抑制CPT 1抑制体内多种腹膜氧化脂质的分泌
线粒体β-氧化天然长链脂肪酸需要通过外膜转运体CPT 1摄取其FA-CoA衍生物，其中有a、b、c三种亚型，但氧化脂肪酶能否通过CPT 1导入巨噬细胞尚不清楚。为了在体内验证这一点，将PAN CPT 1抑制剂依莫昔(Etomoxir)腹腔注射(I.P.)将野生型C57BL/6小鼠单独或用细菌脂多糖(1μg)灌胃，6h后取腹腔灌洗，用LC/MS/MS进行分析。1A，b和补充图。1A)。这些被广泛分类为由12/15-LOX，Cox-1/2或CYP 450生成的脂类，尽管有些是来自多个途径(补充数据文件)。1)。许多专家赞成解决调解人(SPM)，包括分解素或保护素，没有被最终检测到。1(MaR 1，7)R,14S-diHDOHE)，可见极小的峰，低于我们的定量限(LOQ)。当注入大量样品并扩大保留时间窗口时，可以看到两个峰，其中一个具有与真实标准相同的保留时间(补充图)。1B)。由于目前的低水平，不可能从符合标准的组织中产生令人信服的MS/MS光谱。两个异构体的检测表明，对映体的7，14-二HDOHE，峰也可能包含共洗脱立体异构体。这暗示了非酶的起源，这个峰更恰当地命名为7，14-二HDOHE。
图1：在体内和腹腔巨噬细胞炎症过程中，CPT 1的抑制显著增加了氧化脂肪酶的水平。a, b个体脂类图显示，CPT 1的抑制提高了氧化脂肪酶的水平，在LPS的炎症刺激下产生了更大的影响。注射野生型小鼠(雌性，7-9周)。与载体(PBS)，依托莫司(100μg)或脂多糖(1μg)。6h后，用SPE提取脂质，用LC/MS/MS进行分析。从12/15-LOX、COX和CYP 450中列举了一系列的血脂示例(n=10)。c, d研究了依托莫昔±脂多糖对腹腔巨噬细胞氧化脂质释放的影响。按方法分离腹腔巨噬细胞，然后在无血清培养基中，在无脂多糖(100 ng/ml)的条件下，加入依托莫昔尔(25μM)培养腹腔巨噬细胞。24h后，取上清，用SPE提取脂质，用LC/MS/MS对其进行分析，得到一系列基于酶源的脂质。n=每个样本3。所有面板的数据均为均值±扫描电镜，单因素方差分析与Tukey后特别检验，仅对依托莫昔的影响进行统计学处理，有显着性意义。在没有显示酒吧的情况下，没有明显的差异。
Etomoxir刺激了几种氧化脂质的少量增加，但当加入LPS时，其影响要大得多，许多脂类的水平有效地增加了一倍(图一)。1A，b)。提示腹膜线粒体CPT 1在健康过程中主动转运生物活性氧化脂质，但在感染过程中其作用明显增强。
CPT 1对腹腔巨噬细胞内源性氧化脂质代谢的调节作用
在体内，巨噬细胞、B细胞和/或腹膜膜(间皮层)中的线粒体可代谢腹膜氧化脂质。幼稚的常驻巨噬细胞，表达COX-1和12/15-LOX(阿洛15)，很可能是主要的基础来源。31。因此，对野生型小鼠的原始腹腔巨噬细胞进行线粒体清除内源性氧化脂肪酶的评估.我们专注于细胞外的形式，因为大多数细胞外分泌的GPCRs是细胞外激活的。使用无血清培养基防止血液中的氧化脂质污染。LPS(24h)刺激幼稚的常驻腹腔巨噬细胞分泌前列腺素(PG)，与COX-2的诱导一致。1C和补充图。1C)。虽然12/15-LOX在未成熟的腹腔巨噬细胞中高表达，但其在培养中的丢失导致单羟基脂肪酸(12-HETE和12/15-HEPES)的生成相对较低。1D和补充图。1D)32。总体而言，腹腔巨噬细胞产生的氧化脂肪酶种类与灌洗液相似，但总数量/多样性较少，CYP衍生物种较少，未检测到SPMs(附图)。1C).
