小细胞肺癌基因组的总体均一性 在19个切除的LS-SCLC肿瘤(以下简称肿瘤)中，共有50个肿瘤区域(以下简称区域)接受了WES(补充图)。 1 ，补充图。 2 ，补充数据 1 )。所有患者均未接受术前化疗或放射治疗。共有3773个非沉默(非同义词、移码、停止增益和停止丢失)突变被从这50个肿瘤区域中识别出来(补充数据)。 2 )中位非沉默肿瘤突变负担(TMB)为4.69/Mb(间隔四分之一(25~75)范围：2.66~6.43/Mb)。TMB在患者之间有很大差异，但在同一肿瘤内不同区域之间有相似之处(附图)。 3 ).
我们构建了18个SCLCs的系统发育树，其中有多个区域的wes数据(p13只有一个肿瘤区域，被排除在此分析之外)，以描述这些sclcs的基因组ITH和进化轨迹。 12 。中位数为80.1%(28-93%)(四分之一(25~75)个变异范围：72-84%)被定位在这18个SCLCs的主干上(图1)。 1A )代表同一肿瘤内所有区域普遍存在的突变，而TRACERx队列中100例早期非小细胞肺癌中72%(8-99.6%)(四分位数(25-75)范围：55-84%)为主干突变。 p =0.218) 14 。考虑到每个肿瘤的区域数可能在主干突变的比例中引入偏差，我们计算了同一肿瘤中不受区域数目影响的每对标本之间的突变Jaccard指数(JI)(附图)。 4 )在18个SCLCs(补充图)中。 5A )。结果表明，在TRACERx(补充图)队列中，基因组JI在SCLC和NSCLC的队列中具有可比性。 5B ，0.83比0.82， p =0.6058)。
图1：有限期小细胞肺癌(LS-SCLCs)的基因组瘤内异质性(ITH)和克隆结构。 a 18例有限期小细胞肺癌(LS-SCLCs)多区全外显子序列分析(WES)的系统发育树。蓝色、棕色和红色分别代表主干、分支和私有突变。主干(蓝色)、分支(棕色)和私有分支(红色)的长度与3、2或1个肿瘤区域共有的突变数成正比。突变的总数列在每个肿瘤的系统发育树上。TP 53和RB1突变被映射到系统发育树上。 b 肿瘤水平上小细胞肺癌的全局克隆结构。PyClone是在同一肿瘤不同区域的合并BAM文件上运行的。突变可分为克隆性突变(存在于细胞发病率最高的细胞群中，蓝色)或亚克隆突变(橙色)。每个肿瘤的总突变数列在每个肿瘤的顶部。注：由于PyClone不能推断某些突变的克隆状态，各肿瘤的突变数均小于系统发育分析中的突变数。病人身份：紫色=活着；绿色=死者。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们使用一种基于基因的cna分析算法来评估ls-SCLC的染色体拷贝数畸变(Cnas)。 26 对于WES数据，比较不同样本之间的CNA负担(补充图)。 6 )。同一肿瘤内不同区域的CNA负担相似，但患者之间差异很大(附图)。 7A )。中位CNA JI为0.50(范围：0.02~0.93)(四分位数(25~75)范围：0.27~0.85，附图)。 5C )，高于来自TRACERx队列的NSCLC肿瘤(中位数0.21，范围0~0.99)(四分位数(25~75)范围：0.06~0.35，附图)。 5D )。CNA异质性在不同的染色体位置存在差异(附图)。 7b
为了进一步了解小细胞肺癌肿瘤的整体克隆结构，我们将同一肿瘤内不同区域的wes数据进行合并，并利用pcyclone计算肿瘤水平上克隆和亚克隆突变的百分比。 27 。结果显示，全球肿瘤水平克隆突变的中位数为82.8%(24.4%-99.8%)(四分位数(25~75)范围：65.8~91.7%)。 1B )，再次显示出一个相对相同的突变景观。
在这些肿瘤中共发现134例癌症基因改变(补充图)。 8 )。正如预期的那样，最常见的癌症基因是RB1和TP 53，在19例患者中分别有16例(84%)和15例(79%)。重要的是，134例(64%)癌基因改变中有86例(64%)发生在同一肿瘤内的所有区域，其中30例(88%)肿瘤基因点突变(肿瘤水平已知克隆状态)为克隆性突变。这些结果表明，这些肿瘤基因的改变是SCLC进化过程中的早期基因组事件，这些肿瘤的基因组结构不仅在数量上是均匀的，而且在关键的癌症基因的改变方面也是定性的。
