一种基于Agent的模型的生成及其在ccRCC进化中的应用
为了了解克隆多样化的时空特征，我们开发了一个粗粒度元胞自动机模型来模拟ccrcs的演化动力学(请参阅方法详细说明)。该模型包括12个基因和14个SCNAs(扩展数据图)。1)在TRACERx肾研究中被确定为ccRCC中的典型驱动事件。7。每个模型单位，被称为“肿瘤体素”，代表1毫米的肿瘤体积。3。肿瘤体素在生长过程中随机经历生长、死亡和获得驱动事件。随着增殖的进行，一些肿瘤体素获得了具有选择性优势的驱动事件，这在目前的研究中表现为生长概率的增加(p生长)。考虑了两种实现选择优势的方法，即“饱和”和“加性”驾驶员优势模型。在饱和驾驶员优势模型中，p生长肿瘤体素可以达到三个水平之一({p_{matrm{Growth}){matrm{初始}，p_{matrm{Growth}^{左侧({matrm{中等}})}，p_{\mathrm{growth}}^{({\mathrm{maximal}})}\}\)。每个驱动程序赋予肿瘤体素其中一个水平，以及驱动程序的选择优势的相对差异，表示为s，假设它们与肿瘤区域的Ki 67评分有关(扩展数据图)。1)及其在临床队列中的频率7。为了简单起见，将单个驱动基因突变分配给p(initial)growth，而4个与Ki 67得分密切相关的SCNAs(7q增益、20q增益、4q损失和8p损失)则被认为是分配给Ki 67分数的最强驱动程序。p(maximal)growth因此，它们的收购将导致增长概率的最大增长。重要的是，饱和模型的实现只有两个层次的选择优势，肿瘤体素的生长概率在1时达到饱和，如果获得最强的驱动力。加性驱动优势模型具有更多的选择性优势的逐步实现，其中肿瘤体素的生长概率由它所携带的所有驱动因子定义，\(p_{\mathrm{growth}}=p_{\mathrm{growth}}^{({\mathrm{initial})}}+mathop{\sum}\NoLimits_k{p_{mathm{Growth}\_k}}，在哪里p生长k反映驱动程序添加的增长概率的数量。k(扩展数据图。2)。金额p生长k司机之间的差异，并根据其与Ki 67分数关联的不同强度分配(扩展数据图)。1和2).
为了使模型保持最小，还作了额外的假设。假定个体驱动基因突变是以更大的概率(p司机)而不是SCNAs。假设同一基因的第二次突变永远不会发生在同一个肿瘤体素中。因为大多数ccRCC都是克隆的VHL一般情况下和TRACERx肾队列中的灭活事件7，创建者肿瘤体素被认为是包涵体。VHL失活和3p丢失作为克隆事件。根据TRACERx肾研究的数据7，以及功能证据31,32，突变PBRM 1或BAP 1假设增加了SCNA捕获的概率。SCNA的突变和获取被认为是增殖依赖的，这意味着DNA复制和染色体错误分离是基因组改变的主要来源。最后，假设驾驶员所赋予的选择优势是固定的，因此本研究不考虑环境变化对驾驶员优势的影响。
每个模拟都是从单个肿瘤体素携带开始的。VHL和3p丢失和结束时，大小超过100万肿瘤体素，反映约12厘米的肿瘤直径。模拟肿瘤在多个空间尺度上进行分析(如图所示)。1D)。在扩展数据图中给出了仿真过程的流程图。3.
