单细胞追踪显示肺癌抗PD-1治疗过程中前体细胞的克隆再生和扩增

抗Pd-1治疗在治疗非小细胞肺癌(NSCLC)方面取得了前所未有的成功，但其潜在机制尚不完全清楚。在此，我们对36例非小细胞肺癌患者在PD-1基础上的47例肿瘤活检标本进行了时间单细胞RNA和配对T细胞受体序列测定。我们观察到治疗后反应性肿瘤中前体耗竭的T细胞水平增加，其特点是辅助性抑制分子低表达和高表达GZMK。相反，没有反应的肿瘤未能积累TXP细胞。我们的数据表明，TXP细胞不太可能来自于末期精疲力竭细胞的恢复活力；相反，它们是通过(1)局部扩张和(2)外周T细胞补充新的和已有的克隆型来积累的，这一现象我们称之为克隆复苏。我们的研究提供了对基于PD-1的治疗机制的深入了解，这意味着作为改善非小细胞肺癌治疗的步骤，TXP细胞的克隆性复苏和扩展。

免疫检查点阻断(Icb)可以通过干扰协同抑制的T细胞信号来增强抗肿瘤免疫，并代表着癌症治疗中的一个显著的范式转变。1,2,3。然而，对此类治疗的显著反应仅限于少数非小细胞肺癌患者。4强调需要额外的治疗策略。为了促进下一代免疫疗法的合理设计，首先了解ICB诱导肿瘤排斥反应的分子和免疫机制是至关重要的。以往的研究报道，pd-1通路的阻断可以逆转慢性病毒感染期间耗尽的txp细胞的功能失调状态。5,6，提出了广泛推测的ICB治疗机制。然而，通过集中精力解决这个问题，新出现的证据表明，末端tex细胞的表观遗传稳定性很难改变，并可能限制这种恢复活力。7,8,9。最近的观察也支持了这一观点，表明在癌症治疗中，新浸润的新克隆而不是先前存在的克隆发挥着主导作用。10。此外，多项研究已将临床结果与特克氏细胞(包括干细胞)联系起来。11,12,13以及随后转换为终端Tex子集的临时单元14,15,16,17但是在治疗人类癌症的过程中，终端Tex和TXP细胞对抗Pd-1的反应仍是个未知数。

以往旨在阐明icb治疗机制的肺癌研究主要集中在大体积肿瘤的全外显子序列上。18但是，在了解对检查站封锁的免疫反应的细胞基础方面，这种战略是有限的。单细胞核糖核酸测序(scrna-seq)是一种分析复杂生物系统细胞多样性的有力方法，但目前肺癌的scrna-seq分析主要集中在治疗脑肿瘤方面。19，主要是由于在多个治疗时间点获取高质量的人体肿瘤样本的挑战。最近的一项肺癌研究分析了肿瘤治疗后新抗原特异性T细胞。20而这些细胞在治疗后的时间变化仍不清楚。为了解决这些局限性，我们利用scRNA-seq分析全面描述了抗PD-1联合化疗后分离肿瘤活检T细胞的时间动态，使我们能够更好地解释基于PD-1的治疗的基本机制。

我们使用基于液滴的5‘scRNA-seq和配对T细胞受体(scTCR-seq)序列分析了36例非小细胞肺癌患者的47例肿瘤活检标本，其中33例为非小细胞肺癌患者，9例为治疗后反应(来自8例肿瘤)，5例为治疗后无反应的肿瘤标本。1A，b、扩展数据图。1和补充表1)。经过严格的质量控制过滤(方法共保留135,391个T细胞(扩展数据图)。2A，b)其中56.6%有生产tcr、α-和β-链对(补充表)2)。通过匹配α-和β-链对，这些T细胞进一步分为43,713个不同的克隆型(扩展数据图)。2C)，使我们能够跟踪克隆谱系，并测量治疗后的克隆扩展。

a、总体研究设计方案。将scRNA-seq和scTCR-seq应用于经治疗、单纯和治疗后的肿瘤活检细胞(补充表)。1). b具有代表性的非小细胞肺癌肿瘤(P 019)在治疗前后的CT表现。c，UMAP图，75,735个CD4+来自所有47个肿瘤样本的细胞，显示出9个主要簇的形成。每个点对应于一个单元格，颜色由单元簇编码。d，每个CD4的比例+治疗前(RX)和治疗后(RX后)肿瘤中CD4 T细胞的亚型。数据以平均值±S.E.M表示。P数值是由费舍尔的精确测试确定的，t-检验和Dirichlet-多项式回归模型，双边(方法). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. e，Volcano图显示治疗后反应性肿瘤与非反应性肿瘤之间所有Tregs基因的差异表达。每个红点表示一个经调整的单个基因。P < 0.01, two-sided t-测试。f，平均基因表达在治疗后反应和无反应肿瘤的所有Tregs中。中心线表示中间值，上下铰链分别代表25和75百分位数，晶须代表1.5×四分位数范围。每个点对应于一个样本。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, one-sided t-测试。g，Th1样细胞亚群中扩增的克隆型数目(克隆大小>2)在治疗后反应性肿瘤与非反应性肿瘤之间。数据以平均值±S.E.M表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, one-sided t-测试。h，Th1样细胞子集中扩展的克隆型数目(克隆大小>2)。数据以平均值±S.E.M表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, one-sided Wilcoxon test. Data were summarized from n=6前RX反应，n=6后RX响应，n=5前RX无响应和n=5例RX后无反应肿瘤标本。