不同的突变过程与SCLC的早期和晚期突变有关。 了解突变过程是如何影响肿瘤进化的，从而了解肿瘤适应的机制。 28 。我们分析了这些SCLCs的突变谱和特征。 29 。C>A转换是最常见的核苷酸替换(补充图)。 9 宇宙信号4(与吸烟有关)是主要的突变信号(补充图)。 10A )如出一辙，考虑到所有19名患者要么是吸烟者，要么是大量的二手烟。
为了进一步分析这些SCLC肿瘤的早期和晚期癌变相关的突变过程，我们分别描述了代表早期基因组事件的主干突变和代表后期事件的非主干突变的突变特征。 28 。如附图所示。 10b，c 在前5位突变信号中，宇宙信号4仍然是主干突变的主要特征，占前5位的62%，这与以前的报告一致，即吸烟相关的突变过程在肺癌的早期突变过程中起着关键作用。 12 ,14 ,30 。另一方面，签名4的贡献显著降低(29%的非主干突变签名，而62%的主干突变签名在前5位签名中)。 p =0.002)，宇宙标记3(与dna双链断裂修复缺陷相关)成为非干突变的主要特征(45%的非干突变信号，6%的主干突变信号，在前5位签名中)， p < 0.0001). These results highlight the dynamic nature of mutagenesis at different time points during evolution of SCLC and suggest that smoking-associated mutational processes play essential roles during early carcinogenesis of this cohort of SCLC, while later evolution may be associated with other mutational processes such as DNA repair defects.
小细胞肺癌的冷TCR储备 接下来，我们对36例肿瘤标本(每个肿瘤1~3个区域)和16例有足够DNA残留的癌旁肺组织进行了TCR测序。T细胞密度是T细胞在标本中所占比例的估计值，介于0.11%至33%之间，中位数为1.7%(四分位数(25~75)范围：0.57~3.97%)(附图)。 11A 11B )T细胞克隆性，一种描述T细胞增殖和反应性的指标，范围从0.002到0.139(中位数=0.009)(中间四分位数(25-75)范围：0.005-0.0025)(补充图)。 11C )。与癌旁肺组织(≥距肿瘤边缘2cm)相比，小细胞肺癌表现出较低的T细胞密度、丰富度和克隆性( p =0.0580， p =0.0067，以及 p 分别=0.0166，附图。 11d-f 21 。如附图所示。 11 , P13 是TCR参数中的一个异常值。因此，我们重新进行了这一分析，不包括P13，这并没有导致显着的变化(补充图)。 12 )。特别令人感兴趣的是，与使用NSCLCs(前景队列)相同方法生成的TCR库数据相比，所有三种TCR指标都显著低于NSCLCs(T细胞密度0.014比0.21， p < 0.0001 (Fig. 2A p < 0.0001 (Fig. 2B )；克隆性0.009对0.14， p < 0.0001 (Fig. 2C 21 。同样，小细胞肺癌肿瘤的总TCR模板也明显低于非小细胞肺癌肿瘤(附图)。 13 ).
图2：小细胞肺癌(SCLC)与非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤的TCR指标(前景队列)。 a T细胞密度--估计T细胞在标本中所占的比例， b T细胞丰富度--衡量T细胞多样性和(c )T细胞克隆性--一种指示T细胞扩展和反应性的指标，来源于19个SCLCs(红色)。 对决 236个NSCLCs(蓝色)来自前景队列。10例小细胞肺癌TCR瘤内异质性(ITH)分析 对决 11 NSCLC使用( d )平均Jaccard指数(JI)，这是一个代表共享T细胞克隆类型比例的度量， e Morisita指数(MOI)，它不仅考虑了T细胞克隆型的组成，还考虑了单个T细胞阵挛型的丰度和(f )在有多区域TCR数据的SCLC(蓝色)和NSCLC肿瘤(RED)中，在同一肿瘤内的任何配对样本中共有的20个TCR克隆型的比例。用双侧Mann-Whitney检验评价小细胞肺癌与非小细胞肺癌TCR指标的差异.源数据作为源数据文件提供。