Etomoxir显着地提高了检测到的几种单羟基脂质和COX-2产品的含量(见图)。1C，d)。这表明它们的形成和去除都是由炎症促进的，类似于在体内(图1)。1A，b)。12-HETE、12-HEPE和15-HEPE随etomoxir的增加而增加，但受到LPS的抑制，可能是炎症相关的12/15-LOX丢失所致。1D和补充图。1D)。重要的是，在体内和体外，CPT 1的抑制作用使COX-2和12/15-LOX产物持续增加。
只有当CPT 1被阻断时，才能检测到几种单羟基和二羟基氧化脂质，表明它们的线粒体代谢超过了它们的生成(图一)。1D和补充图。1D)。因此，CPT 1阻止了它们的分泌。与此形成对照的是，在LPS攻击过程中，eicosapentaenoicacid产物17，18-diHETE由CYP衍生的17，18-EET的可溶性环氧化物水解酶氧化生成，被Eomoxir(补充图)所抑制。1E)。总的来说，这些数据表明腹腔巨噬细胞氧化脂肪酶分泌(12/15-LOX或COX-2)被CPT 1介导的线粒体摄取抵消。然而，CYP衍生的脂类则相反，CPT 1的抑制降低了水平。
骨髓巨噬细胞(Bmdm)从血清中摄取多种氧化脂质。
在炎症过程中，巨噬细胞暴露于来自其他免疫细胞或基质细胞的氧化脂。血清中含有大量来自12-LOX和COX-1的氧化脂质，主要是由白细胞和血小板产生的单羟基异构体和血栓素，但很少含有前列腺素。血清在天然免疫应答过程中形成，因此氧化脂肪酶代谢可能发生在局部或全身部位。为此，我们检测了原代小鼠骨髓来源的细胞分化为巨噬细胞，然后单独使用msf，或单独或与lps/fn-γ或IL-4(此后称为m0，m1和m2)作为巨噬细胞炎症模型的体外作用。33。所有巨噬细胞表型从10%含血清培养基中消耗大量外源单羟基氧化脂质，包括12-HETE/12-HEPE(12-LOX，由血小板生成)、5-HETE/5-HEPE(5-LOX，由中性粒细胞产生)和9-/13-HODES(补充图)。2A)。11-HETE/11-HEPE和15-HETE/15-HEPE分别被M0(MCSF)和M2(IL-4)细胞去除，但M1(LPS/IFN-γ)的表达较高或未见变化，因为它们是由LPS/IFN-γ(附图)诱导的COX-2同时产生的。2A)。此外，由于COX-2的作用，M1(LPS/IFN-γ)细胞分泌大量的PG和血栓素，导致细胞外水平的增加。(补充图。2A)。因此，总体模式是所有巨噬细胞消耗血清氧化脂质，同时M1(LPS/IFN-γ)同时产生COX-2 PG。小剂量依托莫昔(25μM)可显著增加M1(LPS/IFN-γ)细胞释放的PG(附图)。2B)。总之，线粒体摄取PGs抑制了经典炎症性BMDM细胞(LPS/IFN-γ)的分泌，其方式与幼稚的腹腔巨噬细胞和体内的LPS腹膜炎相同，而所有BMDM细胞都消耗了大量的HETE和HEPES。
CPT 1对大鼠巨噬细胞炎症反应的动态调控
接下来，我们使用了原细胞，一种体外巨噬细胞炎症反应的模型，可以接受基因修饰。这些细胞不表达12/15-LOX，因此，为了研究cpt 1对其产物的影响，细胞稳定地过表达。阿洛15(生)阿洛15)生成。基本来说，都不是生的模拟不生阿洛15细胞分泌许多氧化脂质，只有9/-HODE，两个PG，和3个二羟基产物的CYP释放量低(补充图1)。3A)。LPS(24 h，100 ng/ml)刺激多种氧化脂质的强劲分泌，其中包括几种PGs(COX-2)9/13-Hodes，以及11-和15-HETes、Hetres和HEPES(可能来自COX-2)(图2)。2A和附图。3A，b和4A-C)。原始的12/15-LOX产物12-HETE和14-HDOHE仅在RAW中检测到。阿洛15LPS可促进细胞的生成(图1)。2A).