生长方式对克隆性多样化程度的影响
我们假设生长方式影响克隆多样化的程度。为了检验这一点，我们首先评估了克隆多样性在模拟结束。体积生长条件下的肿瘤通常只有亲本无性系，缺乏进一步的亚克隆多样性，或含有单一优势亚克隆，而表面生长条件下的肿瘤含有多个优势亚克隆(图1)。1E)。有趣的是，在表面生长的肿瘤中，扩张的亚克隆也与肿瘤形态的变化有关。这些亚克隆最初以局部的方式呈现为隆起的结构，后来生长不足以覆盖大面积的肿瘤表面。接下来，我们统计了整个肿瘤中克隆的数量(图)。2A，b)。在体积生长的情况下，只有在体积较大的肿瘤中才能观察到亚克隆。s更大p司机(无花果)2B)。相比之下，在表面生长模型下，对于广泛的s、小到中度肿瘤p司机窝藏了更多的亚克隆(图1.2B)。然后，我们展示了肿瘤的各个部分所占据的亚群体和肿瘤的适应度(测量为肿瘤体素在肿瘤切片中的平均生长概率，方法)。总体上，体积生长模型描绘了克隆进化和适应度的二分法：克隆多样化和低肿瘤适应度的证据有限(图1)。2C(i)或存在一个具有高肿瘤适应度的显性克隆(如图所示)。2C(二))。后一种模式反映了早期将一个高度合适的克隆固定在一个“天生就坏”的肿瘤的子集中。与之相比，在表面生长模型中，几乎所有病例都表现出广泛的亚克隆多样化和增强的肿瘤适应能力，即使在小的情况下也是如此。p司机(无花果)2C(三、))。带着一个大的p司机，几乎所有肿瘤都达到了峰值适应度(扩展数据图)。1)。在具有加性驱动优势的模型中也注意到了更广泛的亚克隆多样化(补充说明)。1以及扩展数据图。2)。这些不同的生长模型被定量地反映在亲本克隆的全肿瘤癌细胞分数(CCF)中。二维空间)和Shannon多样性指数(方法还有无花果。2E)。使用这两种度量标准，表面生长模型的多样化程度也在更小的情况下被注意到。p司机(补充图。1)或更小s(补充图。2)。为了描述亚克隆多样化的模式和对比这两种生长模式，我们将我们的参数分析限制在以下几个方面：s=1和范围p司机从2×10−4至1×10−3.
图2：生长方式对克隆多样化和肿瘤适应度的影响。a、全肿瘤克隆多样性分析的原理图。b，显示平均克隆数(即父本克隆和亚克隆)与驱动程序获取概率有关的热图(p司机)和选择系数(s)在体积增长(I)和表面生长(II)模型中。每个参数条件下的平均数值是从硅肿瘤中的50计算出来的。有一个完整的肿瘤CCF至少0.05的克隆被计数.c，在体积生长(I，II)和表面生长(III)下，硅瘤中亲本和最大亚克隆的全肿瘤CCF。每个模拟肿瘤切片的平均适应度被表示为一个热图。在这些模拟中，驱动程序获取的概率是p司机 = 2 × 10−4(I)，1×10−3(Ii)及2×10−4(3)。‘父母(3P损失，VHL)克隆与多达5个亚克隆一起显示，整个肿瘤CCF为0.01或更高。其余的所有亚克隆都表示在“其他”组中。d，在体积生长和表面生长条件下，硅肿瘤亲本克隆的全肿瘤CCF具有不同的获得概率。n=每项条件100。e、体积生长和表面生长条件下硅肿瘤Shannon多样性指数随获得概率的变化而变化。n=每项条件100。f,g，随机抽样(10%)肿瘤体素的平均适应度与中心最(10%)肿瘤体素的平均适应度相比，在饱和模型中(f)和添加剂(g)司机的优势。数据点反映了具有不同增长模式(颜色)、驱动程序获取率(大小)和实现坏死(符号)的模拟集。热图显示有代表性的硅肿瘤，在表面生长时不发生坏死，也没有坏死。统计注释d和e反映双面Wilcoxon检验：*P≤0.0001。在盒子里的情节d和e，盒的两端反映下(Q1)和上(Q3)四分位数，差表示iqr；分隔盒的水平线反映中间值；垂直线的末端表示范围内的极值。({matrem{q}1-1.5\x{matrem{IQR}})到({matrem{q}3+1.5\x{matrm{IQR}}\)垂直线以外的点表示潜在的异常值。