较高水平的免疫细胞浸润可导致低肿瘤纯度。反之，较低的肿瘤纯度表明免疫细胞浸润程度较高.我们用赛琴察法估计肿瘤纯度。 31 在这组LS-SCLCs中，并将其与本土化NSCLCs进行了比较。如图所示。 3A 与非小细胞肺癌相比，这些小细胞肺癌的肿瘤纯度明显高于非小细胞肺癌，这可能是支持小细胞肺癌免疫浸润较低的可能。
图3：小细胞肺癌(SCLC)与非小细胞肺癌(NSCLC)免疫特征的比较。 a SCLCs与NSCLCs的肿瘤纯度比较。肿瘤纯度来源于来自19个SCLC肿瘤(蓝色)和242个NSCLC肿瘤(RED)的全外显子测序(WES)数据。 b T细胞浸润SCLCs与NSCLCs比较。对81例小细胞肺癌(George Cohort)和1027例TCGA非小细胞肺癌(NSCLC)的RNA序列(RNA-seq)数据进行反褶积，得到T细胞浸润。 c SCLCs与NSCLCs的免疫评分比较。根据RNA-seq数据计算免疫评分，对81例小细胞肺癌(GeorgeCohort)和1027例TCGA非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤中的免疫细胞进行量化。 d 小细胞肺癌CD3+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs) n =67)与非小细胞肺癌( n =68)肿瘤免疫组化(IHC)。Y轴代表CD3+TIL：肿瘤细胞比率. e SCLCs中CD3+TIL与肿瘤纯度的关系( n =19)。Y轴代表CD3+TIL：肿瘤细胞比率. f 程序性死亡配体-1(PD-L1)在小细胞肺癌中的表达 n =67)与非小细胞肺癌( n =68)肿瘤。采用双侧Mann-Whitney试验评价SCLC与NSCLC的免疫特征差异.用双尾Spearman秩相关检验评价CD3+TILs与肿瘤纯度的相关系数(R)。源数据作为源数据文件提供。
此外，我们通过量化肿瘤内所有免疫细胞的密度来获得免疫评分，并通过对先前发表的81个sclcs的rna-seq数据进行反卷来估计T细胞浸润的比例。 23 并与来自TCGA的1027个NSCLCs进行了比较。 30 ,32 。与TCR的结果相一致，SCLCs的免疫评分和T细胞百分比均显著低于NSCLCs( p < 0.0001, p < 0.0001, respectively, Fig. 3B，c
采用T细胞标记物CD3和程序性死亡配体-1(PD-L1)(补充图)对肿瘤浸润的T细胞进行免疫组织化学(IHC)检测。 14 )在66例小细胞肺癌肿瘤中，包括本研究中的18/19例肿瘤(1例肿瘤组织耗尽)和68例非小细胞肺癌肿瘤(补充数据) 1 )具有匹配的临床特征，包括性别、年龄、吸烟状况和肿瘤大小(表) 1 )。如图所示。 三维空间 小细胞肺癌肿瘤T细胞浸润明显低于非小细胞肺癌肿瘤(p<0.0001)。重要的是，T细胞浸润与肿瘤纯度呈负相关( r =−0.47， p =0.0405，图1。 3E T细胞浸润减少是SCLCs肿瘤纯度高于NSCLCs的潜在原因之一。此外，pd-L1在SCLCs中的表达也显著低于NSCLCs( p < 0.0001, Fig. 3F )。综上所述，这些数据表明，与NSCLCs相比，SCLC在切除时的T细胞浸润总体较低，而非更高水平的适应性免疫抑制。
小细胞肺癌TCR储备异质性的研究 为了进一步了解TCR异质性，我们计算了JI，测量了两个样本间共享T细胞克隆型的比例。所有SCLC肿瘤均存在明显的TCR异质性，在具有多区域TCR数据的10个SCLCs中，JI中位数为0.05(0.02~0.15)(图1)。 4A )，显著低于11个本地化的NSCLCs 13 (小细胞肺癌的中位数0.05与非小细胞肺癌的0.16， p < 0.0001) (Fig. 二维空间 )具有多区域TCR数据 13 4B )，明显低于非小细胞肺癌(中位数：5.7%，范围：1.6%至14.5%)(四分位数(25至75)范围：3.6%至7.4%)( p =0.0048) 13 显示深远的TCR ITH在SCLC甚至超过非小细胞肺癌。值得注意的是，TCR JI与T细胞密度、丰富度和克隆性呈正相关，尽管不是普遍的统计学意义(补充图)。 15A-c