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CD4+T细胞(图1.1C以及扩展数据图。2D-g)我们发现有反应的肿瘤在Foxp 3+治疗后的调节性T细胞(Tregs)，而治疗后无反应的肿瘤与反应性肿瘤相比，表现出明显的增加(图1)。1D)。我们以前观察到Treg细胞的异质性。21，以4-1BB的双峰分布为特征TNFRSF 9)，已知的Treg激活标记22。为了研究这种异质性是否与治疗反应有关，我们进一步对Tregs进行了差异表达分析。与治疗后的反应性肿瘤相比，预处理和非反应性肿瘤中的Tregs一致地上调了4-1bb的信号。+Tregs(图1.1E以及扩展数据图。2H)，包括与免疫抑制功能相关的基因(IL1R2, 雷尔和莱恩)(图1.1F以及扩展数据图。2I)。利用基因集富集分析(Gsea)，我们进一步证明了4-1bb的富集。+Tregs在无反应和预处理肿瘤(扩展数据图)。2J)，这与先前的一项研究一致，该研究报告说，4-1BB+肿瘤基因组图谱肺腺癌(LUAD)患者的Tregs与预后不良相关21。与Tregs不同的是，CXCL 13-Th1样细胞的表达在治疗后表现出反应性肿瘤的增加(如图所示)。1D)。对T细胞克隆性的进一步检查显示，与无反应的肿瘤相比，反应性肿瘤中的扩展的Th1样细胞有显著的增加(图1)。1g)，支持这些细胞在ICB治疗中发挥关键作用。23。使用先前发布的基底细胞癌(BCC)数据集10，我们还观察到Th1样细胞在治疗后反应性肿瘤中的富集情况(如图所示)。氢)，提示伴随肿瘤排斥反应的抗肿瘤免疫水平提高。

评估CD8浸润+我们首先用免疫组织化学(IHC)方法对剩余的肿瘤组织进行了免疫组织化学染色，观察到CD8的比例与T细胞有显著的相关性。+在scRNA-seq和染色数据之间的T细胞，这表明scRNA-seq可能至少部分地反映了这些细胞群体的真实浸润水平(图1)。2A以及扩展数据图。3A)。比较CD8+治疗反应之间的t细胞群，我们发现有反应的肿瘤表现出较高的CD8丰度。+T细胞与无反应肿瘤的比较(见图)。2B)，这与以前观察到的CD8是一致的。+T细胞浸润肿瘤可预测肿瘤存活24,25以及对免疫治疗的反应26。进一步了解CD8的反应+以pd-1为基础的T细胞，我们聚集了59,656个CD8。+T细胞，并鉴定出三种广泛的细胞群-末端tx，未耗尽和增殖的CD8。+T细胞(图1.2C以及扩展数据图。3B-E)。末端Tex细胞的特征是高表达的衰竭信号，包括PDCD 1, CTLA 4和HAVCR 2(无花果)二维空间)。新出现的证据表明，肿瘤中的终末Tex细胞是由肿瘤特异性T细胞产生的。27,28,29,30,31，而对急性感染负责的T细胞不产生Tex细胞。32。因此，终端tex子集可以用作肿瘤反应性T细胞室的代理。31,33。为了进一步支持这一观点，我们分析了以前报道的肿瘤抗原特异性T细胞的标记基因。30,31—ENTPD 1和ITGAE-并发现它们在终端Tex子集(扩展数据图)中特别表达。3E)。此外，我们还进一步研究了三种先前发表的肿瘤特异性CD8。+T-单元数据集31,34,35并发现这些细胞持续高表达一组衰竭标志基因(如图所示)。2E)，与我们的数据中的终端Tex子集有着深刻的相似之处(如图所示)。2F)。以往的研究表明，pd-1通路阻断可在一定程度上改善慢性病毒感染时末端tex亚群的效应功能。9。为了确定这种现象在人类肺癌中是否能被观察到，我们按照Pauken等人的类似程序，对那些报道的效应基因进行了GSEA分析。9事实上，在反应性肿瘤治疗后，这些基因的末端Tex子集明显富集(图1)。2G、扩展数据图。3F和补充表3)，提示其治疗后效应功能的改善。