源数据
我们进一步将中央坏死纳入一组模型，以评估其对克隆性多样化的影响。29。简单地说，在坏死的地方，远离肿瘤表面的肿瘤体素发生死亡的几率很高(p坏死 = 0.5) (方法)。在这两种生长模式中，坏死的结合通常会导致克隆进化的更大程度和模拟结束时观察到的更高的适应度(扩展数据图)。4和补充图。3)。为了进一步研究坏死对肿瘤不同部位健康的影响，我们收集了中心、边缘或随机定位的肿瘤体素样本(方法)。表面生长模型在一般情况下比体积增长模型具有更高的适应度，这在随机样本中得到了证明(图1)。2F，g和附图。4和5)。当坏死发生时，肿瘤中心的适应度在表面生长模型中显著提高(如图所示)。2F，g，补充说明2和附图。4和5)，与我们最近的研究保持一致29。更广泛地说，表面生长导致了更广泛的亚克隆多样化，与高度分枝的肿瘤进化相对应，而体积生长则导致肿瘤的克隆多样化证据有限，或肿瘤早期固定相应于间断进化的合适亚克隆。有趣的是，这些进化模式对应于ccrcc所确定的进化亚型。7。低适应度的肿瘤子集具有有限的亚克隆多样性，而其他肿瘤则早期固定高度合适的克隆，导致快速克隆扫描。7。也有肿瘤具有广泛的亚克隆多样化，其特点是一系列驱动因素。
生长方式对克隆多样性空间分布的影响
接下来我们研究了克隆多样性的空间分布。3A和方法)。在表面生长条件下，代表宏观多样性的多个亚克隆在肿瘤边缘附近频繁地占据明显的空间毗连区和微多样性热点(图1)。3B)。在典型的体积生长模型中，观察到一个优势亚克隆，微多样性热点的分布更为均匀。3C)。接下来，我们探讨了ccRCC中是否存在类似的模式。利用至少包含两个亚克隆的区域作为TRACERx肾数据中微多样性热点的代表，我们观察到了与表面生长模型(例如‘K 234’)和体积生长模型(例如‘K 446’)对应的微多样性的空间格局。三维空间)。表面生长模型与临床数据一致，但边缘附近微多样性普遍较高，边缘有较高的变化，在隆起较多的区域微多样性明显较高。
图3：生长方式对克隆多样性空间特征的影响。a，二维肿瘤切片中微多样性分析的原理图和程序。b,c、亚克隆(I)和微多样性(II)在硅肿瘤表面生长中的空间分布图(Ⅰ)和微多样性(II)。b)或数量增长(c)与p司机 = 2 × 10−4，显示属于亲本克隆(灰色)和其他亚克隆(随机生成的颜色)的肿瘤体素。d，在TRACERx肾研究中，有两个病例(K 234和K 446)的颜色编码的区域活组织切片图。从红色到紫色到蓝色的颜色反映了亚无性系数量的减少。‘Low’和‘High’分别反映了K 234中的1个亚克隆和4个亚克隆，在K 446中分别反映了2个和4个亚克隆。e累积概率分布，P(D≤ d)，在表面生长和体积生长的硅肿瘤和ccRCC肿瘤中与肿瘤中心的归一化距离。n=100对于每个模型条件下的表面生长(‘S’)和体积增长(‘V’)。“p司机 = 2 × 10−4‘表示驱动程序捕获概率为2×10−4。对54个ccRCC肿瘤的606个PT区进行了分析。“零模型”反映了指数为2的幂律。