基于IMC数据的三维模型生成
我们的三维IMC方法依赖于从石蜡包埋组织中连续切割组织圆柱体。我们优化了我们的样品加工方法，并决定使用一个带有金刚石刀的超微电脑，用于FFPE切片，以尽量减少已知在组织切割、薄片处理和进一步实验过程中引起的变形。19。我们选择削减2米厚的段，以便在跨多个切片捕获单个单元和处理超薄切片的难度之间提供一个折衷方案，从而使更广泛的用户可以使用这种方法。组织切片之后是组织水化和热诱导的表位检索(扩展数据图)。1)。在获取了二维(2D)IMC数据后，我们组装了三维组织模型，并使用基于公共工具的计算工作流导出了单细胞标记轮廓(图1)。1A)。0.5毫米数据采集3目前大约需要一周。
图1：三维IMC的实验和计算工作流程。a将FFPE组织的小棒或块切割成2~m段，用超微切仪和改性金刚石刀进行切割。在常规的显微镜切片上收集连续切片。通常，在每个玻璃幻灯片上放置20至40段。复水后，对组织进行抗原提取，然后用金属标记抗体染色.所有切片均行IMC分析。根据注释对数据进行计算处理，以对区段进行排序。利用三维分水岭算法对图像进行对齐，分割单元。最后，一个完整的三维模型可以在体素级和单元级进行分析。b，在两个乳腺癌三维IMC模型中的一个有代表性的例子中，原始数据体素渲染的例子。利用Agave 1.0.0.1对数据进行三维绘制。
三维IMC方法可以在三维组织结构的背景下研究大约40个表位的空间分布。为了举例说明三维IMC工作流程，我们从不同的乳腺癌样本中重建了三维模型。对于最终尺寸为652×488×304 m的主模型3，我们使用了HER 2+乳腺导管癌标本(图1)1B)。我们从组织样本中连续切下152片，用以乳腺癌为中心的抗体(补充表)对切片进行染色。2以及扩展数据图。2A)用于显示基底和腔内细胞、血管化、免疫细胞浸润、增殖、凋亡、缺氧、细胞信号和胶原沉积。数据采集后，我们将文件转换为TIFF格式，并对连续图像进行对齐，以从图像的重叠区域获得最终的模型(扩展数据图)。2B和补充录像1和2)。该样本的原始体素水平数据呈现显示泛细胞角蛋白(Panck)阳性区域与血管和基质团交织在一起(图1)。1B和补充录像3)。在整个体积分析中，间质室的细胞组成似乎不均匀，表达共同的免疫细胞标记物，包括CD 20、CD8a、CD3和CD 68(如图所示)。1B)。因此，利用三维IMC，可以通过评估原始体素水平数据的分布来分析多个标记物在整个组织体积中的空间排列。
从三维IMC图像中提取表型单细胞数据
为了更深入地研究肿瘤生态系统，我们采用三维分水岭分割方法，从图像重叠区域提取单细胞信息。2A，b)。分割为每个单元分配一个唯一的标识符，从而能够计算每个单个细胞的抗体、信号统计和空间数据(例如体积和直接邻居交互)。抗体信号统计，下称标记表达，是根据抗体面板中每个通道的每个单细胞3D掩膜上离子计数的平均强度来计算的。我们在一组数字图像处理步骤后，对染有铱的核通道进行了三维分水岭分割。方法)。分割结果通过用铱信号覆盖单细胞掩膜来视觉评价(见图)。2B，c)。选择图像处理步骤，使最终的掩模受到切片间强度变化的影响最小，并产生相似的平均细胞直径。x–y和x–z方向(扩展数据图)3A，b)。每个单元的最终统计数据被整理在单元数据目录中，以便于导出和下游单细胞分析(扩展数据图)。3C)。铱通道相关的分割使得分割过程能够应用于IMC数据，而不管抗体面板如何。
图2：三维IMC产生的乳腺癌模型的单细胞分割。a、分段和单元目录生成管道。采用体素模型作为三维分水岭分割的输入。检测到的对象被指定为唯一的单元格标识符。计算每个分段单元的所有通道和形态描述符的统计信息(N细胞，M频道)。b在本研究中使用的两种乳腺癌模型中，有一种来自单一代表切片(152号中的第58号)的铱信号，同样的模型也显示在图中。1B(左)铱通道的分割掩膜覆盖(右)。在分割掩码中，不同的单元格被标记为随机颜色。c，在同一模型(共包含152片)的表面呈现铱通道上的完整分割掩码的例子。图像用NAPARI v.0.4.1rc2(参考文献)制作。40).
