两个独立的IPR调控器屏幕可以识别预测的转录因子zip-1。
为了确定哪种转录因子激活了IPR基因的表达，我们筛选了一个由363个RNAi克隆组成的RNAi文库，这些克隆针对357个预测的转录因子(不到预测转录因子库的一半)。线虫)鉴定抑制pals-5：：gfp翻译报告本构表达的RNAi克隆((Jyext 191)在.伙伴-22(Jy 3)背景。同时，我们还筛选了这个rna克隆库，这些克隆阻止了伙伴-5P：：GFP转录报告员(JYIS 8)长期的热应激。在这两个屏幕上，我们发现Zip-1(RNAi)导致GFP信号大量减少(图1)。1A，b，补充数据1)，提示这种含有bZIP的转录因子在IPR调控中起着一定的作用。我们证实了这一点Zip-1(RNAi)另一种表型朋友-22失去功能等位基因，JY 1，这里也显示了RNAi与拉链抑制pals-5：：gfp在朋友-22突变体(图1.1C)。为了证明这个表型不仅仅限于Zip-1(RNAi)，我们创建了一个完整的删除等位基因拉链叫JY 13(补充图。1)，并观察到伙伴-5P：：GFP记者在此假定的长期热应激后拉链零突变体(图1.1D)。这些结果表明，拉链对于调节两种不同的表达伙伴-5GFP记者由两种不同的知识产权触发。
图1：拉链的上岗所需经费伙伴-5GFP记者朋友-22(RNAi)长期的热应激。a，bRNAi屏幕的图形概述导致PALS-22(Jy3)；jyEx191[PALS-5：：GFP]背景(a)和随后的慢性热应激(b)。绿色荧光强度被归一化为蠕虫长度(TOF)，并在x-轴；不同的RNAi克隆在y-轴心。右边的框表示图中包含以下内容的放大部分Zip-1(RNAi)结果和相关对照。源数据作为补充数据提供1档案。c 伙伴-22(Jy1)；jyEx191[伙伴-5：：gfp]动物在控制载体RNAi板(上图)上生长时，显示pals-5：：gfp报告的本构表达。拉链RNAi板(下图像)。进行了两个独立的实验复制，结果相似。d的绿色荧光蛋白的表达Jyis 8[pals-5p：：gfp，myo-2p：：mCherry]记者人数减少邮编-1(Jy 13)长期热应激后的动物(下像)，与野生型动物(上像)相比。进行了三个独立的实验复制，结果相似。c, d荧光图像与DIC图像融合。标尺=200公厘。Myo-2P：：mCherry在咽部表达，是标记JYIS 8转基因。
我们还专门研究了是否需要针对其他两个与细胞内感染有关的转录因子的RNAi诱导。伙伴-5P：：GFP表达。首先，我们分析了bzip转录因子的作用。拉链-10，作为知识产权的一部分并促进帕拉西产孢13,19。在这里我们没有发现拉链-10(RNAi)在……上面伙伴-5慢性热应激后GFP诱导。我们还分析了类STAT转录因子的作用。斯塔-2，这对于响应锥孢，一种真菌病原体，渗透并生长于表皮细胞内。20,21。在这里，我们也没有发现STA-2(RNAi)论对.的归纳伙伴-5P：：GFP表达(附图)2).
拉链的上岗所需经费伙伴-5P：：所有已知知识产权触发器的GFP表达
我们还调查了拉链需要诱导伙伴-5P：：GFP在其他知识产权触发器上的表达。首先，我们测试了拉链才能对Orsay病毒的感染做出反应。在这里，我们发现野生型动物感染Orsay病毒时诱导了伙伴-5P：：GFP记者，感染邮编-1(Jy 13)突变体没有引起GFP的诱导。2A)。同样，小孢子虫的感染帕拉西引起野生型动物肠道中绿色荧光蛋白的表达，但很少至无绿色荧光蛋白的表达。邮编-1(Jy 13)突变体(图1.2B)。因此，拉链的上岗所需经费伙伴-5P：：GFP在这两种天然细胞内病原体感染后的表达线虫肠子。我们下一次测试拉链的本构表达式伙伴-5P：：绿色伙伴关系PNP-1突变体15。在这里，我们也看到了拉链，如Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)双突变体的数量要少得多伙伴-5P：：GFP信号与PNP-1单突变体(图1.2C，d)。最后，我们调查了拉链的上岗所需经费伙伴-5P：：GFP使用药物硼替佐米b10,11,18,22。在这里我们也看到了拉链所需经费用于对.的上岗伙伴-5P：：GFP跨越硼替佐米治疗的时间过程(见图)。2E，f)。因此，在我们测试的六个知识产权触发器中，拉链所需经费用于对.的上岗朋友-5便士*所有国家的绿色伙伴关系。