a，CD8比例的相关性+在scRNA-seq和染色数据之间的T细胞。P通过对对数变换值的二尾Spearman秩序相关检验确定值，对数据进行线性化处理；n=7例肿瘤。b，CD8 T细胞在CD 45中的比例+细胞。数据以平均值±S.E.M表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-sided Wilcoxon test. c，UMAP图为59,656 CD8+来自所有47个肿瘤样本的T细胞，颜色由三个大细胞组编码。d、小提琴标记基因在不同CD8中的表达水平。+细胞群c. e在肿瘤反应性T细胞中的表达热图。35,34,31(分别在左上角、右下角)。f，谷胱甘肽a富集的末端Tex子集在本研究中的标志，以前报道的肿瘤反应T细胞。P用GSEA进行单尾排列试验。归一化浓缩分数。资料摘要n=47例肿瘤标本。g抗PD-1处理的末端Tex细胞转录组中效应基因集的富集点，与GSEA配对的预处理前Tex细胞相比，差异有显着性(P<0.0 5)；n=8前RX和n=9例RX后的8例有反应的肿瘤标本。P用GSEA单尾排列试验测定值。h，治疗后8例反应性肿瘤中终末Tex细胞的比例，显示为CD8总数的百分比。+细胞。P值是由双面决定的。t-测试*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

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探讨肿瘤消退是否主要是由终端tx细胞驱动的，如其他癌症类型所示。10,36，我们进一步分析了终端Tex细胞频率的变化，并观察到两种不同的模式(图1)。2H)。对于治疗前有低端tx浸润的反应性肿瘤，pd-1阻断剂优先增加了这些细胞的比例，暗示治疗后肿瘤反应性T细胞的浸润或扩展增加，这与以前的临床观察一致，即肿瘤样T细胞的增加与抗pd-1治疗人黑色素瘤有关。25和乳腺癌37。相反，高基线终端Tex浸润的肿瘤表现出相反的模式，这些细胞在相对频率上显著下降(如图所示)。2H表明，除末端Tex细胞外，其他细胞群也可能在肿瘤控制中发挥重要作用。由于多项小鼠研究表明，抗pd-1也能以txp细胞为靶点，以增强抗肿瘤免疫。11,24,38,39接下来，我们试图找出这些前体，以解决终端Tex细胞比例的波动。

对TXP细胞进行分析的一个典型过程是首先通过聚类来识别不同的细胞群，然后对大多数共享TCRs与终端Tex子集的簇进行检查。但是，我们之前的分析40表明这些簇可能含有tcrs，独立地与末端tex和血液效应细胞相连，这意味着未耗尽的肿瘤反应T细胞和潜在的旁观者细胞。30,31由于相似的转录表型，可能属于同一簇。为了更好地识别和表征TXP细胞，我们采用了一种基于TCR的选择策略，主要考虑两个因素：(1)基于穷竭标记的高表达无监督聚类，可以很容易地区分终端Tex子集。2C(2)TCR为追踪Tex细胞的谱系提供了可靠的分子标记。因此，这里我们只选择终端tx和未耗尽的CD8。+T细胞与终端Tex细胞共享TCRs，并将无监督聚类应用于这些细胞(如图所示)。3A)。除了终端和增殖的Tex细胞外，我们还确定了两种未耗尽的细胞状态，并与终端Tex子集共享TCR-GZMK+NR4A2–和GZMK+NR4A2+T细胞，每个细胞都有其独特的标记基因(图一)。3B，c以及扩展数据图。3G-j)。这两个簇均表现出协同抑制分子的表达减少和表达增加。GZMK(无花果)3C，d以及扩展数据图。4).

a、基于TCR的TEX(末端Tex和TXP)和Tex-无关细胞的筛选和鉴定。选择终端Tex细胞和与终端Tex相同TCRs的未耗尽细胞作为Tex细胞，然后进行第二轮无监督聚类。b，从Tex细胞计数>100的样本中提取Tex细胞的UMAP图，显示了四种转录上不同的细胞状态。n=20例NSCLC肿瘤标本。c，热图显示了四个已鉴定的细胞群体中某些特征基因的平均相对表达。b. d，umap图显示了特定标记基因在以下四个细胞簇中的表达水平：b,c. e，本研究中每个Tex子集的GSEA富集，用于标记先前报道的Tex细胞状态。P用GSEA进行单尾排列试验。f，RNA速度显示在扩散图上的最大Tex克隆从治疗前后P 019肿瘤活检，颜色由簇编码。g，比较每个基因在Tex细胞中的平均表达。y与Tex无关的细胞(x轴)红点显示调节后的Tex细胞中基因显著上调。P < 0.01, one-tailed t-测试。资料摘要n=20个样本b. h的表达水平。CXCL 13在Tex子集中n=33预处理，n=9治疗后反应和n=5例治疗后无反应肿瘤。i，穷竭评分和穷竭签名的表达沿CXCL 13。数据来自n总结33例非小细胞肺癌肿瘤的治疗方法。P值由Pearson相关系数确定。r，双尾线性回归t-测试。***P < 2.2 × 10−16. j，显示终端tex和texp元细胞在总数中所占比例的热图。CXCL 13+来自四个外部数据集的元单元。k、密度图显示CXCL 13使用肝癌研究中的数据，在终端tx和tex tcr中共享外周T细胞。43.