f，自举幂律指数k，如(P(D)d^k)，拟合自举样本产生的累积概率分布(方法)与n = 100 k每个条件下的值。g,h，自举幂律指数k在ccRCC肿瘤中，根据复发情况(g)或疾病进展率(h)与n = 100 k每个条件下的值。统计注释f–h反映双面Wilcoxon检验：*P≤0.0001。在盒子里的情节f–h，盒的两端反映下(Q1)和上(Q3)四分位数，差表示iqr；分隔盒的水平线反映中间值；垂直线的末端表示范围内的极值。({matrem{q}1-1.5\x{matrem{IQR}})到({matrem{q}3+1.5\x{matrm{IQR}}\)垂直线以外的点表示潜在的异常值。
源数据
有趣的是，从微多样性热点到肿瘤中心的归一化距离的累积概率分布，d，描述的幂律缩放(图1.3E)，建议可以用一个简单的数学公式(即，(P(D)d^k)，在哪里k是拟拟合的幂律指数)。与之相比，表面生长模型显示出更大的尺寸。k(无花果)3F和补充图。6)，表明微多样性热点在肿瘤边缘附近富集的可能性更大。关键的是，亚克隆模式的空间均匀化消除了特征尺度行为(补充说明)。3以及扩展数据图。5)，说明肿瘤生长的空间要素在产生微多样性方面的重要性。具有加性驱动优势的模型显示出类似于微多样性热点的分布(补充说明)4以及扩展数据图。6)。将坏死纳入模型，重新调整表面生长模型中的空间轮廓，导致坏死肿瘤中心额外的微多样性热点的富集(补充说明)4以及扩展数据图。6)。在54个具有微多样性热点的肿瘤中也观察到了幂律型(图1)。3E)。此外，幂律标度指数之间也有关联。k复吸状态(图1)。第三代)和疾病进展率(图1。3H)在TRACERx肾研究(补充表)1)，而临床结果较差的肿瘤通常与微多样性热点更陡峭的空间分布和肿瘤边缘的富集有关(补充说明5和补充图。7)。肿瘤的衰减进展显示出一个陡峭的微多样性热点梯度，与表面生长模型一致。有趣的是，没有进展的肿瘤和快速发展的肿瘤都显示出微多样性热点的浅梯度，这与体积生长模型很好地对应，它们的进化证据有限，并且早期固定了合适的克隆。克隆多样性空间特征的观察(补充表)2)增加了我们先前的发现，即总体遗传多样性与病人的临床结果相关。7.
生长方式对平行进化事件和最小亚克隆空间格局的影响
由于亚克隆的多样化可能涉及到相同基因在空间分离位置上的不同突变的获取和促进，因此我们接下来评估平行进化事件的频率及其空间特征。在TRACERx肾研究中，在28个肿瘤中观察到平行进化，每个事件跨越不同的区域(补充说明)6和补充表3)。有趣的是，具有有限克隆扩展(仅跨越单个区域)的平行突变事件在不同的ccRCC中显示出不同的空间模式，这表明在同一基因上正在进行的收敛进化可以在肿瘤的不同位置运行(见图)。4A)。在某些情况下(例如K 252)，这类事件都接近边缘；在另一些情况下(例如，K 520)，它们位于边缘很远的地方(图一)。4A，b)。我们假设，观察到的平行突变事件的不同模式可归因于增殖模式和最近的亚克隆出生。为了检验这一点，我们回到了计算模型，并检验了不同的生长模型在最年轻的亚克隆的模式上是否和如何不同(见图)。4C)。在表面生长模型中，我们观察到最年轻的亚克隆在肿瘤边缘附近优先分布，在体积生长模型中分布更为均匀。4D(i)和扩展数据图。7)。有趣的是，当坏死合并时，表面生长模型通常呈现双峰分布，最年轻的亚克隆出现在肿瘤表面附近或坏死内部，这种模式在体积生长模型中很少被观察到(图1)。4D(二)).