图2：拉链的上岗所需经费伙伴-5P：：GFP在细胞内感染中的表达，PNP-1监管下调和蛋白酶体封锁。a，bOrsay病毒细胞内感染(a)帕拉西 (b)导致伙伴-5P：：gfp在野生型动物中的表达，但在野生型动物中不表达。邮编-1(Jy 13)变种人。c PNP-1(Jy 90)突变体的本构表达式伙伴-5P：：GFP记者，这是在Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)双突变体。d胡须盒图伙伴-5P：：GFP的表达与动物的长度(TOF)有关。GFP信号增强PNP-1(Jy 90)突变体显著减少Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)双突变体。对每株动物进行了3个实验复制，每个复制动物400只。e硼替佐米治疗诱导伙伴-5P：：gfp在野生型背景下，但不是在邮编-1(Jy 13)变种人。a–c, e进行了三个独立的实验复制，结果相似。荧光图像与DIC图像融合。标尺=200公厘。Myo-2P：：mCherry在咽部表达，是标记JYIS 8转基因。f时间过程分析伙伴-5P：：GFP在对照组和邮编-1(Jy 13)硼替佐米治疗后的菌株。归一化成蠕虫区的gfp信号显示为硼替佐米和DMSO处理样品之间的荧光强度比(y-轴)。以DMSO对照组为对照，分析3个实验复制体，每复制30只动物。等位基因名称和分析时间点显示在x-轴心。g表示伙伴-5P：：NanoLuc的记者在邮编-1(Jy 13)动物比野生型对照菌株，经硼替佐米治疗后.对三个由3个生物重复组成的实验重复进行了分析和处理。将结果归一化为背景发光和3个生物复制的平均值。归一化相对发光单元(RLU)显示在y-轴心。图底部显示有代表性的分析井的生物发光信号图像。D、f、g在盒和须图中，方框中的线代表中值，框界表示第25和75百分位数，而晶须从框界延伸到最小值和最大值。Kruskal-Wallis试验(D，f)或普通的单因素方差分析(g)用于计算p-价值观；*p < 0.0001; ***p < 0.001; ns indicates nonsignificant difference (p>0.05)。p-d对于WT和邮编-1(Jy 13)p=0.3552，其他比较p < 0.0001. p-f对于WT和邮编-1(Jy 13)0.5小时p>0.9999；WT与邮编-1(Jy 13)4、21和25小时p < 0.0001; 邮编-1(Jy 13)0.5小时vs邮编-1(Jy 13)4小时p>0.9999；邮编-1(Jy 13)0.5小时vs邮编-1(Jy 13)21小时p=0.1093；邮编-1(Jy 13)0.5小时vs邮编-1(Jy 13)25小时p=0.0004。p-g对于WT DMSO和WT BTZp < 0.0001; WT DMSO vs 邮编-1(Jy 13)DMSOp>0.9999；WT DMSO诉邮编-1(Jy 13)BTZp=0.5576；WT BTZ诉邮编-1(Jy 13)BTZp < 0.0001; 邮编-1(Jy 13)DMSO诉DMSO邮编-1(Jy 13)BTZp=0.5601。源数据作为源数据文件提供。
因为JYIS 8[伙伴-5P：：GFP]和JyEx191[伙伴-5：全球伙伴关系司]以上记者描述的是多拷贝转基因阵列，可能会导致沉默，我们考虑了这样的可能性：拉链在先前的实验中，GFP的表达被抑制，因为它对转基因沉默有影响。因此，我们接下来要调查的是拉链单拷贝转录报告的抑制表达，作为单拷贝转基因比多拷贝阵列更不容易沉默。在这里，我们使用了一个单一拷贝的菌株。JySi 44[PALS-5P：：NanoLuc]转基因插入，其中伙伴-5启动子驱动生物发光蛋白纳米发酵酶的表达22。在这里我们还发现拉链所需经费用于对.的上岗伙伴-5P：：蛋白酶体阻断剂对纳米Luc生物发光的影响(图1.2G)，进一步表明拉链调控基因的表达。伙伴-5启动子。
因为拉链基因组位点含有非编码RNAY75b8a.55在它的一个内含子中，这个非编码的RNA也被删除在邮编-1(Jy 13)缺失株，我们还创建了一个部分缺失等位基因拉链叫JY 14(补充图。1)。这Y75b8a.55非编码RNA位点保存在JY 14等位基因，而编码预测的bZIP域的区域则为拉链被删除。在这里，通过细胞内感染和蛋白酶体阻断治疗，我们还发现伙伴-5P：：gfp报告表达在邮编-1(Jy 14)变种人比野生型动物，而且与表型没有区别。邮编-1(Jy 13)突变体(附图)3)。总之，我们发现在失去后观察到的表型拉链不具有等位基因特异性，而且它们很可能不能归因于Y75b8a.55基因。总之，这些结果表明拉链控制表达式伙伴-5记者诱导的所有特征良好的触发知识产权基因表达。
拉链的早期诱导所需的伙伴-5MRNA和其他知识产权基因的诱导
接下来，我们使用qrt-pcr评估拉链控制内源性水平伙伴-5MRNA，以及其他知识产权基因的mRNA。由于硼替佐米治疗诱导了最强和最一致的ip基因表达，我们利用这个触发器来评估拉链在随后的实验中介导IPR基因的诱导。在这里我们很惊讶邮编-1(Jy 13)突变体仅减少3.5倍伙伴-5硼替佐米治疗后4h的mRNA诱导与野生型动物的诱导比较(见图)。3A)。四个小时是拉链突变体在诱导上有很强的缺陷伙伴-5P：全球伙伴关系司和伙伴-5P：：NanoLuc表达(图1.2e-g)。因此，我们认为，在4h观察到的GFP和纳米发酵酶的表达可能反映了早期由mRNA合成的蛋白质。为了研究这种可能性，我们用qrt-pcr进行了测量。伙伴-5在硼替佐米治疗后30分钟，我们发现拉链的300倍诱导是完全必需的。伙伴-5MRNA在这个早期的时间点(如图所示)。3B)。因此，拉链完全需要伙伴-5博尔替佐米治疗后30 min可诱导mRNA，但在博尔替佐米处理后4h仅需部分诱导。