图2：cpt 1的抑制增加了生细胞分泌12/15-LOX衍生的二十烷类化合物。阿洛15而生细胞则迅速消耗外源12-羟乙基酮，分泌两种自身被线粒体β-氧化代谢的四分体代谢物。a阻断CPT 1可使生细胞中12/15-LOX衍生的氧化脂质显著升高。生模拟生阿洛15细胞在收获前与依托莫昔尔(25μM)和(或)脂多糖(100 ng/ml)共同培养24h，用LC/MS/MS条形图显示12/15 LOX中的催产素对氧化脂肪酶的影响。n6，细胞分离孔，平均±SEM)。bCPT 1抑制了12(S)或12(R)HETE及其四碳三烯和二烯代谢物的代谢。原细胞添加1.5μg 12(S)或12(R)-HETE/10。6细胞含或不含依托莫昔尔(25μM)3 h，用LC/MS/MS分析上清液中12-羟乙基酮及其三烯和二烯四分体产物的含量。n=3(仅LPS)或4(所有其他样本)，平均±SEM，分离细胞孔。对于所有面板，比较是与或不使用依托莫昔，单因素方差分析与图基后特别测试，统计只显示埃托莫司的效果，在显著的情况下。
CPT 1抑制对基础氧化脂肪酶的分泌无明显影响(附图)。3A)。然而，它显著提高了生的脂多糖依赖的单羟基脂肪酸(HETES，HDOHEs，Hetres和Hodes)的生成。阿洛15细胞(图1.2A)。这些数据表明，分泌的催产素通常只代表12/15-LOX总量的一小部分。因此，LPS增加CPT 1介导的12/15-LOX产物的清除，类似于体内和腹腔巨噬细胞。发现许多初级的12/15-LOX产物(12-HETE，14-HDOHE)，而其他产物(9-HOTrE，9-HODE)可能是次生繁殖的副产品。在etomoxir/LPS处理的生料中阿洛克斯15(而非生细胞)检测到一种溶出蛋白D 5(RvD 5，7S，17S-diHDOHE)的脂质，但在这两个峰中，只有一个符合标准的保留时间(补充图)。4A，b)。脂质含量很低，不可能从细胞上清液中产生可靠的MS/MS谱。由于有两个峰，它们很可能代表7，17-二HDOHE的非对映体，个别的峰也可能含有共洗脱的立体异构体.因此，我们标记了这种7，17-二HDOHE，并认为它是由非酶氧化引起的.在生或生的任何其他样本中均未检出SPM。阿洛15细胞。
几种来源于COX-2的PGs和14，15-diHETE(均为CYP)在生细胞中被etomoxir显著降低(补充图)。4C)。这反映了CPT 1抑制对腹腔巨噬细胞17，18-diHETE的影响.总之，虽然在原始巨噬细胞或所有原代巨噬细胞中，依托莫赛持续升高LOX产物，但仅对原始细胞而言，COX和CYP衍生的脂质都受到抑制。
外源性12-羟乙基乙醚通过线粒体和非线粒体β-氧化在原细胞中代谢为二烯和三烯四氮杂环(Triene Tetranor)代谢产物。
为了确定CPT 1所去除的氧化脂质的去向，我们检测了生巨噬细胞对外源性12-HETE的代谢。12(S)-HETE在LPS刺激后迅速被清除，与两种四分体12-HETES的形成和代谢相一致(补充图1)。4D-f)。经MS/MS确证为三烯，8-羟基-4Z，6e，10 Z-十六碳三烯酸(与标准物质比较)和二烯，即8-羟基-6，10-十六碳二烯酸(与8-羟基-6，10-十六碳二烯酸)。34)(附图。5A-C)。两者都是8(S)，因为它们起源于12(S)-HETE。作为证实，12(S)-HETE-d8被添加到原始细胞(3h)中，并检测到一个氘化二烯(附图)。5D，e)。这些脂类的MS/MS片段显示(补充图)。12–14)。对于四碳二烯，碎裂符合羟基化FAs的预期气相化学，其中裂解发生在羟基旁边(补充方案)。13和14)。为了三世，一个女儿在M/z我们看到了165.1，标准的高分辨率MS/MS确认为C。11H17O(附图)6A及辅助计划12)。三烯的核磁共振如附图所示。7。几乎所有的三烯和二烯都在细胞外被检测到，超过4~8h，都从上清液和细胞颗粒中消失(附图)。4E，f)。这表明巨噬细胞产生和分泌HETES的初级和次级代谢产物，但随后再将其内化以供进一步代谢。然后将三烯四肽12(S)-HETE与原始巨噬细胞共同孵育，3h后细胞外检测二烯。6B)。这表明二烯是通过三烯的饱和而形成的，确定其结构为8(S)-羟基-6e，10Z-十六碳二烯酸。