为了评估单个细胞的衍生标记表达是否捕获了预期的生物学信息并与原始的体素数据相一致，我们使用无监督的现象学聚类方法为每个单细胞指定了一个细胞表型(图)。3A)20。我们的小组中的抗体被选择来识别已知的肿瘤、免疫和基质细胞表型。我们根据Panck阳性的上皮细胞(如1-7和10-13)，胶原和SMA阳性的基质细胞(17和22)，CD 20和CD 45阳性的B细胞(25组)，CD 8a、CD3和CD 45阳性的T细胞(18组)，CD 68和CD 45阳性的巨噬细胞(30组)和血管性假血友病因子(VWF)和CD 31阳性的内皮细胞(21组)的差异表达，确定了预期的细胞表型。此外，分段数据捕获了与B细胞和T细胞相比，肿瘤细胞的预期平均更大的大小(扩展数据图)。三维空间)。分割结果可以通过用细胞表型掩码覆盖原始体素数据来评估，其中每个单元的每个体素都被分配其聚类标记(图1)。1B和3B和补充录像4和5)。强调三维数据的价值，可以很容易地显示不同细胞表型的位置，例如我们观察到CD 45的明显趋势。+CD3+T细胞(第13和18组)聚集在vWF周围+CD 31+内皮细胞(簇21)(图21)。3C和补充录像6)。同样，我们观察到CD 68不同亚群的空间分离。+单元(群集30和28)(扩展数据图)。3E)。在2D中，这些不同的模式将更加难以识别。除了通过聚类根据聚合标记表达分配每个细胞的表型外，还可以使用表达掩码来评估每个单个细胞的平均抗体信号统计量及其空间位置，其中每个细胞的每个体素都被分配导出的标记表达值。我们观察到该模型中的肿瘤细胞表现出不同程度的腔细胞标记物(细胞角蛋白8/18和19)、基底细胞标记物(细胞角蛋白5和SMA)和其他乳腺癌上皮标记物如HER 2和CD 44的表达水平。三维空间和补充录像7和8)。这表明，3Dimc捕获了肿瘤细胞中的标记表达异质性，正如我们先前对乳腺癌队列进行的大规模分析所预期的那样。13,21,22。令人放心的是，用同样的分割方法和同样的抗体面板应用于同一患者的第二例乳腺癌样本，我们的管道产生了相似的细胞表型(扩展数据图)。4A-d和补充表3)。这些分析表明，3D IMC能够在三维组织环境中对预期的细胞表型进行详细分析，并确定在组织体积中位置不同的细胞群体。
图3：乳腺癌标本三维IMC数据的单细胞分析。a，平均标记表达式的热图(x每个表型簇(y(轴)测量了每个分割细胞的原始数据，并从本研究中使用的两个乳腺癌三维IMC模型中的一个(152片)(左图)中的一个进行了细胞聚类。每个细胞的标记表达数据计算为目标掩膜上离子计数的平均强度。彩色条形图表示与特定单元格类型对应的群集，颜色编码为c和d。聚类前，数据归一化为第99百分位数，z评分为热图显示。每个集群的绝对单元格数(右)。b，第21组(内皮细胞)、第18组(CD8a)的细胞三维显示+T细胞(T细胞)、25群(B细胞)和30群(巨噬细胞)。c，第21组(vWF+CD 31+)、第18组(CD8)的细胞三维呈现+，CD3+和CD 45+)和第13组(CD8a)−，CD3+和CD 45+). d单个细胞标记表达CK5，CK 19，CK 8/18，HER 2，CD 44和SMA，每个细胞的每个体素都被赋予其标记表达值。图中的所有渲染都是来自两个乳腺癌三维IMC模型中的一个的有代表性的图像，并且显示在与图中相同的方向上。1B。利用Agave 1.0.0.1对数据进行三维绘制。
三维IMC揭示细胞与微环境的关系
由于组织是三维结构，我们预计三维距离和细胞间距离的测量会比二维IMC更好地捕捉模型组织。我们通过比较从上述HER 2阳性的主要导管癌样本中获得的各种定量指标来评估这一结果。我们首先测量了不同细胞表型之间的距离，在所有二维切片和重建的3D模型中，用初始聚类步骤和最近的血管来确定它们之间的距离(如图所示)。4A)。在3D中，不同细胞表型与最近血管的平均距离总是比2D测量的要短(图1)。4B)。这是意料之中的，因为在单个2D平面上和飞机下面的特征是无法检测到的。为了检验细胞与细胞之间的相互作用在3D和2D中是否存在差异，我们确定了2D中每个部分的所有细胞以及整个3D模型中的所有细胞直接接触的细胞表型。三维相互作用分析得到了与二维分析不同的细胞相互作用图。例如，2D中所有细胞类型之间的同型相互作用比在3D中多，而在2D(图1)中，簇25(B细胞)和簇18(T细胞)之间的异型相互作用较少。4C)。对这些差异的合理解释是2D空间取样不足，以及在受约束的方向(如与血管相连的淋巴细胞)的相互作用的存在。这两项分析表明，三维模型产生的细胞和微环境关系在数量上与二维图像不同，而且在三维组织结构的情况下，这种差异是预期的或可信的。