图3：拉链调节早期阶段伙伴-5硼替佐米治疗后转录，并控制部分IPR基因的表达。
a，b部分IPR基因的qRT-PCR检测奇-27在4小时(a)和30分钟的时点(b)硼替佐米(BTZ)或二甲基亚砜(DMSO)处理。结果表明，与野生型DMSO稀释液对照相比，DMSO的基因表达发生了翻倍的变化。分析了三个独立的实验复制，每个复制的数值用圆圈表示。杆高表示平均值，误差条在上面延伸。误差条表示标准偏差。单尾t-测试用于计算p-值；黑色星号代表标记样本与野生型dmso对照之间的显着差异；红色星号表示标记样本与野生型dmso控件之间的显着差异。邮编-1(Jy 13)和野生型(WT)N2硼砂处理样品；*p < 0.0001; ***p < 0.001; **p < 0.01; *0.01 < p < 0.05; p-高于0.05的数值不加标记。p-a对于WT BTZ和WT DMSO：伙伴-5 p=0.0026，F26F2.1 p=0.0017，F26F2.3 p=0.0343，F26F2.4 p=0.0211，斯克尔-3 p=0.0003，斯克尔-4 p=0.0012，斯克尔-5 p=0.0132，铜-6 p=0.0117，Chil-27 p=0.0070；邮编-1(Jy 13)BTZ诉WT DMSO：伙伴-5 p=0.0002，F26F2.1 p < 0.0001, F26F2.3 p=0.0224，F26F2.4 p=0.0009，斯克尔-3 p=0.0030，斯克尔-4 p=0.0009，铜-6 p=0.0159，Chil-27 p=0.0005；邮编-1(Jy 13)BTZ诉WT BTZ：伙伴-5 p=0.0086，斯克尔-4 p=0.0287，斯克尔-5 p=0.0126。p-b对于WT BTZ和WT DMSO：斯克尔-3 p=0.0258，斯克尔-4 p=0.0477，铜-6 p=0.0248；邮编-1(Jy 13)DMSO与WT DMSO：F26F2.1 p=0.0192；邮编-1(Jy 13)BTZ诉WT DMSO：Chil-27 p=0.0262。所有重要和非显着性p-值作为源数据文件提供。cSMIFISH数量化伙伴-5前四个肠细胞mRNA转录本。进行了三个实验复制。每个样本至少分析了33只动物(WT DMSO)。n=35，WT BTZn=47，邮编-1(Jy 13)DMSOn=35，邮编-1(Jy 13)BTZn在硼替佐米或DMSO对照处理后4h，每个复制样品至少分析5只动物。在盒和须图中，方框中的线代表中值，框界表示第25和75百分位数，而晶须从框界延伸到最小值和最大值。采用kruskal-Wallis试验进行计算。p-价值观；*p < 0.0001; ***p < 0.001; **p < 0.01; ns indicates nonsignificant difference (p>0.05)。p-WT DMSO对WT BTZ的值，WT BTZ对WT BTZ的值邮编-1(Jy 13)DMSO和邮编-1(Jy 13)DMSO诉DMSO邮编-1(Jy 13)BTZp < 0.0001; WT DMSO vs 邮编-1(Jy 13)DMSOp>0.9999；WT DMSO诉邮编-1(Jy 13)BTZp=0.0001；WT BTZ诉邮编-1(Jy 13)BTZp=0.0037。d野生型pals-5蛋白表达的westernblot分析邮编-1(Jy 13)和伙伴-5(Jy 133)动物。伙伴-5(Jy 133)是完全删除伙伴-5基因为阴性对照。用硼替佐米或DMSO对照处理动物4h，用抗pals-5抗体检测pals-5，以抗微管蛋白抗体作为负载对照。对于pals-5，预测大小为35.4 kD，对于微管蛋白家族的不同成员，预测大小约为50 kD。三个独立的实验副本中有一个显示出来；从所有三个副本中得到了类似的结果(另外两个副本在附图中显示)。5A). a–d源数据作为源数据文件提供。
因为拉链在4小时诱导gfp和纳米糖苷酶转录报告的作用比诱导作用更为重要。伙伴-5通过qrt-pcr技术，我们将smfish作为一种单独的检测手段。伙伴-5MRNA水平在这个时间点。在这里，就像GFP记者的研究一样，伙伴-5肠内有表达。因为这是一个很容易辨认的地点，所以我们量化了伙伴-5第一肠环RNA水平，由四个上皮细胞组成。我们在这里发现伙伴-5Mrna的诱导程度较低。拉链与野生型动物相比，硼替佐米处理过的突变体。3C，补充图。4).