其次，研究了CPT 1抑制对外源性12(S)-HETE和12(R)HETE代谢的影响。两种HETE均被LPS刺激的原始细胞迅速去除，3h后分别有0.15%或0.4%的细胞残留于S型和R型。2B，左面板)。CPT 1抑制细胞和培养上清12(S)-HETE和12(R)HETE均增加，其中12(R)HETE受影响最大。根据etomoxir的影响，主要的去除似乎是非线粒体的(图)。2B)。12-HETE转化为四碳三烯和二烯，主要在细胞外检测到。2B和补充图。8)。CPT 1阻断剂使这些细胞增加了5~8倍，证实LPS刺激的巨噬细胞中线粒体也在动态代谢(如图1所示)。2B和补充图。8)。在二烯的情况下，对S和R对映体都同样通过etomoxir处理而升高，而对于三烯，12(R)HETE受到的影响最大。
由于大部分的清除似乎是非线粒体的，我们分析了12(S)-HETE通过Land循环合成磷脂池的酯化反应。35。首先，为了确定形成了哪些分子物种，进行了前体扫描LC/MS/MS分析，扫描了其负离子前驱物。M/z319.2.HETES的羧酸阴离子。细胞内加入12(S)-HETE 3 h后收获，进行脂质提取分析。发现了几种前驱离子M/z未添加12-HETE的原始细胞中缺失的738-810细胞(见图)。3A，b)。随后用MS/MS证实了它们的结构，表明其来源于一系列预期的含HETE的PE或PC脂类化合物。然后，用LC/MS/MS对这些脂质进行定量分析，在与12(S)-HETE(1.4μg/10)作用3h的过程中生成大量的12-HETE-PE/PC。6细胞)，占总添加量的88%左右。当细胞同时受到LPS刺激时，合并HETE的比例降低到约73%，三种脂类的水平显著降低，且总体呈下降趋势(图一)。3C)。该方法将12-HETE的酯化反应转化为PLS，是去除原电池的主要途径，比β氧化的作用要大得多，这与Pawlowski等人以前的工作是一致的。35。LPS对此现象的部分抑制可能是炎症过程中磷脂酶活性升高的结果。需要进一步的研究，以确定炎症对所有相互竞争的去势途径的影响，以便更全面地了解在与炎症、伤人、凝血等特定情况有关的特定条件下的主要事件。
图3：原细胞中磷脂酯化12 HETE的鉴定，CPT 1基因敲除可降低原细胞PG水平.a–c细胞(10个)6)与12(S)-HETE±LPS孵育3h后，提取脂质并进行分析。前驱体LC/MS/MS按方法进行，扫描离子碎片生成HETE。a气相色谱显示产生产物离子的前体被洗脱M/z 319.2. b质谱从10-15分钟显示PE和PC物种中含有12-HETE.c12(S)-HETE原细胞与12(S)-HETE孵育后形成的12-HETE PE和PC种的定量n=3，平均±SEM，分离的细胞孔)与/不含LPS的学生的比较t测试，双尾在没有显示酒吧的情况下，没有明显的差异。dCPT1A基因敲除可降低细胞内PG的含量。表达非沉默的原始细胞(RAW)非SIL或CPT1A基因敲除siRNA(RAW)CPT1A川崎)LPS(100 ng/ml)作用24h，LC/MS/MS法测定细胞内PG含量。n=6，平均±SEM，细胞分离井)。学生的t测试，双尾在没有显示酒吧的情况下，没有明显的差异。
CPT1A基因沉默证实原细胞氧化脂肪酶分泌失调
与我们使用的相比，大量的etomoxir(大约高出10倍)可能会对腺嘌呤核苷酸转运酶产生偏离目标的影响。36,37。为了排除这种可能性，我们使用慢病毒方法将CPT1A作为攻击目标。RAW264.7巨噬细胞可沉默至14%左右的对照水平，稳定表达靶向的shRNA。CPT1A(生CPT1A川崎)，但不包括那些表示非沉默控件的控件(原始控件)。非SIL)(附图。9A-c)。CPT 1保持线粒体健康，因为它进口FAs来维持线粒体内的心磷脂和磷脂池。38。因此，CPT 1缺乏的细胞不能正常增殖，并可能改变其生物能量和脂质代谢特征。线粒体和过氧化物酶体β-氧化之间的平衡，以及它们支持产生多不饱和脂肪酸以进行氧化脂肪酶合成所需的拉长酶活性的能力可能已经适应。与低剂量依托莫司类似，对内源性脂多糖刺激的生细胞PG合成的总体影响是对上清液和细胞水平的抑制。三维空间和4)。此外，CYP 450的产物(17，18-diHETE)也受到抑制，与未成熟的腹腔巨噬细胞和原始细胞一样。几种单羟基二十烷类化合物的内源产生被抑制CPT1A(无花果)4)。这些数据进一步证实了CPT 1在产生和去除氧化脂肪酶中的双重作用，这取决于它们的酶源和细胞类型。
图4：CPT 1基因敲除可减少氧化脂肪酶的分泌。表达非沉默的原始细胞(RAW)非SIL或CPT1A基因敲除siRNA(RAW)CPT1A川崎)用LPS(100 ng/ml)作用24h，用LC/MS/MS法测定Pgs、17，18-二羟基脂素(17，18-diHETE)或单羟基氧化脂肪酶(LC/MS/MS)的分泌。n=6，平均±SEM，细胞分离井)。学生的t测试，双尾在没有显示酒吧的情况下，没有明显的差异。