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以前的老鼠研究已经为Tex细胞定义了详细的发育框架。15,16,38因此，我们利用已知的干细胞、暂时性和末端Tex细胞的标记基因进一步进行了GSEA分析，以更好地描述人肺癌中Tex子集特异性的生物学特性(图一)。3E)。当然，GZMK+NR4A2–/+细胞与Beltra等人定义的中间Tex细胞的相似性最高。16以及Hudson等人的暂时性Tex细胞。15. GZMK+NR4A2–/+细胞与Tex也有很高的相似性。方案2Beltra等人定义的细胞，尽管GZMK+NR4A2–与之相比，细胞具有更强的富集能力。GZMK+NR4A2+细胞。值得注意的是，在我们的研究中，终端Tex细胞被选择性地富集，以获得小鼠Tex细胞的终末分化特征，证明了该簇的稳定性。此外，我们还分析了驻留内存和循环T细胞签名。41显示组织居住表型增加GZMK+NR4A2–到GZMK+NR4A2+细胞，并进一步到终端Tex细胞，与循环表型显示相反的模式(图)。3E)。使用先前公布的肺癌智能seq 2数据进行的类似分析21进一步证明的前体表型GZMK+NR4A2–/+单元和终端Tex子集的稳定性(扩展数据图。5A)。这些分析为逐步发展项目提供了有价值的见解。GZMK+NR4A2–到GZMK+NR4A2+细胞，进一步到末端tex细胞，这种潜在的分化轨迹得到了rna速度的进一步支持。42分析(图1.3F以及扩展数据图。5B)，尽管需要额外的功能验证。结合使用基于tcr的选择方法，我们表明GZMK+NR4A2–, GZMK+NR4A2+、末端和增殖的Tex细胞是四个转录上不同的Tex群体，存在于人肺肿瘤中。为了清晰起见，GZMK+NR4A2–/+子集在这里称为Tpe 1(GZMK+NR4A2–)和Tpe 2(GZMK+NR4A2+)细胞。

当比较Tex(末端Tex和TXP)细胞与CD8时+T细胞与终端Tex子集(Tex-不相关细胞)共享无TCR，我们发现CXCL 13在末端Tex和TXP细胞中都有高表达(如图所示)。第三代以及扩展数据图。4). CXCL 13由Tex细胞产生的细胞可介导免疫细胞向肿瘤的募集。29可能是三级淋巴组织形成的驱动因素之一。33。然而，先前关于治疗天真肿瘤的研究报告说，CXCL 13仅由终端tex子集表示。21,29,33。为了解决这个问题，我们分析了CXCL 13在德州细胞治疗前后发现CXCL 13高表达仅在德州细胞后，而不是预处理(图)。3H)。为了进一步验证这一点，我们收集了四组已发表的治疗数据--这两种非小细胞肺癌患者的天真T细胞。19,21和其他癌症类型40,43，试图对……的表达方式进行调查。CXCL 13肿瘤浸润CD8+T细胞为了解决辍学事件带来的潜在偏差，我们应用了MetaCell算法。44识别同质细胞群-元细胞(方法)，分析结果显示，衰竭评分与其表达水平之间存在显著的相关性。CXCL 13(无花果)3I以及扩展数据图。5C，d)。此外，我们发现CXCL 13在所有被分析的癌症类型中都有很高的表达，在txp和其他CD8中几乎不能检测到。+T细胞(图1.3J以及扩展数据图。5E，f)。进一步探讨CXCL 13，我们重点研究了具有匹配血液样本的数据集，并分析了其在外周血tx-tcr共享CD8中的表达情况。+T细胞，处于未耗尽状态，可轻易与末端Tex亚群区分开来。值得注意的是，CXCL 13在外周血中只有罕见的表达(如图所示)。3K以及扩展数据图。5G)，暗示CXCL 13只有在肿瘤微环境中细胞才能被上调。最近的研究表明CXCL 13被CD8上调+同时刺激tcr和TGF-β受体信号的T细胞45，进一步支持以下观点：在治疗中，天真的肿瘤，上调CXCL 13在肿瘤中，由于慢性抗原刺激，T细胞处于衰竭轴。33。因此，我们的观察表明，这些治疗后CXCL 13表达的TXP细胞可能是通过pd-1抗体阻断tx细胞向末端tx细胞的过渡而形成的。CXCL 13表情不受影响。