接下来，确定是否拉链突变体在PALS-5蛋白的产生中存在缺陷，我们提高了抗PALS-5蛋白的多克隆抗体.用这些抗体来检测蛋白印迹，我们发现pals-5蛋白在邮编-1(Jy 13)与硼替佐米处理的野生型动物相比，硼替佐米治疗后4h的动物几乎无法检测到。三维空间，补充图。5)。因此，拉链在硼替佐米治疗后，高水平的pals-5蛋白产生是必需的，很可能是通过它在调节伙伴-5MRNA
在确认拉链是完全需要的。伙伴-5在30分钟和4小时部分需要的mRNA，我们检测了对.拉链在这些时间点诱导其他的知识产权基因。我们分析了功能未知的高诱导知识产权基因-F26F2.1, F26F2.3，和F26F2.4，还有素环泛素连接酶复合物的组成-库尔-6, 斯克尔-3, 斯克尔-4和斯克尔-5，它作为知识产权程序的一部分来调节耐热性。18。有趣的是，拉链我们分析的大多数基因在这两个时间点(硼替佐米治疗后30分钟或4h)都不需要进行mRNA诱导，包括F26F2.1(无花果)3A，b)。与这些结果一致，拉链不需要F26F2.1P：：硼替佐米治疗后GFP的表达(附图)。6)。此外，拉链不需要几丁质酶样基因的诱导。奇-27，这是由硼替佐米和自然卵孢子菌引起的。[医]腐霉13,23。相反，拉链需要在4小时内进行诱导。斯克尔-5MRNA水平(图1.3B)。因为归纳斯克尔-5在30分钟相当低的时间里，很难评估拉链在这个时候调节这个基因。总的来说，这些结果表明至少有三类知识产权基因：(1)需要拉链用于早期但不是后期的归纳(“早期”)拉链-依赖基因伙伴-5)，(2)需要拉链在较晚的时间点(“迟到”)拉链-依赖基因斯克尔-5)和(3)不需要的基因拉链在任何一个时间点进行归纳(“拉链-独立的“基因”F26F2.1).
我们还分析了拉链在细胞内感染时诱导IPR基因表达(补充图。7)。类似于使用硼替佐米作为触发器的结果，我们发现拉链所需经费用于对.的上岗伙伴-5MRNA表达帕拉西感染和Orsay病毒感染，但不需要诱导F26F2.1这些病原体感染后mRNA的表达。然而，拉链只需要部分斯克尔-5Orsay病毒感染后的mrna表达诱导，与其完全要求斯克尔-5如上文所述，硼替佐米治疗后mRNA的表达。值得注意的是，斯克尔-5MRNA表达不高帕拉西感染，无论是野生动物还是拉链突变体(附图)7).
Rna序列分析揭示了一幅全基因组的图片。拉链依赖基因
获得基因的全基因组图拉链然后进行RNA序列分析。在这里我们治疗了野生型n2或邮编-1(Jy 13)突变动物用硼替佐米或载体控制30 min或4h，然后收集RNA并进行RNA-seq。在差异表达分析的基础上，我们建立了在硼替佐米治疗后的每一个基因背景中上调的基因列表。在30分钟时，我们发现在野生型和野生型中有136和215个基因被上调。邮编-1(Jy 13)动物，分别有72个基因在两个背景中被上调。4A，补充数据2)。因此，64个基因(即136个负72个基因)仅在野生型动物中被诱导，说明它们的诱导作用是：拉链-早期依赖蛋白酶体封锁。重要的是，伙伴-5是这些基因中唯一在野生型动物中被上调的，而不是。拉链突变体在这个时间点，符合我们的qRT-PCR分析(图)。3B)。在4小时，我们发现了更多的基因，在这两种遗传背景下，硼替佐米与对照之间有差异表达，其中2923和2813个基因在野生型和非野生型中被上调。邮编-1(Jy 13)突变体，分别(图1.4B，补充数据2)。2035个基因在两个背景中都被上调，这意味着888个基因(2923个减2035个基因)在野生型动物中被特异性地上调。888个基因中的883个属于“晚期”拉链-受抚养“类别，并包括斯克尔-5，与我们的qRT-PCR分析相一致。3A)。值得注意的是，有五个基因(ZK355.8, K02E7.10, 数学-39, GST-33，和F55G1.7)只在两个时间点在野生型动物身上诱导，因此我们将这些基因归类为“完全”。拉链-依赖“。因此，59个(64减去5)基因在30分钟的时间点属于“早期”基因。拉链-依赖基因类别。值得注意的是，与我们的qrt-pcr和gfp报告分析一致，F26F2.1在硼替佐米治疗后，基因在两种遗传背景中都被上调，因此属于拉链-独立“类别。