由于生细胞不产生12-HETE，这种代谢物被外源地添加到培养的细胞中，以评估线粒体氧化脂肪酶的去除程度。在基底细胞中，Cpt 1基因敲除并不能阻止12-HETE的代谢，相反，可能是由于酯化或过氧化物酶体代谢引起的。5A)。相反，LPS刺激的生细胞对12-HETE的去除被部分抑制。Cpt 1击倒(图)5A)。此外，三烯和二烯四氮杂环的代谢产物显著减少。Cpt 1在LPS处理，但不是基础生细胞击倒(图)。5B，c)。这表明Cpt 1经敲除后，细胞线粒体代谢减少，LPS刺激后其四分体产物形成较低。
图5：CPT1A基因敲除可通过生细胞调节12-羟乙基酮及其代谢产物的代谢，etomoxir可降低四碳三烯在体内的代谢，阻止脂多糖刺激RANTES/α的产生，调节白细胞的反应，人新生儿脓毒症的转录调控提出了支持线粒体β氧化途径的多个基因。
a–cCPT1A的敲除改变了12-HETE的代谢.1小时后加入12-HETE(2.34g/ml)，培养4 h±LPS(100 ng/ml)。取上清液，用LC/MS/MS对12-HETE和代谢物进行脂类提取和分析。n4(基底非SIL)，5(Cpt1aKD)或6(其他组)，分离细胞孔，平均±SEM。d4-三烯12-HETE在炎症过程中增加，CPT 1受抑制.注射野生型小鼠(雌性，7-9周)。与载体(PBS)，依托莫昔(100μg)和/或脂多糖(1μg)。6小时后，用LC/MS/MS方法提取和分析脂质。n=10，个别老鼠)。异常值显示为红色或值。e, f依托莫昔可抑制腹腔巨噬细胞产生RANTES和TNF。以LPS(100 ng/ml)/etomoxir(25μM)体外培养巨噬细胞培养上清液，用ELISAs法检测RANTES/CCL 5或TNF。n每组3例，细胞分离孔，平均±SEM)。a–f *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005 with/without etomoxir, one-way ANOVA with Tukey post hoc test was used. g, h体内检测到的氧化脂质水平促进中性粒细胞活性氧的产生。全血与氧化脂肪酶混合物孵育(补充表)1)，然后用光化技术响应刺激产生活性氧(ROS)。表皮葡萄球菌方法用APF荧光法测定。对三个单独的供体样本分别进行了测试。方法采用门控策略分析单核细胞和中性粒细胞。对高剂量或低剂量氧化脂肪酶的反应要么表现为%APF+细胞，要么表达于载体(乙醇)反应的%。每个捐助者分别显示。数据采用重复测量的双向方差分析(g-配对p < 0.0001, cell type p=0.018，脂质p=0.0002，以及相互作用p=0.0005；h-配对p=0.0008，单元格类型p=0.0094，脂质p=0.0082，以及相互作用p=0.0024)，SIDAK的特别测试表明-g中性粒细胞乙醇与低脂p=0.0001，中性粒细胞乙醇与高脂p < 0.0001, neutrophils low lipid vs high lipid p=0.0350，单核细胞乙醇与低脂p=0.7020，单核细胞乙醇与高脂p=0.8075，单核细胞低脂与高脂p=0.8075-h中性粒细胞低脂与高脂p=0.0023，单核细胞低脂与高脂p=0.2363)。i体内检测到的氧化脂素水平对CD4+和CD8+T细胞的活化有调节作用。全血与氧化脂肪酶混合物孵育(补充表)1)，用CD3/CD 28微球检测肿瘤坏死因子(TNF)的生成。方法采用门控策略分析CD8+和CD4+T细胞。表中显示了来自个别捐助者的数据。采用双向方差(重复测量)，配对。p=0.0039，相互作用p=0.1690，单元格类型p=0.0007，脂质作用p=0.0253，SIDAK的特别试验表明-CD4：无脂质与低脂p=0.0461，CD4：无脂质与高脂p=0.7115，CD4：低脂与高脂p=0.9989，CD8：无脂与低脂p=0.3742，CD8：无脂与高脂p=0.0449，CD8：低脂与高脂p=0.9952)。j人类转录数据显示，包括ACSL和CPT亚型在内的多个基因显著上调。年发表的35例对照组和26例细菌脓毒症患者的基因表达(log 2表达数据)57在已知长链天然脂肪酸代谢途径的基础上，比较了参与线粒体导入和氧化氧化的32个基因的表达情况。*p < 0.05, ***p < 0.005, Student’s t-试验，双尾，然后用本雅明-霍奇伯格试验进行调整.