进一步验证上述假设，并解决终端Tex细胞减少的问题(图1)。2H)，接下来我们研究了在治疗过程中TXP细胞的丰度是如何变化的。14例治疗后肿瘤标本中，13例为原发于肺肿瘤(n=7)或淋巴结转移(n=6)。因此，我们首先评估了Tex亚群在不同类型的活检点之间是否具有可比性，并发现这些群体可以通过无监督聚类和监督细胞类型分类(扩展数据图)来持续捕获。6)，证明了它们的稳定性。为了能够精确地评估Tex子集的比例，接下来我们分析了每个优势的高置信度Tex克隆(方法)在每个肿瘤中。针对反应性肿瘤，我们观察到来自预处理肿瘤的大部分Tex细胞处于末期衰竭状态，而治疗后Tex细胞则为TXP细胞富集(图1)。4A以及扩展数据图。7在8例反应性肿瘤中，有6例持续观察到这种类型(P 010，P 013，P 019，P 030，P 033和P 035)。4B，c以及扩展数据图。7)。值得注意的是，反应性肿瘤之一P 029由于Tex细胞计数低(<30)而未包括在此分析中。进一步，对每个显性Tex克隆在反应性肿瘤中的差异表达分析表明，治疗后Tex细胞持续表达的耗竭基因水平低于预处理(扩展数据图)。8)，作为治疗的反应，支持TXP细胞的增加。通过对四种治疗方法的剩余活检材料进行多色IHC染色-天真和三种治疗反应的肿瘤(方法)，我们证实了cxcl 13表达的tct细胞(Cd8a)的存在。+CXCL 13+TIM3–)和末端Tex细胞(CD8A)+CXCL 13+TIM3+；扩展数据图。9A和补充图。1)。此外，CXCL 13表达的TXP细胞在处理后表现出较高的丰度(扩展数据图)。9A-d)，与我们的scRNA-seq数据一致。

a，基因表达热图的细胞从最大的Tex克隆在治疗前后P 019肿瘤活检。行代表选定的差异表达基因，列代表单个细胞。b，比较了预处理前后所有Tex细胞(终端Tex和TXP)中TXP细胞的频率。n=19)，治疗后无反应(n=4)和后处理反应(n=8)肿瘤。前处理P 001、P 013和P 033的样品因细胞计数低而被去除。每个点代表一个肿瘤活检样本，而中心线表示中值。下铰链和上铰链分别代表25和75百分位数，晶须代表1.5×四分位数范围。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-sided t-测试。c，TEX细胞在前三个合格优势Tex克隆中所占的比例(n=29个克隆)，后处理响应(n=14个克隆)和后处理无效(n(11克隆)肿瘤。没有显示10个或更少细胞的Tex克隆。中心线表示中间值，下铰链和上铰链分别代表25和75百分位数，晶须代表1.5×四分位数范围。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-sided t-测试。d，Volcano图显示了所有Tex细胞的差异表达基因。n=9治疗后反应和n=5例治疗后无反应肿瘤。每个红点表示一个经调整的单个基因。P < 0.01, two-sided t-测试。e，比较了TEx(末端Tex和TXP)和Tex-无关细胞的克隆扩增水平。n=8)和治疗后(n=9)反应性肿瘤。数据以平均值+S.E.M表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-sided t-测试。f，克隆大小在每个Tex-无关的细胞簇跨越八个反应的肿瘤，分离的治疗状态。中心线表示中间值，上下铰链分别代表第25和75百分位数，晶须表示1.5×四分位数的双边范围。t-测试。g，基于Metacell-在硅FACS中的CD8+T细胞n=8次响应性非小细胞肺癌，n=6黑色素瘤，n=6 BCC和n=2例SCC肿瘤。这个x轴表示CXCL 13而y轴耗竭得分。对于非小细胞肺癌肿瘤，从8个反应性肿瘤中总结了8个预处理和9个位点匹配的治疗后样本的数据。h，基于Metacell-在硅FACS中的CD8+14例治疗后无反应的黑色素瘤T细胞。

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接下来，我们将重点分析治疗后无反应的肿瘤以及剩下的治疗方法--天真的肿瘤。与预处理反应样本一样，这些肿瘤未能积累TXP细胞，最终Tex亚群占主要比例(图1)。4B，c以及扩展数据图。9E-g)。因此，治疗后无反应肿瘤中的Tex细胞表现出比反应性肿瘤更高的衰竭特征表达水平(图1)。4D)，展示了德州细胞在癌症治疗中的重要性。接下来，我们比较了Tex无关细胞和Tex细胞，试图进一步了解前者对治疗的反应。通过用先前开发的Startrac指数定义克隆扩展40我们观察到与Tex无关的细胞相比，Tex细胞表现出更高的扩张水平。4E)，支持Tex克隆的肿瘤特异性。此外，仔细检查Tex-无关的细胞簇，发现这些亚群在治疗后并不能显示出更高的克隆扩展(图一)。4F以及扩展数据图。10a，b)，表明Tex亚群可能是对基于pd-1的治疗产生反应的主要细胞类型。29,38,39,46，尽管还需要进一步的研究来验证。