图4：定义拉链-依赖知识产权基因。a，b30 min后差异表达基因的Venn图a)和4h硼替佐米治疗(b)在WT N_2和邮编-1(Jy 13)变异动物与DMSO对照对照为每一背景。64个和888个基因在处理30分钟和4h后分别在N2动物中被上调，但在邮编-1(Jy 13)突变体，表明这些基因是拉链-依赖。源数据作为补充数据提供2档案。c这个拉链-依赖基因集与先前公布的基因列表有显著的重叠，这些基因被不同的IPR触发器所上调。费舍尔的精确检验被用来计算赔率比和p-价值观。计算这些数值时考虑到了线虫基因组。如果比数比大于1，则两个数据集正相关。Jaccard指数测量两个集合之间的相似性，范围为0-1(0-无相似性，1-相同的数据集)。对于近似量化，优势比和Jaccard索引颜色键显示在表的右侧。源数据作为补充数据提供3档案。d所有人富集基因类别的气泡图拉链-硼替佐米治疗30 min和4h时的依赖基因。每个类别代表一个生物过程或与拉链-依赖基因在任何时间点。每个类别中发现的基因数由圆圈大小表示，如下表所示。每个类别的统计意义用圆圈颜色表示；p-数值列于表下。p-由WormCat软件计算的最小超几何分数用Bonferroni校正确定数值。来源数据(包括p-价值)作为补充表提供1. e80个典型IPR基因的分类拉链依赖。每个类别的典型的IPR基因以粗体和下划线显示。源数据作为补充数据提供2档案。
接下来我们研究了拉链-依赖基因(分别分析在每个时间点诱导的基因)和先前与IPR激活相关的基因集。在这里我们发现拉链-硼替佐米治疗30 min后诱导的依赖基因和Orsay病毒感染后早期基因表达上调，帕拉西Orsay病毒RNA 1的感染、异位表达及其诱导的基因朋友-22和PNP-1突变体(图1.4C，补充数据3)。此外，30 min诱导的基因与典型的IPR基因有显著的相似性。同样，在拉链-依赖基因诱导后4h硼替佐米治疗和这些知识产权相关的基因集。值得注意的是，在拉链-经过4 h硼替佐米处理后诱导的依赖基因，以及在病毒(96 HPI)和微孢子虫感染(40 HPI和60 HPI)晚期上调的基因。这些结果表明拉链在细胞内感染的急性转录反应中起着更重要的作用，而在感染后则可能起较小的作用。此外，我们的分析揭示了拉链-上调基因和被下调的基因STA-1。STA-1是一种与统计相关的转录因子，是IPR基因表达的负调控因子.(补充图。8A，补充数据3)。我们还发现拉链-依赖基因和[医]腐霉一种感染表皮的自然卵菌病原体，尽管拉链不需要几丁质酶样基因的诱导。奇-27，这是一个常见的标记[医]腐霉回应(附图)8B，补充数据3)。以前的研究已经表明知识产权和基因之间的联系。[医]腐霉感染，或从[医]腐霉作为卵母细胞识别反应的一部分13,23,24.
我们确定拉链-在我们的分析中，依赖基因使用硼替佐米阻断蛋白酶体，它对与知识产权无关的转录有影响。例如，硼替佐米可激活诱发蛋白酶体亚基表达的反弹反应，并由保守的转录因子SKN-1/nrf 2控制。25。因此，我们比较了拉链-依赖基因(来自两个分析时点)与SKN-1-依赖基因。在这里，我们发现大多数分析数据集(补充图)之间没有显著的相似之处。8C，补充数据3)。这些结果与先前的ipr rna-seq研究结果一致，这些研究显示出了知识产权和反弹反应之间的区别，并表明拉链在回弹响应中不起作用11,13.