炎症通过线粒体β-氧化促进12-羟乙基三烯四肽的转化
在体内，CPT 1的抑制显着地提高了LPS攻击后腹腔内许多氧化脂质的含量。为了检测氧化脂肪酶经线粒体在体内的β氧化作用，接下来测定了四肽代谢物的形成。二烯代谢物不存在，但在炎症刺激过程中，CPT 1阻断时，4-羟乙基三烯明显升高(图1)。5D)。这证实了体内炎症不仅增加了氧化脂质的形成和线粒体摄取(如图所示)。1)，同时也是它们向四分体的新陈代谢。
线粒体氧化脂肪酶代谢不维持氧化磷酸化(OxPhos)
FA的线粒体β氧化与OxPhos直接相关。它形成乙酰辅酶A，TCA循环的底物，NADH和FADH。2，配合物I和Ⅱ的底物，并将电子转移到味蛋白-泛醌氧化还原酶(etf-qo)。39。因此，氧化脂肪酶可能与OxPhos有关。然而，LPS通过多种机制抑制线粒体呼吸，包括乌头糖酶抑制和一氧化氮与复合物IV的结合，因此这不太可能发生。28。在此，LPS治疗明显减少了细胞呼吸，这与以前的数据一致(补充图)。9d)40,41。重要的是，LPS不影响线粒体DNA(MtDNA)，或造成细胞器损伤的DNA损伤频率(补充图)。9E，f)。因此，线粒体仍然存在于LPS处理的细胞中，尽管脂肪酸的β氧化与OxPhos很大程度上是不耦合的。
阻断CPT 1抑制腹腔巨噬细胞产生细胞因子/趋化因子
Cpt 1抑制使炎症激活的腹腔巨噬细胞产生的PG水平增加一倍，特别是大量的前列环素(PGI)。2)代谢物6-酮-PGF1α和PGE2(无花果)1C)。因此，我们接下来要研究的是这种是否影响PG介导的自分泌信号.一些研究报告说，氧化脂质，如单羟基脂肪酸，PGE2或伊洛普斯特(PGI)2(类似物)可抑制单核细胞或巨噬细胞产生细胞因子和趋化因子，包括通过epp受体信号或pPAR-γ激活。42,43,44,45,46因此，我们检测了依托莫昔对LPS刺激的腹腔巨噬细胞产生TNF或RANTES的影响。对这两种蛋白质而言，当依托昔他出现时，其生成量显著减少(图1)。5E，f)。这支持了这样的观点：去氧脂质可以抑制巨噬细胞中的信号。
体内检测到的氧化脂素水平以浓度依赖性的方式调节白细胞反应。
Oxylipins主要是分泌，以旁分泌的方式作用于其他类型的细胞。其次，为了研究巨噬细胞线粒体β氧化是否影响其他细胞类型之间更广泛的氧化脂质信号，我们测定了人类吞噬细胞和T细胞对这些脂质的反应。中性粒细胞之所以被选中，是因为它们对PGE敏感。2，通过EP受体信号传递47,48，而T细胞则可以通过pPARγ来调节，pPARγ是一种转录因子，由许多lox衍生的氧化脂质调节。49,50,51,52,53,54,55。在这里，活性氧(ROS)的产生是由表皮葡萄球菌用全血白细胞的氨基苯荧光素(APF)荧光法检测腹膜炎的常见病原体。56。使用两种浓度，分别代表体内检测到的52种单独的氧化脂肪酶，是否有依托莫昔尔(附LPS)(补充表)。1)。在此，中性粒细胞产生的ROS一直被较高或较低的氧化脂肪酶水平所增强。然而，在三个捐献者身上有明显的浓度依赖性影响(如图所示)。5G，h)。因此，较高的数量，与CPT 1抑制期间检测到的水平一致，对中性粒细胞的激活作用更强。单核细胞ROS的生成在两种剂量下均未受到影响(如图所示)。5G，h)。其次，测定TCR特异性刺激CD4+和CD8+T细胞后外周血单个核细胞(PBMC)的T细胞反应。在此，我们发现，在一般情况下，氧化脂质对TNF的产生有统计学上的显著抑制作用，在这两个亚群。后测分析显示，低水平的氧化脂质单独显著抑制肿瘤坏死因子在CD4+细胞中的作用。在CD8+细胞的情况下，只有高水平显示了显着性，而在这两种剂量有一个趋势(图一)。5I)。综上所述，这些试验数据表明，在体内检测到的生理量范围内，调节氧化脂质水平可以调节体外中性粒细胞和T细胞的免疫反应，从而支持在炎症过程中线粒体清除氧脂素可以调节更广泛的细胞天然免疫反应的概念。
人新生儿细菌性败血症的转录分析确定线粒体氧化脂肪酶代谢的候选基因