为了探讨tcp细胞在肺癌治疗过程中的作用是否存在，我们分析了现有的三个数据集：+T细胞来自回应性基底细胞癌，鳞状细胞癌(SCC)10黑色素瘤肿瘤12。由于基于tcr的TECP细胞鉴定需要在处理前后捕获大克隆，这可能不适合这些数据集，因此我们在硅荧光激活细胞分类(FACS)中进行了元细胞分类；方法)区分CXCL 13-表达来自其他细胞的texp细胞。值得注意的是，这种方法很容易识别终端tex和CXCL 13+在我们的数据中的纺织品细胞(图。4G)并产生类似于基于TCR选择的聚类的结果。4B，c)。对基底细胞癌和鳞状细胞癌的进一步分析显示，Pd-1阻断后末端Tex细胞增多(图1)。4G)，表明肿瘤内有更多的肿瘤反应细胞，但是CXCL 13+在这两种癌症类型中，由于肿瘤微环境(TME)中的免疫抑制程度较高，未能观察到TXP细胞。我们下一次检查CXCL 13+黑色素瘤中的特克斯细胞。类似于我们的数据，这些细胞在治疗后在有反应的肿瘤中富集(如图所示)。4G以及扩展数据图。10C)，在无反应的肿瘤中几乎检测不到丰度(如图所示)。4H)。总之，我们的分析表明：(1)治疗后黑色素瘤中也可能存在TXP细胞的增加，(2)Tex细胞可能对不同类型的ICB治疗有不同的反应，但还需要进一步的研究。

关于在我们的数据中发现的德州细胞的增加，一个重要的问题是这些细胞是从哪里来的。三种可能的模式可以解释德州细胞的形成：(1)通过治疗将最终的tex细胞重新编程成texp细胞；(2)预先存在的texp细胞的局部扩张；(3)外周T细胞的补充。10,47。关于其中的第一个问题，Pauken等人先前对小鼠淋巴细胞性脉络膜炎病毒(LCMV)进行了研究。证明末端tex细胞由于表观遗传稳定性而不能获得记忆性T细胞表型。9并且，与本报告一致，我们上述的RNA速度分析揭示了一个清晰的单向流动从德州至终端Tex细胞(图)。3F)，支持不可逆分化为最终耗尽的T细胞。14,15虽然还需要对人类肿瘤来源的末端Tex细胞进行直接检测。

接下来，我们评估了预先存在的TECP细胞是否能在治疗后扩张.尽管德州细胞的丰度很低，但它们确实在肿瘤预处理中被发现(图一)。3B这进一步支持了对单个Tex克隆的进一步检查(扩展数据图)。7)。针对反应性肿瘤，我们发现在预处理肿瘤中可以检测到相当一部分治疗后Tex克隆型(如图所示)。5A)，相当于治疗后Tex细胞的62.2%。5B)。此外，这种重新出现(已存在的)克隆型在大规模情况下明显富集(如图所示)。5C)，表明它们在肿瘤抗原识别和进一步的抗肿瘤活性中起主导作用。为了进一步验证第二种模式，我们重点分析了前处理增殖的Tex细胞，以研究该簇是否含有某些TXP细胞。在这里，我们使用硅FACS中的元细胞来区分TXP和终端Tex细胞。作为一个测试用例，我们首先证明了这种方法能够有效地识别祖先(Tcf 1)。+)和末端Tex细胞在小鼠LCMV模型中的作用38，准确度为98.1%(扩展数据图)。10d)。当将这一方法应用于我们的数据时，我们在肿瘤预处理中发现了增殖的TXP细胞(图1)。5D)，证明了预先存在的TECs细胞的扩展是可以发生的，并且是TI细胞在处理后积累的一种重要方式。

a，Venn图显示治疗前和治疗后反应性肿瘤之间的Tex克隆型共享。b，左，所有治疗后Tex阵挛型的饼图，颜色取决于治疗前是否在同一肿瘤中观察到该克隆型。右边是与左侧Tex克隆型对应的所有Tex细胞的饼图。资料摘要n=8例反应性肿瘤。c，框图显示预处理特异性克隆的大小(n=98)，治疗后特定(n=159)和重新出现(n=152)n=8例反应性肿瘤。中线表示中、下、上铰链分别代表25和75百分位数，晶须表示1.5×四分位数范围。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-sided t-测试。d，以Metacell为基础的硅流式细胞术预处理增殖性Tex细胞。这个x轴表示耗尽得分和y轴心增殖分数(方法).