此外，我们发现拉链硼替佐米治疗后，野生型动物的mrna本身强烈上调，这与以前的研究一致。13。然而，令人惊讶的是，我们发现拉链MRNA也被上调。拉链变种人。这个结果最初令人困惑，因为拉链中的编码序列被完全删除。邮编-1(Jy 13)我们在RNA-seq分析中使用的等位基因。然而，仔细研究后，我们发现拉链序列读取邮编-1(Jy 13)的上游区域排列的突变样本。拉链基因编码序列，包含几个带注释的5‘非翻译区(UTRs)拉链异构体，以及包含拉链3‘UTR(附图)9)。这一发现表明拉链并不需要诱导它自己的转录，而是一个独特的转录因子参与了拉链mRNA表达
了解其他可能与之相关的生物过程和细胞结构拉链，我们使用WormCat程序进行了分析，该程序专为分析线虫基因组学数据26。我们分别分析了64个来自早期时间点的基因和888个在野生型动物中被上调的基因。拉链变种人。在30分钟时，唯一被过度表达的上调基因类别是应激反应类别(如图所示)。4D，补充表1)。对4h后上调的基因进行分析，发现与mRNA功能、转录、核孔、信号传递、发育、细胞骨架、蛋白水解和DNA有关的基因表达明显过高。
最后，我们对80个典型的知识产权基因进行了分析和分类。13根据它们在rna-seq数据集中的表达水平，根据它们对拉链。在这里我们发现了23个知识产权基因(包括伙伴-5)在野生动物中被上调，但在野生型动物中没有。拉链突变体经硼替佐米处理后30 min，4 h在两种遗传背景下均升高(见图4)。4E)。因此，这些基因是“早期”的。拉链-依赖“知识产权基因”。值得注意的是，11朋友们基因属于这一类。另外7个知识产权基因(包括斯克尔-5)没有被放大邮编-1(Jy 13)这两个时间点的突变体都进行了分析，但在4小时内在野生型中被上调，我们将这些基因归类为“晚期”。拉链-依赖“知识产权基因”。因此，总的来说，30个知识产权基因似乎是拉链-视情况而定，包括两个时点。42个典型的知识产权基因在两种遗传背景中都被上调，我们将它们归类为“拉链-独立的“知识产权基因”。由于其中一些基因在第一时间没有被上调，我们进一步将这类基因分为A类，经过30分钟的硼替佐米治疗后，A类基因显示上调(包括F26F2.1)，B类仅在硼替佐米治疗4h后出现上调。值得注意的是，8个典型的IPR基因在硼替佐米治疗后没有显示明显的上调，因此我们没有将它们分类。这些基因包括组蛋白基因，之前的研究表明这些基因是由组蛋白基因调控的。伙伴-22/伙伴-25和帕拉西感染(因此符合知识产权基因)，但不能通过硼替佐米治疗引起。11,13。总之，rna-seq结果表明拉链控制80个IPR基因中的30个rna的表达，并揭示基于它们的调控，可以将ipr基因分为三个不同的类别。拉链.
Zip-1在肠道中表达，至少在这个组织中需要一部分才能调节。伙伴-5基因表达
为了检查ZIP-1的表达式，我们标记了拉链内源基因组位点绿色荧光蛋白在终止密码子之前，使用CRISPR/Cas9-介导的基因编辑。在此，我们发现ZIP-1：：GFP内源性表达在非应激动物中是不可检测的.因为拉链以硼替佐米为诱导剂，硼替佐米阻断蛋白质降解，观察硼替佐米处理后ZIP-1：：GFP是否可见。在此我们发现ZIP-1：：GFP的表达被诱导，在肠道细胞核中表达最强(如图1所示)。5A)。细胞核在表皮中也有表达(见图)。5B)。特别是，98%(59/60)的动物经硼替佐米治疗4h后肠细胞核中有ZIP-1：：GFP表达，88%(53/60)的动物经硼替佐米处理4h后在表皮细胞核中表达。相反，在用硼替佐米治疗的野生动物中没有发现gfp信号。邮编-1：GFP用DMSO对照处理的突变体或野生型动物(每种情况分析动物60只)。
图5：拉链肠内行为调节伙伴-5MRNA水平a，bZip-1：：gfp在肠道中表达(a)和表皮细胞核(b)硼替佐米治疗后4h。DMSO对照动物和非转基因对照菌株N2均未见表达。合成图像由合并荧光(GFP和自荧光)和DIC通道组成。合成图像中的黄色信号描绘了来自肠道颗粒的自荧光。白色箭头表示表达ZIP-1：：GFP的典型肠道细胞核；黄色箭头表示自身荧光。标尺=20m。c–e 帕拉西 (c)和Orsay病毒感染(D，e)诱导肠细胞核表达ZIP-1：：GFP。荧光和DIC图像合并；绿色代表ZIP-1：：GFP；病原体特异性鱼类探针的荧光以红色显示。白色箭头表示有代表性的肠核表达ZIP-1：：GFP(c–e)；红色箭头表示帕拉西孢子囊(c)。标尺=30m。f肠特异性Zip-1(RNAi)防止伙伴-5MRNA诱导QRT-PCR测定伙伴-5硼替佐米(BTZ)或二甲基亚砜(DMSO)处理30 min时的水平。结果表明，与DMSO稀释剂对照相比，DMSO的基因表达水平发生了翻倍的变化。分析了三个独立的实验复制，每个复制的数值用圆圈表示。杆高表示平均值，误差条在上面延伸。误差条表示标准偏差。单尾t-测试用于计算p-价值观；**p < 0.01; *0.01 < p < 0.05; ns indicates nonsignificant difference (p>0.05)。p-WT控制RNAi BTZ VS值Zip-1(RNAi)BTZp=0.0170；肠道Rde-1对照RNAi BTZ vsZip-1(RNAi)BTZp=0.0092；表皮Rde-1对照RNAi BTZ vsZip-1(RNAi)BTZp=0.0614。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们检测了ZIP-1：：GFP在细胞内感染时的表达情况。首先，我们感染了邮编-1：GFP动物帕拉西，然后用鱼探针标记寄生虫细胞，并定量显示ZIP-1：：GFP核表达的受感染动物的百分比。结果发现，73.33%(44/60)可见寄生虫细胞表达ZIP-1：：GFP，而未感染动物中ZIP-1：：GFP表达率为0%(0/60)。5C)。我们确实注意到未感染的肠道细胞帕拉西-感染细胞有时表现为ZIP-1：：GFP表达，提示从感染细胞到未感染细胞可能存在诱导ZIP-1：：GFP表达的信号。然而，我们不能排除这种可能性，在这些情况下，‘未受感染’细胞实际上有病原体存在，但它是不可见的。
接下来我们研究了ZIP-1：：GFP在感染Orsay病毒的动物中的表达.在此，我们发现100%(60/60)感染的动物有ZIP-1：：GFP的表达，而未感染动物的表达率为0%(0/60)。5D)。类似于感染帕拉西我们发现在Orsay病毒感染上可能存在细胞间信号，因为与病毒感染细胞相邻的未感染细胞有时会显示zip-1：gfp的表达。重要的是，由于病毒被DRH-1受体感知，从而激活IPR，我们发现病毒感染诱导ZIP-1：：GFP的表达使我们能够确定DRH-1是否在ZIP-1上游起作用。在这里，我们发现病毒感染不再诱导zip-1：：gfp在DRH-1突变体(0%或0/60只动物)5E)，提示DRH-1受体在ZIP-1转录因子上游起作用.