将氧化脂肪酶导入线粒体的酶目前还不完全清楚，但很可能是那些进口长链脂肪酸的人参与进来的。其中包括五个酰基-CoA合成酶长链家族成员(ACSL 1、3-6)，以及CPT1A、1b、1c，和CPT 2。基因产物介导−辅酶A和肉碱衍生物的形成，这是线粒体膜摄取长链FA所必需的(补充图)。10和补充表2)。其次是线粒体β-氧化，催化连续去除2-碳碎片生成乙酰辅酶A，并缩短代谢产物链。编码代谢长链PUFA的蛋白质的基因包括HADHA，HADHB，ECI 1，DECR 1，和ACADVL(补充图。15和补充表2)22。共编译了33个基因，其中包括偏好中、短链FA的亚型。用人新生儿全血细胞芯片检测其在人体内感染过程中的表达(35例，26例对照)。在这里，怀疑感染的婴儿进行了血液培养，并确诊为细菌性脓毒症。57。在检测的基因中，22条基因在脓毒症中有显着性差异，9条基因上调，13条基因表达下调。值得注意的是，几个上调基因编码的蛋白质参与生成长链脂肪酸-cas及其相互转化为酰基肉碱在线粒体(图)。5J和6A)。最重要的是，有7人被大幅上调(ACSL 1，3，4, CPT1b, CPT 2, ACADVL, HADHB)而三人则被下调(ACSL 5, ECI 1, 哈达)(无花果。5J和6A)。这表明在重症人类复杂的细菌感染过程中具有高度的调节作用，提示在去除氧化脂肪酶过程中可能存在特定的异构体。我们还询问了从小鼠中提取的基质组织的转录数据(I.P.)从临床分离物分离出来的无细胞上清液表皮葡萄球菌(SE)58。在这里，有全面的上调，显示出类似于人类细菌数据集的趋势(图)。6B，c)。虽然大多数单个基因在统计学上没有显着性，CPT1A约2倍诱导，感染后6h有显着性差异(P<0.05)。
图6：线粒体β氧化途径的转录图谱ACSL 1/Acsll 1作为对人和小鼠巨噬细胞LPS炎症的关键检查点反应。a图中显示了人类新生儿数据集中8个显著上调的基因。n分别为感染35例和对照组26例。学生的t-试验，双尾，然后用本雅明-霍奇伯格试验进行调整.b, c小鼠腹膜炎的转录产物在SES后6h明显上调CPT1A的表达。对SES攻击后获得的腹膜膜的基因表达数据进行了分析，获得了32个基因(n=每组3人)*p < 0.05, Student’s t-试验，双尾，用本雅明-霍奇伯格试验调整。cCPT1A表达的情节。d, e转录谱显示Ascl 1和Eci 1在小鼠骨髓基质中对脂多糖/干扰素-γ有高度的上调作用。从GEO数据库中获得的转录数据按34个可能参与或已知参与线粒体β氧化的基因的表达方法进行了分析。标本经LPS/IFN-γ或IFN-γ单独处理。对于所有基因，用R中的Pheatmap计算并绘制了log2倍变化。d). e归一化表达的盒和晶须图(使用Limma和Oligo生物导体包)ECI 1在鼠标数据集中n=3，适用于所有各组，用Benjamin amini-Hochberg检验进行调整(n=3(GSE 53053 M0除外)n=2)。方框显示中间和四分位数范围(IQR)。晶须的末端在第三四分位数(Q3)以上为1.5×IQR，第一四分位数(Q1)以下为1.5×IQR。如果最小值或最大值超出此范围，则显示为异常值。
在多个人和小鼠巨噬细胞数据集中，Acsl亚型均有一致的上调，而β-氧化抑制了12-hete在原始细胞中的代谢。
接下来，从GEO下载了来自三项小鼠bmdm或三项人类PBMCs研究的数据。59,60,61,62,63,64。ACSL的几种亚型被上调，包括ACSL 1，3，4(人类研究)或阿兹洛1，5(SES腹膜炎和体外BMDM实验)。值得注意的是，ACSL 1所有研究均上调表达(图5)。6d，e和7a，b)。对于BMDM，Acsll用脂多糖/干扰素-γ或干扰素-γ单独刺激时，均能持续显著诱导(图1)。6d和7A)。两个鼠标bmdm数据集也表明ECI 1，编码3，2-依诺酰-CoA异构酶。15还有无花果。6d，e)。在人类研究中，ACSL 1用脂多糖/干扰素-γ或干扰素-γ诱导。7b)。为证实ACSL上调的功能相关性，检测了药物抑制剂Triascin C对12-HETE代谢的影响.12-HETE的去除受到强烈的抑制，而四分体的形成则在60%到95%之间受到抑制。7C)。这与12-HETEβ-氧化(线粒体或过氧化物酶体)对辅酶A-酯的要求是一致的，并证实了ACSLs的参与.我们注意到，12-HETE吸收到磷脂池通过土地的循环酯化也需要ACSL活性.最后，我们观察到LPS对生细胞中12-HETE去除的抑制作用不明显(图1).7C)。这与这一过程是一致的，主要是通过兰德的循环酯化，这反过来又轻微地被脂多糖抑制(图一)。3A-c).