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除了克隆出现在治疗前和治疗后(见图)。3A-c通过进一步分析治疗前缺失的新克隆，我们发现这些新克隆相对于反应性肿瘤中特定于基线对照的克隆也表现出了更高的比例(扩展数据图)。10 e-j)。以前有人认为，新的Tex克隆来自肿瘤以外的部位。10,47,48促使我们认为，这些在我们的研究中重新出现的克隆，就像新克隆一样，除了局部扩张模式之外，还可能补充最近招募的新鲜细胞。

为了进一步研究是否可以从外围补充tcr-seq，我们对四个反应良好的样本在治疗前后进行了大量的tcr-seq测试。方法)，并发现这些克隆型在肿瘤组织中也能在血液中检测到(如图所示)。6A)。此外，我们通过将肿瘤中所有共有的克隆型与血液中的克隆型匹配来扩展我们的分析范围，并观察到克隆大小有一个普遍且显著的相关性(图一)。6B)，这与先前的观点一致，即外周T细胞可以作为瘤内T细胞池提供。47。为了进一步证明这一概念，我们分析了治疗后在外周血中出现的新的肿瘤内Tex阵挛型的克隆丰度。值得注意的是，大多数新的Tex克隆型(87%)仅在治疗后的血液中检测到(如图所示)。6C-f)，支持治疗后新的肿瘤抗原特异性的新克隆的激活10。有趣的是，对于那些治疗后已经存在的肿瘤内Tex阵挛型，也观察到了类似的模式。6C-f治疗前仅在血液中检测到63%的Tex克隆型，而在治疗前肿瘤中有许多这样的阵挛型是大的(如图1所示)。6g)。为了解决这一现象是否由潜在的测序偏差引起，我们分析了已发表的bcc数据集，并进一步证实了治疗后血液中重新出现的Tex克隆型的富集(扩展数据图)。10k-m)。这种治疗很可能增强了肿瘤反应性克隆的激活和扩展，从而增加了这些克隆在外周血中的丰度。

a静脉图显示外周血T细胞与瘤内T细胞的TCR克隆型重叠。b，血液和肿瘤中的克隆大小相关。肿瘤各克隆型克隆大小的散点图(x轴心)和血液(y提供P 010、P 013、P 019和P 030的数据。P数值由双尾线性回归确定。t-测试，在日志转换克隆大小，使数据线性化。c、血液中每个检测到的Tex克隆型克隆大小的散点图。Tex阵挛型分为预处理特异性、治疗后再出现(已存在)和治疗后出现新的阵挛型。d，每个检测到的新(n=23)及预先存在(n治疗前后血液中Tex克隆型(克隆大小>1)，加随机抖动判别点。黑线表示中值。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-sided Wilcoxon test. n=4例(P 010，P 013，P 019和P 030)。e治疗前后血液中Tex克隆型丰富。Tex阵挛型分为预处理特异性、治疗后再出现(已存在)和治疗后出现新的阵挛型。f显示血液中Tex阵挛型扩张模式的派图，由大剂量TCR-seq在治疗前或治疗后血液中是否能完全检测到这些克隆型所确定；n=4例。g本研究对P 010和P 019治疗前后肿瘤内Tex克隆大小进行了散点图分析。每个点表示一个Tex克隆型，颜色由这些克隆型是否能在治疗前或治疗后的血液中被大量TCR-seq检测到。h，UMAP图，所有8,433个细胞从治疗后P 019血液，颜色编码的细胞簇。i、UMAP图CXCL 13P 019在瘤内Tex细胞治疗后的表达水平。j、治疗后血液样本(P 019)中T细胞的UMAP图，颜色由它们是否与瘤内Tex细胞共享TCR序列来编码。共鉴定出14个外周TXP细胞。k平均CXCL 13在治疗后外周血和瘤内纺织品细胞中的表达。平均分布CXCL 13在瘤内纺织品细胞中的表达n=1,000次排列测试(n=每项测试的随机细胞数)。l，新的和重新出现的(已存在的)Tex克隆的贡献。对NSCLC、BCC和SCC的数据进行了总结，结果表明，治疗后出现的Tex阵发性阵挛型(TOP)和细胞(底部)数量与治疗后新的Tex阵挛型(TOP)和细胞(底部)的数量之比与治疗前Tex克隆型(TOP)和细胞(底部)的数量有关。P数值由双尾线性回归确定。t-测试日志转换值，使数据线性化。m。Tex克隆型数目的比较(y(轴)检测到n=5 BCC和n=8例NSCLC预处理肿瘤。中线表示中、下、上铰链分别占第25和75百分位数，晶须代表1.5×四分位数范围。双面t-测试。

源数据

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尽管TCRs在外周T细胞和瘤内T细胞之间共享，但TXP细胞迁移的方向尚不清楚。为了进一步解决这一问题，我们对P 019剩余的冷冻后血液样本进行了配对scRNA-seq和scTCR-seq(图1)。六小时以及扩展数据图。10n)，其取样时间点与治疗后肿瘤活检的时间点相同.这些瘤内纺织细胞已被证明高度表达CXCL 13基因(图1.6I)而且，如果肿瘤内的毒素细胞泄漏到血液中，我们应该能够检测到CXCL 13在治疗后的外周细胞中。使用基于tcr的谱系跟踪方法，我们识别了某些外周CD8。+T细胞(n=14)与瘤内Tex细胞共有相同的TCRs(图1)。6J)，但是CXCL 13在这些外周组织中没有表达，在其他CD8中也没有表达。+T单元(扩展数据图)。10n)。为了探讨这一观察是否是由于辍学所致，我们对治疗后的瘤内特克斯细胞进行了排列分析，以估计平均分布。CXCL 13表达式，而这一分析进一步证明了CXCL 13癌旁细胞与瘤内细胞间的表达(图一)。6K)。我们的数据，连同以前的报告47,49,50，支持T细胞向肿瘤的迁移，尽管需要更多的直接证据来证实这一迁移方向。