图4：生长模式对平行进化和最年轻亚克隆空间特征的影响。a，距具有平行突变事件的区域的距离，这些突变事件跨越一个区域到肿瘤边缘。红色矩形表示两个有代表性的案例，如b. b，包含两个典型情况下平行突变事件的区域图(PBRM 1K 520(I)和BAP 1在TRACERx肾研究中K 252(II)发生的事件。不同的平行突变事件用不同的颜色表示。对于包含两个以上平行突变的区域，同时施加两种颜色。双头箭头表示距肿瘤边缘的距离.c，二维肿瘤切片中最年轻的亚克隆的分析原理图。d，从最小亚克隆的位置到肿瘤边缘的距离，在模型中没有(I)或(Ii)实现坏死。n每个模拟中的100个最年轻的亚克隆被分析并显示为灰色点，与边缘的平均距离用一个彩色竖直表示。n在每个模型条件下，从小到大的平均距离(从上到下)排列为50次模拟。表面生长模型和体积生长模型分别以红色和蓝色表示，随着颜色强度的增加，驾驶员获取概率增加。e，从包含基因组改变的区域到肿瘤边缘的距离。只包括至少十个区域的肿瘤。红色矩形表示两个有代表性的案例，如f. f、TRACERx肾研究中有代表性病例(K 523和K 156)活检颜色中的亚克隆数的区域活检图。从红色到紫色到蓝色的颜色反映了亚无性系数量的减少。‘Low’和‘High’分别反映了K 523中的1个亚克隆和4个亚克隆，在K 156中分别反映了1个和6个亚克隆。位于单个区域内的区域由箭头标记，如果位于肿瘤边缘10毫米以内，则为绿色，否则为橙色。g,h，K156肿瘤区代表区域的组织学图像(g)和K 523(h)。垂直虚线a,d和e相当于10毫米的距离。
源数据
在不同生长模式模型中观察到的最年轻亚克隆的不同模式的激励下，我们转向临床数据。集中于最广泛抽样的20个ccRCC案例(n≥10个区域从TRACERxRenal，我们观察到事件跨越一个区域(被认为是最近/最年轻的亚克隆)接近肿瘤边缘(例如，K 523，K 360和K 234)，并位于不同的距离肿瘤边缘(例如，K 156，K 165和K 272)(图)。4E，f以及扩展数据图。7)。对这些具有代表性的具有高度克隆多样性的病例的观察7表明它们是通过表面生长进化而来的，但K 156、K 165和K 272中的坏死使内部的年轻亚克隆得以诞生。有趣的是，对K 156的组织学评估显示，在宏观上都存在多细胞区(补充图)。8)和显微镜(图1.4G)在肿瘤的内部，它连接着最年轻的亚克隆，与K 523的内部形成对比。4H)。这些观察表明，持续的增殖和克隆进化发生在肿瘤边缘，但也促进了内部的可用空间。
生长方式对克隆性多样化时间特征的影响
我们通过硅时间历程分析研究克隆多样化的时间特征.总体而言，亚无性系的数量在体积增长模型中仍然有限，但随着时间的推移，在表面生长模型达到一个平台之前有所增加(见图)。5A，b以及扩展数据图。8)。因此，表面生长和体积生长模型最初表现出相似程度的克隆多样化和随后的差异。值得注意的是，当坏死发生时，体积生长模型受到的影响最小，但我们观察到，在肿瘤生长后期，尤其是在实现附加驱动优势的情况下，克隆多样性显著减少(扩展数据图)。8)。这反映了“剪枝”对克隆结构的影响，并消除了不太适合的亚无性系。这些观察结果与先前观察到的肿瘤大小和克隆数之间的非单调关系相吻合，包括肿瘤体积很大时克隆多样性的崩溃。7.