图4：小细胞肺癌(SCLC)肿瘤内异质性(ITH)表现为实质性T细胞受体(TCR)。 a Jaccard指数(JI)对TCR ITH的定量研究，JI是一种用多区域TCR测序数据代表10例小细胞肺癌患者中两个T细胞克隆型的比例的指标。 b 10例小细胞肺癌患者的T细胞克隆型在所有区域(共享区、蓝色区)、2/3区(棕色区)和局限于同一肿瘤区域(红色区)的多区TCR测序数据中所占的比例。病人身份：紫色=活着；绿色=死者。源数据作为源数据文件提供。
为了比较考虑T细胞扩张的共享TCR克隆类型，我们使用了两个额外的度量标准：Morisita指数(MOI)，它不仅考虑了T细胞克隆型的组成，还考虑了其丰度，以及共享顶部(最扩展/最丰富)20个克隆型的比例。类似于TCR JI，与NSCLCs比较 13 小细胞肺癌肿瘤TCRMOI明显降低，共有20个TCR克隆型(图1)。 2E，f )，提示在SCLC肿瘤中TCR ITH水平较高，不仅可用于整个TCR储备，也可用于最扩展/最活跃的T细胞。
SCLCs中的频繁拷贝数异常、干扰素-γ通路基因丢失及HLA-LOH 为了鉴定小细胞肺癌冷TCR储备的基因组畸变，我们首先评估了(HLA)-A-，-B-和-C-在硅肺中出现的新抗原。 33 ,34 。中位88(39-503)(分位数(25-75)范围：53-125)预测肿瘤抗原(IC) 50 < 500 nmol/L) per tumor were detected (Supplementary Fig. 16A )，与NSCLCs相似(中位数72/肿瘤，2-801，四分之一(25~75)，35~125，p=0.25)。与体细胞突变相似，81%(48%-93%)、四分之一(25%至75%)的预测肿瘤抗原存在于同一肿瘤的不同区域(补充图)。 16b 和91%的预测新抗原(21%-100%，四分位数(25%) TH TH )范围：77%-82%)与肿瘤水平的克隆突变有关。这些结果提示小细胞肺癌的冷TCR储备不太可能是由于低的克隆性新抗原负担所致。
接下来，我们将评估cna负担与tcr汇辑之间的关联。 35 ,36 。每个肿瘤的CNA活动中位数为2310次(26-8044次，25~75次)，444~4318次不等。 7A )，明显高于NSCLCs中的每个肿瘤111(范围0-7741，间隔四分之一(25-75)范围：0-561)。 p < 0.0001)21 ，它们比SCLCs的这一组表现出了更为活跃的TCR储备(图一)。 2A-C )。重要的是，CNA负担与T细胞密度、丰富度和克隆性呈负相关。 5A-C r =−0.40， p =0.0157； r =−0.36， p =0.0321； r =−0.33， p (分别=0.0490)，表明较高的CNA负担是与这些SCLCs TCR储备受损相关的一个重要的基因组特征。
图5：染色体拷贝数畸变(CNA)与T细胞受体(TCR)的关系。 CNA负担及其与T细胞的负相关(英文) a )密度，( b )丰富，和( c )克隆性在36例小细胞肺癌(SCLC)标本中同时有CNA和TCR数据。相关系数(R)采用双尾Spearman秩相关检验.源数据作为源数据文件提供。
CNA对免疫逃逸的潜在影响之一是新抗原的丢失。 35 ,37 。在这个队列中，预测的新抗原相关基因没有观察到比其他突变基因更频繁地丢失(补充图)。 17A )。接下来我们将探讨杂合性丢失(LOH)是否与预测的新抗原丢失有关。如附图所示。 17D ，LOH在染色体3p、5、13、15和17p区域富集，与以往报道一致。 23 ,38 。拷贝数中性LOH(CNN-LOH)在预测的新抗原相关基因中比与新抗原无关的突变基因更常见(补充图)。 17B )。拷贝数丢失LOH(CNL-LOH)也有相同的趋势，但差异无统计学意义(补充图)。 17C )。这些结果提示，LOH导致的新抗原丢失可能是SCLCs免疫逃避的潜在机制之一。一个重要的后续问题是这些预测的新抗原是否在LOH下保持或丢失.推测，所有与新抗原相关的LOH事件都必须是亚克隆性的，否则，这些导致新抗原的突变就不会被发现。如果这些预测的新抗原保持在(或发生在)LOH之下，这可能表明LOH作为一种免疫逃逸机制缺乏免疫逃避能力或无法发挥LOH的作用。由于目前尚无可靠地推断LOH克隆状态的计算方法，我们使用主干(LOH存在于同一肿瘤内的所有区域)和分支(LOH存在于同一肿瘤中的某些区域(LOH)状态)来表示LOH的克隆状态。总体上，89.8%(40.2%至99.3%)的LOH事件是同一肿瘤内所有区域共同发生的主干事件(附图)。 18 和 19 )，提示这些LOH事件是这些SCLC肿瘤演化过程中的早期分子事件。重要的是，与预测的新抗原相关的基因的中位数只有16%(范围：1.5%-26%)，与预测的新抗原相关的LOH事件的中位数为18%(范围：0-73%)。 20 )。所有的技术警告都承认，这些结果并不支持LOH作为这组SCLC肿瘤免疫逃避的主要机制。