图4：3D与2D IMC的距离测量比较。a，细胞对血管距离测量的代表性切片33在2D图像(顶部)和三维重建(底部)的乳腺癌三维模型(如图中所示)。1–3)。VWF信号显示(从左到右)来标记血管，为血管生成的二进制掩膜，每个细胞到血管掩膜的距离在一个热颜色标度中，以及与T细胞和肿瘤细胞在同一尺度上的血管掩膜之间的距离。图像是用npari v.0.4.1rc2(参考文献)创建的。40). b，对同一模型中所指示的细胞表型，用2D和3D对细胞质心到内皮细胞掩模中其最近点的距离进行量化。c在同一乳腺癌模型中，用热图显示三维和二维的差异，显示不同类型的簇在直接接触相邻的乳腺癌模型中所占的比例。对于模型中的每个单元，计算出每个簇类型在邻域之间的总次数，然后根据簇分配对每个集群进行聚类。该比例是通过将每个簇数除以每个簇在整个模型中的邻居总数来计算的。对于2D，计算每一层直接接触的邻域，平均跨越整个堆栈(152片)。最后，通过从三维比例中减去2D比例来计算差值。
我们还推断，3D模型将揭示蛋白质表达的空间排列，而这些空间排列可能在2D图像上是不可见的。在我们的主要HER 2中+乳腺导管癌三维模型，我们观察到一个Panck。+基底层细胞角蛋白5(CK5)的管腔区和不连续的斑片状，尽管SMA是另一个基础标记物，但其表达却是一致的(如图所示)。5A，b)。片状基底层仅在三维重建中清晰可见，而不是在2D图像中(如图所示)。5A，b和补充录像9)。我们观察到同样的HER 2重构的第二例乳腺癌标本中CK5的类似不连续型。+导管乳腺病人样本使用三维IMC工作流(图)。5C)。第二种模型由大的上皮性肿瘤区和具有CD8a的间质室组成。+区域(图)5D和补充录像10)。了解基底层的这些不同表型可能有助于阐明导管癌早期浸润的步骤。此外，根据第二次乳腺癌模型的细胞水平标记表达数据，我们在3d中观察到ps6。+上皮性肿瘤细胞排列(图1)。5E)。在2D中，pS6的分布+细胞似乎混乱，与SMA的距离+细胞面积尚不清楚。5F)。然而，在三维重建中，pS6显然+SMA共定位细胞+细胞(图1.5F和补充录像11)。这些例子说明了空间细胞层次的组织在3D中变得明显，突出了我们研究组织结构的方法的价值。
图5：三维重建显示了组织中细胞和环境的关系。a在本研究使用的两种乳腺癌三维IMC模型中，有一种是以二维和三维显示肿瘤基底层的原始数据，显示基底标记CK5和SMA的表达，以及内皮标记vWF和CD 31的表达。2D切片代表152个切片；三维渲染使用所有152个切片。图像与图中的图像具有相同的角度。3B-d. b，该模型的另一个角度显示所指示标记的原始数据呈现。c、第二乳腺癌三维IMC模型的原始数据体素显示SMA、vWF、CD 31、Panck和CD8a标记分布。白色箭头表示显示在d和e. d，原始数据体素渲染相同的乳腺癌三维IMC模型c显示SMA、Panck、vWF、CD 31和CK5标记的分布。e,f中所示的同一乳腺癌模型中指示标记的单细胞表达c。每个单元格的每个体素都为每个标记指定一个表达式值。两个典型的二维切片(在92例中)来自乳腺癌模型。c和d，显示指示标记的单细胞级表达式(f，左)。Panck，SMA，vWF，CD31和pS6在乳腺癌模型中的表达e和f1，并通过不同的z维裁剪来显示。x-模型的平面2,3,4 (f，右)。白色箭头表示模型被切割的方向，白色星星表示切割的位置。利用Agave 1.0.0.1对数据进行三维绘制。
3D模型捕获的空间入侵相关事件
在分析通过3D空间进行的现象时，3D重建可能是特别强大的。重建主要HER 2+导管型乳腺癌三维模型显示的结构可能类似于微侵袭性病变和潜在侵袭性肿瘤细胞(如图所示)。6A)。肿瘤的远端(深度达80米)zAXIS没有被推测的侵袭细胞，肿瘤细胞间隔有光滑的肿瘤间质边界(图)。6A)。在肿瘤中心(沿z轴约120米深度)和近端区域(160米及更深处)，推测是侵袭性Panck。+上皮细胞有可能从微凸出物中出现(如图所示)。6a，b和补充录像12)。在三维模型中，这些潜在的侵袭性细胞可以有信心地从大量肿瘤中分化出来，因为它可以确定一个特定的上皮细胞簇是否与肿瘤网络完全断开。这是不可能在一个或几个2D部分。我们观察到这些细胞在关键上皮细胞标记物的表达水平上与肿瘤体积不同。6C和补充录像13)。在整个模型中，推测侵袭性细胞的CK 8/18、CK 19和HER 2等上皮标记物的表达低于其他上皮细胞，CD 138和pS 6的表达也高于其他上皮细胞(扩展数据图)。5A)。我们还观察到CK5+与其他CK5相比，即刻微环境中的基底细胞和基质细胞(每个假定的侵袭细胞半径为50 m)pS6的表达水平也增加了。+此模型中的基底细胞和基质细胞(图)。6d以及扩展数据图。5B).