以确定其中的组织拉链管制行为伙伴-5诱导，我们进行了组织特异性下调拉链使用RNAi，并测量了伙伴-5博替佐米治疗30 min后的mRNA。首先，我们用Rde-1功能缺失突变株Rde-1拯救结构在肠道或表皮中都有特异性表达，导致这些组织中RNAi的富集。我们在这里观察到拉链肠道特异性RNAi株中的RNAi导致伙伴-5归纳，类似于Zip-1(RNAi)野生动物。5F)。相反，伙伴-5诱导是不受影响的Zip-1(RNAi)在表皮特异性RNAi菌株中。但是，因为肠道的表达Rde-1允许产生次级siRNAs，这些siRNAs可以传播到其他组织并沉默基因在那里的表达，Rde-1菌株可能有点漏水。因此，我们对肠道的需求进行了分析。拉链在一个单独的组织特异性RNAi菌株中，其中希德-1转运通道在肠道中的表达希德-1突变背景27,28。这种菌株不存在渗漏的问题。Rde-1救生菌株28,29。然而，我们确实注意到这种菌株有相反的问题：它们似乎对RNAi有一定的抵抗力。为了量化这种影响，我们治疗了获救的肠子。希德-1抗dsRNA菌株法案-5，这是一种肌动蛋白异构体，在肠道中表达，而在表皮中不表达。因为法案-5对发展至关重要，我们可以利用法案-5(RNAi)测定RNAi在肠获救中的作用希德-1应变30。我们在这里发现法案-5(RNAi)对肠子的大小造成较轻的影响希德-1与野生型动物比较的菌株(附图)。10a，b)。尽管对RNAi有部分抗性，但我们确实发现Zip-1(RNAi)在这个品种中引起了显著的减少伙伴-5硼替佐米治疗与病媒对照相比的mRNA诱导(补充图。10C)。综合来看，我们的数据表明拉链在IPR触发后的肠道细胞核中高表达，并且拉链至少部分需要在肠道内诱导伙伴-5MRNA
拉链调节对细胞内自然病原体的抵抗力
因为IPR基因表达的增加与对细胞内感染的抵抗力增强有关。10,13，我们调查了拉链对细胞内病原体的抵抗力。首先，我们调查了Orsay病毒。在这里，我们感染了L4动物，发现拉链突变体的病毒载量比野生型动物高，如图所示。6A)。同样，我们在L1动物感染病毒后，用鱼染色法测定病毒载量时，发现拉链突变体有比野生型动物更高的感染率的趋势(见图)。6B)。我们还调查了拉链在IPR基因构成表达的突变背景中，可能对病毒载量有更大的影响。事实上，我们发现了一个更明显的角色拉链病毒感染后PNP-1具有IPR基因本构表达的突变体，包括伙伴-5(无花果)6B)15。值得注意的是，我们的qRT-PCR分析PNP-1(Jy 90)动物表明伙伴-5MRNA水平取决于拉链，表明IPR基因被拉链增强对病毒感染的抵抗力(附图)。11)。类似于我们在硼替佐米治疗后观察到的情况，高诱导的知识产权基因的表达。F26F2.1, F26F2.3，和F26F2.4在.PNP-1突变背景不需要拉链。这一发现表明拉链-1-依赖的IPR基因可能在Orsay病毒抗性中起着比其他IPR基因更重要的作用。
图6：拉链促进对细胞内病原体的抗药性。
a正常人和正常人Orsay病毒RNA 1水平的qRT-PCR分析邮编-1(Jy 13)变异动物。动物于L4期感染，24 HPI采集。对7个实验重复进行了分析，每个实验重复由两个生物重复组成。b控制中感染Orsay病毒的动物比例，邮编-1(Jy 13), PNP-1(Jy 90)和Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)背景12 HPI。动物在L1期感染。根据是否存在Orsay病毒RNA 1特异性荧光探针(3个实验复制，每个复制300只动物)对每株900只动物进行评分。对照株的感染率为1。c 帕拉西以3 HPI作为每只动物的孢子囊数量化致病菌载量，对每株300只L1动物进行3个实验复制分析。d量化帕拉西-特定的鱼类荧光信号，归一化为身体面积，不包括咽部。在L1期感染动物，30只HPI对其进行分析，每株动物200只(4只实验复制，50只/次)。由于红色共注射标记的表达，头部区域被排除在分析之外。Myo-2P：樱桃先生。任意单位a–d杆高表示平均值，误差条在上面延伸。误差条表示标准偏差。e野生型的生存，邮编-1(Jy 13), PNP-1(Jy 90)和Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)动物跟随帕拉西感染。动物被暴露在帕拉西从L1期开始孢子培养66 h，然后每天转移到非感染板上，并对其活力进行评分。f用于感染检测的菌株寿命分析。e，f动物在25°C下孵育，3个实验复制的数据显示在一张图中。活动物的百分比y-每天分析的轴(x-轴)。a–f统计分析是用单尾的方法进行的。t-测试(a)，一个普通的单向方差(b)，Kruskal-Wallis(C，d)，以及原木等级(Mantel-Cox)测试(e，f)计算p-价值观；*p < 0.0001; ***p < 0.001; **p < 0.01; *0.01 < p < 0.05; ns indicates nonsignificant difference (p>0.05)。