图5：生长模式影响克隆多样化的时间特征。a，在表面生长和体积生长条件下，硅肿瘤中二维肿瘤片直径的大小与亚克隆数的关系。n=50次模拟(P_{matrem{驱动器}}=6倍{10^{-4})每种情况。b，KDE与体积生长(I)和表面生长(II)下硅肿瘤中二维肿瘤片的亚克隆数和直径有关。每个KDE图基于250次模拟(每个条件50次)，在五个条件下(P_{matrem{-4}=2乘以10{-4}，4乘10{-4}，6乘以10{-4}，8乘以10^{-4}，{matrem{和}}，1乘以10{-3}). c，在没有(I)或(Ii)实现坏死的情况下，将随时间变化的进化流与肿瘤体素之间累积的子克隆数和平均驱动数的向量映射。n=50次模拟(P_{matrem{驱动器}}=6乘以10^{-4})都显示出来了。d中并行突变的空间模式。PBRM 1(上，不同颜色的事件)和微多样性(较低)随着时间的代表硅肿瘤表面生长。箭头表示在亚克隆扩张之前的萌芽结构。e在表面生长模型中，随着肿瘤切片直径、等高线圆度和平均驱动数的积累，肿瘤切片的亚克隆数和平均适应度随时间的变化而变化。n=50次模拟(P_{matrem{驱动器}}=6乘以10^{-4})都显示出来了。f一例典型病例(K 523)皮质髓质对比期轴向图像显示肿瘤表面的萌芽结构(红色箭头)。红色的轮廓反映了肿瘤的轮廓，给出了体积肿瘤的覆盖范围。g，在一个典型病例中，用编码的亚克隆颜色的数目来绘制肿瘤区域的地图。从红色到紫色到蓝色的颜色反映了亚无性系数量的减少。‘Low’和‘High’分别反映了一个亚克隆和四个亚克隆。h，在TRACERx肾研究中，根据模拟数据用KDE覆盖的亚克隆数作为最终肿瘤大小的函数。肿瘤的大小可达7厘米，并具有明显的萌芽结构(橙色)。在表面生长(红色)和体积增长(蓝色)下，等高线反映了基于表面生长(红色)和体积增长(蓝色)的硅肿瘤的90%概率密度。6B.
源数据
由于新的亚克隆的诞生是通过在肿瘤体素中获得新的驱动事件来定义的，因此，表面生长模型显示出更广泛的克隆多样性，它以比体积增长模型更快的速度积累了更多的驱动程序(扩展数据图)。8)。然而，相对于克隆多样化的速度，累积驱动因素的数量在表面生长模型中随时间单调增加。表面生长下的重复模拟明显显示出“进化流”的变化方向，表明优势亚克隆的能力和后期总体克隆多样性的减少(图一)。5C)。在这些观测的基础上，表面生长导致多项式增长，达到停止条件的时间更长，而体积增长则导致指数增长(扩展数据图)。8)。体积生长模型生长速度较快意味着亲本克隆对肿瘤整体生长的贡献较大，优势亚克隆的生长和竞争时间较短，导致肿瘤的多样化程度有限。
进化潜力的早期指示
我们以前已经证明，进化特征与临床结果相关，可以用来指导病人的管理。7。因此，研究计算模型是否可以用于提示可能的进化轨迹以及个体肿瘤的临床行为的预测特征，是非常有意义的。
值得注意的是，早期肿瘤在不同的生长模式下，与亚克隆的数量没有区别(见图)。5A)。我们专门研究了在表面生长模型中可能表明随后的亚克隆多样化的特征，并注意到芽结构的出现和生长(图1)。5D)。值得注意的是，随着肿瘤的生长和适应度的提高，肿瘤切片的轮廓圆度先减小后恢复，同时伴随着克隆多样性的最初增加和随后的减少(图1)。5E)。试图“回放”进化的探索性模拟(即从历史肿瘤状态重新模拟克隆进化，以已建立的克隆结构为起点)，从不同的肿瘤大小出发，表明如果从出现萌芽结构的历史肿瘤状态开始，则进化更可重复(补充说明)。7和扩展的数据图。9和10).
针对上述发现，对TRACERx肾研究中46个直径<7cm的肿瘤的影像学特征进行了评价(补充表)。4)。通过对放射图像的定性检查，16个肿瘤表面有明显的萌芽结构，在体内肿瘤中明显可见(图中显示了一个代表，K 523)。5F，g)。在这种情况下，与芽结构相邻的是克隆多样性较高的区域，与表面生长模型一致。有趣的是，在这16个7厘米以下的肿瘤中，随着肿瘤大小的增加，这些肿瘤的出芽率也越来越高，再加上一些较大的肿瘤中没有萌芽和低多样性(图一)。5H)，与表面生长模型观察到的克隆多样性和形态变异的时间趋势一致。这一趋势不能继续在较大的肿瘤支持所观察到的亚克隆多样性崩溃在表面生长的模拟肿瘤。
