总结了CD4(黑色)和CD8(白色)T细胞的表达率。特贝特 (b), PRF 1 (c), 埃梅斯 (d)，以及BCL 6 (e) (n=104)(双面Fisher‘s精确检验，Benjamin amini-Hochberg修正)。统计测试摘要列于补充表格内。4.
接下来，我们试图找出导致CD4和CD8 CD1b限制性T细胞差异的差异基因(DEGS)。4B-E)。我们发现特贝特和PRF 1与CD4 T细胞相比，CD8 T细胞富集，并注意到一种趋势埃梅斯在CD8 T细胞中，提示CD8菌斑限制性T细胞的细胞毒性表型(图一)。4B-d，补充表4) (p分别=0.02、0.04、0.08)。我们还检测到了T的富集FH转录因子BCL 6在CD4 T细胞中，表明CD4 CD1b限制性T细胞之间的功能异质性(如图所示)。4E，补充表4) (p=0.02)。
这些数据的补充是比较我们的体外T细胞株A01和A05的功能谱，它们分别表达CD8和CD4共受体(补充图)。2)。在sgl和K 562抗原提呈细胞存在下，我们用先前优化的细胞因子染色板分析了细胞因子的表达，这些细胞已经稳定地转染成CD1b(K 562-CD1b)或空载体(K 562-ev)。36,37。两种T细胞株的大部分细胞在SGL存在下均表达IFN-γ、TNF和IL-2。5A)。相反，T细胞在CD40L和CD107a的表达上存在差异，后者分别是B细胞帮助和脱颗粒的标志。p=0.03和p分别=0.03)(图1)。5A)。A01分泌的颗粒酶B也比A05多10倍，在抗原存在的情况下特异性裂解67%的靶细胞，而在没有抗原的情况下则没有明显的溶解。p=0.03)(图1。5B，c、d)。比较而言，A05在抗原存在的情况下，在无抗原存在的情况下，不表现出细胞溶解活性。p=0.4)(图1。5C，d)。综上所述，这些数据支持了我们的目标转录谱实验的结论，并表明表达CD4的SGL特异性T细胞一般会表达与T辅助表型一致的细胞因子，而那些表达CD8的T细胞则具有细胞毒性效应表型。
图5：A01和A05 T细胞株的功能轮廓。aA01(白色)和A05(黑色)T细胞与K 562-CD1b或K 562-EV抗原提呈细胞与SGL抗原共孵育6h后，用细胞内细胞因子染色法检测细胞因子的生成，数据以表达细胞因子的T细胞百分比表示，占CD3+T细胞总数的百分比。百分比通过减去与K 562-EV抗原提呈细胞和SGL共孵育6小时后表达细胞因子的T细胞百分比进行背景校正，误差条表示四种技术复制的平均偏差和标准差。点代表一个复制的值。(*)p=0.03，双面曼恩-惠特尼，n=8)。数据代表至少两个独立的实验。bA01(白色)和A05(黑色)T细胞经与K 562-CD1b抗原提呈细胞和SGL抗原共同孵育后，产生颗粒酶B(GzmB)。隔夜培养细胞，用GzmB ELISPOT检测GzmB的产量。抗原浓度从1微克/毫升至10微克/毫升不等。−5在对数倍稀释剂中加入10克/毫升。误差条表示标准偏差，误差条的中心是三层井的平均值。数据是两个独立实验的代表。c分别与K 562-EV和K 562-CD1b抗原提呈细胞共孵育A 01(左)和A05(右)T细胞，用细胞微量紫标记“低”和“高”抗原提呈细胞，检测细胞毒性。共培养在SGL抗原存在(黑色)或无(灰色)的条件下进行。我们将特异性裂解定义为T细胞在脂质存在下特异性减少K 562-CD1b细胞的能力，而K 562-EV细胞和K 562-CD1b细胞共孵育后不受冲击抗原的影响。d通过计算实验条件下K 562-CD1b细胞数量减少的百分率与在无T细胞和无脂抗原条件下培养的K 562-CD1b细胞百分比进行比较，计算细胞毒性(附图)。7)(细胞死亡率%)。计算A01(白色)和A05(黑色)T细胞在SGL存在或不存在时的百分比。误差条表示四个技术复制的均值和标准差(*)p=0.03，双面曼恩-惠特尼，n=8)。盒图将最小和最大描述为数据集的最小和最大数目，不包括离群值、%细胞死亡测量值的中位数和四分位数范围。数据代表至少两个独立的实验。