p-价值a对于WT和邮编-1(Jy 13)p=0.0312。p-b对于WT和邮编-1(Jy 13)p=0.5813；WT与PNP-1(Jy 90)p=0.0079；WT与Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p>0.9999；邮编-1(Jy 13)VSPNP-1(Jy 90)p=0.0017；邮编-1(Jy 13)VSZip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p=0.6145；PNP-1(Jy 90)VSZip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p=0.0073。p-c对于WT和邮编-1(Jy 13)p>0.9999；用于所有其他比较p < 0.0001. p-d对于WT和邮编-1(Jy 13)p=0.4025；WT与PNP-1(Jy 90)，WT与Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)和zip-1(Jy 13)VSPNP-1(Jy 90)p < 0.0001; 邮编-1(Jy 13)VSZip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p=0.0312；PNP-1(Jy 90)VSZip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p=0.0010。p-e对于WT和Zip-1(Jy 13)，zip-1(Jy 13)VSZip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)和PNP-1(Jy 90)VSZip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p < 0.0001; WT vs Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p=0.7781。p-f对于WT和邮编-1(Jy 13)p=0.0005；WT与Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)和PNP-1(Jy 90)VSZip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p < 0.0001; 邮编-1(Jy 13)VSZip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)p=0.0009。所有菌株伙伴关系-5p：：全球伙伴关系背景。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们研究了一个角色拉链抵抗力帕拉西通过测量病原体负荷来进行感染。在这里我们没有看到拉链在野生型背景下，无论是3 HPI还是30 HPI(图1)。6C，d)。然而，在这两个时间点，我们发现拉链显著抑制病菌抗性的增加(即较低的病原菌载量)。PNP-1突变体(图1.6C，d)。因此，这些实验表明野生型拉链促进抵抗帕拉西在感染前诱导IPR基因的背景下感染。进一步分析拉链作为对帕拉西我们还进行了杀灭试验，分析了感染后动物的存活情况。与公布的数据一致，我们发现PNP-1突变体比野生型动物感染后存活时间更长。帕拉西，但在没有感染的情况下，不能比野生型动物活得更久(见图)。6E，f)。重要的是，我们发现拉链突变会降低两种基因的存活率PNP-1变种人背景，以及野生型背景。因此，野生型拉链促进生存帕拉西感染。由于感染是通过向动物喂食病原体来进行的，所以在食物摄入和消除方面的差异可能是造成病原体负荷差异的原因。因此，我们测量了荧光珠在所有被测菌株中的累积量，没有发现任何明显的差异。拉链突变体和对照动物(附图)。12)。总之，增加的病原体负荷拉链突变体不太可能是由于这些突变体中肠道细胞暴露于病原体上的差异所致。
其他表型PNP-1突变体对热激的敏感性较高，生长速度稍慢。15。我们测试了这两种表型中是否有一种是拉链-依赖。首先，我们发现邮编-1(Jy 13)动物在热休克后的存活率与对照组相似(附图)。13A)。同样，我们发现拉链在.PNP-1(Jy 90)突变背景并没有显着地抑制观察到的更高的杀伤力。PNP-1(Jy 90)单突变体，表明ZIP-1在耐热性调控中不起关键作用.最后，我们分析了邮编-1(Jy 13)突变体，表现出野生型的生长速度，可以抑制轻微的生长延迟。PNP-1(Jy 90)突变。在此，我们根据对l1动物进行电镀后44h的体长测量来测定其生长，我们发现Zip-1(Jy 13)；pnp-1(Jy 90)动物仍明显小于对照动物，邮编-1(Jy 13)单突变体(附图)13B)。因此，拉链的这些非感染相关表型似乎并不重要。PNP-1变种人。相反，似乎拉链特别是在调节免疫相关的知识产权基因中起着重要作用。