图6：三维IMC显示了潜在的入侵相关现象.a、一系列原始体素数据，包括Panck和CD 20的40张Panck和CD 20的原始体素数据，这些数据都是从乳腺癌三维IMC模型中提取的(与图中所示的模型相同)。1)。白色矩形标记120米深的导管原位癌样结构表面的突起，并在同一位置标记肿瘤簇。b，Panck的完全3D原始数据体素绘制a。肿瘤细胞簇显示在白色矩形内。c、CK5、Panck、HER 2和CK 8/18的单细胞标记表达水平。每个细胞的标记表达数据计算为目标掩膜上离子计数的平均强度。d、pS6在侵袭性细胞的直接微环境(ME)中的上皮细胞、基底细胞和基质细胞中的表达水平以及在整个组织中相同类型细胞中表达水平的小提琴图。Me被定义为从任何可能的侵袭细胞到半径在50 mM以内的细胞。e，一个原始数据，三维IMC体素模型，从两个病理学家中的一个确定的样本，淋巴血管侵犯从周围的乳腺肿瘤(左)。同一模型的单细胞标记表达，其中每个细胞的每个体素都被指定为标记物的标记表达值，包括增殖性肿瘤细胞(KI-67)和凋亡细胞(PARP和Caspase 3裂解阳性)(右)。f，原始数据三维IMC体素模型的病理学家-确定的样本淋巴血管从不同的乳腺肿瘤，其中两个这样的样本在本研究中使用(左)。相同模型显示HER 2的单细胞标记表达式+图像中心淋巴管内的肿瘤细胞和单一的E-钙粘素+图像边缘血管内的细胞(右)。利用Agave 1.0.0.1对数据进行三维绘制。
我们重建了另外两个3D模型，以进一步说明3D IMC分析空间受限事件的能力。病理学家确认这些样本是HER 2周围淋巴血管浸润的部位。+乳腺癌，因此，应捕获转移相关的事件。乳腺癌淋巴血管浸润的存在与患者预后恶化有关。23不同的基因都与发生这一事件的可能性更高有关。24,25，但由于它们的三维拓扑结构，它们具有很大的挑战性。多路复用三维IMC使我们能够评估细胞亚群及其在这些淋巴血管簇中的三维空间分布。例如，在其中一个模型中(如图所示)。6E，补充录像14和补充表4)，一个大潘克+肿瘤细胞团簇可见于血管内，vWF、CD 31和波形蛋白阳性。同样，我们捕获了一个HER 2。+和E/P-钙粘蛋白+淋巴管内肿瘤细胞团簇+、CD 31−波形蛋白−)和单一的E-cadherin+周围血管中的细胞(CD 31和波形蛋白阳性)(如图所示)。6f，补充录像15和补充表4)，在第二淋巴血管侵犯模型中。基于聚类分析的表型分析显示HER 2和TMEM 173在大淋巴管浸润细胞中的高表达和低表达(扩展数据图)。5C)。未来的分析可能包括分析淋巴血管团内的细胞表型，与整个肿瘤相比较。有可能侵袭性肿瘤细胞簇的特性及其与转移的关系的可靠分配还需要进一步的研究，但这三个例子突出了多路三维IMC用于研究转移过程中的细胞侵袭等空间事件的适用性。