我们的分析表明，除了克隆替换新的Tex克隆10，细胞与先前存在的Tex克隆具有相同的克隆类型，可在治疗后重新激活并进一步进入肿瘤(图1)。6B-d)。为了进一步了解肿瘤治疗过程中新的和重新出现的Tex克隆的贡献，我们将我们的数据与已发表的bcc和SCC数据集相结合，并将治疗前肿瘤中Tex克隆的数量与治疗后再出现的Tex克隆的比例进行匹配。结果表明，再出现的Tex克隆的频率随预处理Tex克隆数的增加而单调增加(图1)。6L)。这一分析表明，大多数BCC肿瘤有较低的基线Tex浸润(如图所示)。6米因此，Pd-1的阻断将促进新的Tex克隆的扩展和浸润，可能是通过促进新的肿瘤新抗原的处理来实现的。相比之下，肺癌样本往往是“热肿瘤”，在治疗前有大量的肿瘤内Tex克隆，包括大量的肿瘤特异性克隆。总之，我们的数据表明，新的和预先存在的Tex克隆在治疗癌症中可能很重要，我们将其在治疗后用外周T细胞补充的现象称为克隆复兴(图1)。7)，作为对先前克隆替换模型的确认和扩展。

示意图显示了TXP细胞克隆再生和扩展的过程。瘤内TXP细胞是通过扩增已存在的TXP细胞和用新的和已存在的克隆型(克隆性复苏)的外周T细胞补充而积累的。Pd-1抗体在这些TXP细胞上的进一步作用将阻止其向末端Tex细胞的转变。主要组织相容性复合体。

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在本研究中，我们利用scRNA-seq来了解抗PD-1与化疗联合治疗的机制。利用基于tcr的谱系跟踪技术，我们鉴定了两种与肺癌高表达相关的tcp细胞状态。GZMK以及疲惫信号的低表达。这些tcp细胞在治疗后有反应的肿瘤中大量增加，很可能是对pd-1治疗产生反应的主要细胞类型，这与以前的研究是一致的。29,38,39,46。我们的数据表明，这些TXP细胞不太可能来自于最终Tex细胞的重新活力；相反，它们是通过克隆性再生和扩展现有的TXP细胞来积累的，从而提供了对ICB治疗机制的深入了解。

尽管在某些非小细胞肺癌肿瘤中存在较高基线的Tex浸润细胞，但许多在肿瘤中存在的Tex克隆型仅在治疗后的血液中检测到(图一)。6C-f)。一个可能的解释是，随着免疫抑制活性的增加伴随着肿瘤的进展，某些肿瘤反应克隆在癌症早期被激活，随着时间的推移，血液中的活性逐渐减少。经Pd-1处理后，这些克隆被激活和扩展，导致血液中的丰度增加(图1)。6d)。此外，新的和已有的Tex克隆克隆的克隆恢复表明，新招募的德州细胞，无论是从外围或其他来源，如淋巴器官。11，除了局部扩张外，可能是治疗成功的另一个关键因素，尽管这两种模式各自对抗肿瘤免疫的贡献还需要进一步的研究。

我们的分析表明，不同癌症类型的ICB治疗对Tex细胞亚群可能有不同的影响。基底细胞癌和鳞状细胞癌在对ICB的反应中表现出明显的末端Tex细胞的扩张，并且在最近的一项乳腺癌研究中也观察到了这种扩展。37肺癌和黑色素瘤肿瘤倾向于积累TXP细胞，治疗后最终Tex细胞显著减少。这种差异可能是由于不同癌症类型的免疫抑制程度不同，或者是由于这些肺癌患者同时使用了化疗。未来的治疗策略，以增加德州细胞的积累，可能进一步改善这些癌症的临床反应。在本研究中，我们认为终端Tex细胞是肿瘤反应性T细胞室的代表，并在这些Tex克隆型的基础上进行了随后的分析，尽管未来的体外实验将需要证明肿瘤的特异性。鉴于在非小细胞肺癌患者治疗前和治疗期间收集连续临床肿瘤活检的挑战，本研究使用了有限的样本，因此需要基于更多抗PD-1治疗患者队列的未来工作来概括我们的发现。此外，我们的结果主要是基于转录数据和进一步的功能实验是需要验证。