图7：升高Acsl1/ACSL 1在小鼠和人的GEO数据集中，triascin C显着地抑制细胞对12-HETE的清除，并阻止四烯二烯或三烯HETE代谢产物的产生，而etomoxir改变了原细胞中AA的水平。a归一化表达式图(使用Limma和Oligo生物导体包)Acsll在鼠标数据集中，n=3(GSE 53053 M0除外)n=2)经本雅明-霍奇贝格检验调整。bACSL 1在人M_1巨噬细胞中具有强诱导作用。人类转录数据ACSL 1从GEO下载表达，并绘制规范化表达水平图。GSE 46903(n分别为M0，M1=3，10)，GSE 35499(n7)，GSE 5099(n=3)。使用Limma和Oligo生物导体软件包对数据进行归一化处理，然后用Benjamin amini-Hochberg检验进行调整。方框显示中间和四分位数范围(IQR)。晶须的末端在第三四分位数(Q3)以上为1.5×IQR，第一四分位数(Q1)以下为1.5×IQR。如果最小值或最大值超出此范围，则显示为异常值。cTriascin C改变了12-HETE的代谢.原细胞在含12(S)-HETE(1.4μg/10)的血清/无酚无红培养基中培养3h。6取含或不含7μM Triascin C细胞和上清液的含或不含100 ng/ml脂多糖的细胞，用LC/MS/MS法测定12-羟乙基转移酶及其四分体代谢产物。n=3，平均±SEM，细胞分离井)。用方差分析(ANOVA)和TUKEY后专案检验进行统计学检验。脂多糖对除二烯外的任何条件和脂类均无明显影响(无论是否有三叶草素C)。dEtomoxir对生细胞中AA水平有调节作用。原细胞在含12(S)-HETE(1.4μg/10)的血清/无酚无红培养基中培养3h。6加/不加25μM etomoxir。取细胞和上清液，用LC/MS/MS法测定16：0、18：0和20：4。n=3，平均±SEM，细胞分离井)。用方差分析(ANOVA)和TUKEY后专案检验进行统计学检验。16：0和18：0之间无显着性差异。
花生四烯酸(20：4)水平在炎症反应中增加，并且受到CPT 1活性的抑制。
CPT 1/的药理或遗传抑制作用CPT1A抑制了生细胞中PG的生成。三维空间和4A和补充图。4C)。作为一个潜在的解释，我们考虑了LPS驱动的炎症是否会导致PUFA生物合成的升高，CPT 1的抑制会影响PUFA的生物合成。具体来说，β-氧化生成乙酰辅酶A，该乙酰辅酶A转化为丙二酰-coA，用于链化和去饱和脂肪酸，通过ELOVL和时尚。为了检验这一点，测试了LPS/etomoxir对饱和FA(例如16：0，18：0)和PUFA(例如20：4)的影响。饱和脂肪酸无明显影响，但内毒素治疗后依托莫西尔有降低的趋势(图一)。7D)。相反，LPS刺激了20：4水平的显著增加。依托莫司对此有相反的作用，抑制静息细胞中的AA，同时在LPS刺激时提高AA的水平(图一)。7D)。在这里，LPS最有可能通过促进磷脂酶A而增加20：4。2(解放军)2)-依赖于PL膜的释放。约20：4然后通过CPT 1动态去除，因此是敏感的依托莫昔尔。相反，依托莫赛在静息细胞中的负面影响可能与减少延伸率所需的丙二酰辅酶A有关。重要的是，依托莫司对20：4的影响仅在LPS刺激时才出现，与炎症过程中ACSLs的上调和氧化脂肪酶的加速消耗相一致。最后，炎症激活对时尚或ELOVL使用上面测试的相同的GEO数据集检查了表达式。然而，没有看到任何异构体的一致趋势(数据未显示)。这表明，在基因表达水平上，炎症对伸长通路没有促进作用。总之，炎症激活后20：4的升高最可能源于磷脂酶的活性，而CPT 1则在随后的清除中起作用。然而，我们无法阐明抑制CPT 1抑制PG生物合成的原因，还需要进一步的研究。