据报道，抗原提呈途径的基本基因(如b2m、jak 1和jak 2)的突变和干扰素γ(IFN-γ)途径基因的拷贝数丢失在免疫逃避中起着关键作用。 39 ,40 。在这组SCLCs中，我们没有检测到APC-通路基因的任何突变。然而，干扰素-γ途径基因的拷贝数丢失在这组SCLCs中经常被发现(见图)。 6A )，明显高于NSCLCs(图1)。 6B )。重要的是，干扰素-γ通路基因拷贝数的丢失与CNA负担呈正相关(图1)。 6C )。这些数据表明，与高全球CNA负担相关的必要免疫基因的频繁丢失可能是SCLCs潜在的免疫逃避的基因组基础之一。
图6：干扰素γ(IFN-γ)通路基因在小细胞肺癌中的拷贝数丢失及其与非小细胞肺癌的比较。 a 19例小细胞肺癌患者50例γ通路基因拷贝数丢失。紫色病人ID=活着；绿色病人ID=死者。 b 来自TRACERx的50例小细胞肺癌标本(蓝色)和327例非小细胞肺癌标本(红色)IFN-γ通路基因拷贝数丢失。 c 小细胞肺癌IFN-γ通路基因拷贝数改变与总体CNA负担的相关性(英文) n =50)。采用双侧Mann-Whitney检验，评价小细胞肺癌与非小细胞肺癌IFN-γ通路基因拷贝数丢失负担的差异。用双尾Spearman秩相关检验评估IFN-γ通路基因CNA负荷与总CNA负荷的相关系数(R)。源数据作为源数据文件提供。
HLA的LOH也被报道为一种潜在的针对不同癌症的免疫逃逸机制。 41 ,42 。在19例SCLC肿瘤中，有9例发现HLA LOH，其数值高于TRACERx中的NSCLCs(9/19对9/19)。36/90， p =0.61)和预期队列(9/19对60/216， p 虽然由于样本规模小，差异没有达到统计意义。在21例HLA LOH患者中，与丢失等位基因结合的预测新抗原中位数为52.7%(0~89.7%)(补充图)。 21 )支持HLA-LOH作为免疫逃避的潜在机制之一。另一方面，一些肿瘤(如P01、P04和P14)只有一小部分预测的新抗原与丢失的等位基因结合，表明其他因素可能导致这些肿瘤的免疫逃避。
综上所述，这些结果表明，在这些小细胞肺癌的发生过程中，曾经存在免疫压力。基本免疫基因缺失和HLA-LOH可能是免疫逃避的常见基因组改变。最终，这些小细胞肺癌肿瘤能够在免疫压力下存活，导致有限的免疫浸润，表现为低T细胞浸润和低T细胞扩张。有趣的是，在9个SCLC肿瘤中，5个肿瘤在所有区域(P04、09、17、18和19)均有HLA LOH，而4个肿瘤在1个或2个区域(P0.01、02、07和14)出现HLA LOH。同样，在同一小细胞肺癌的不同区域，也有不同的干扰素-γ途径基因的缺失(如图所示)。 6A )。这些数据表明，不同的免疫逃逸机制可能不仅在不同的患者，而且在不同的亚克隆在同一肿瘤中发挥作用。
小细胞肺癌患者基因组和TCR ITH与生存的关系 接下来我们试图评估基因组和T细胞特征是否影响临床结果.鉴于样本数量有限，某些患者缺乏复发状态，我们将重点放在OS上。较高的TMB与明显长时间的OS有关(如图所示)。 7A ，HR=0.85， p =0.036)，与以往关于非小细胞肺癌的报告一致 43 。相反，在CNA负荷较高的患者中，OS明显缩短(如图所示)。 7b ，HR=1.21， p =0.014)。TCR参数(T细胞密度、丰富度和克隆性)与OS(补充图)无关. 15D-f 然而，具有更多异质性TCRJI(较低TCRJI)的患者的OS明显缩短(如图所示)。 7C ，HR=0.87， p =0.037)。
图7：整体生存(OS)与免疫基因景观的关系。 a 高(中位以上，蓝色)肿瘤突变负担(TMB)的患者与较低(低于中位数，红色)TMB的患者OS。 b 高(中位以上，蓝色)拷贝数像差(CNA)负荷的患者与较低(低于中位数，红色)CNA负担的患者OS。 c T细胞受体(TCR)均匀度较高的患者OS(高于中位TCR Jaccard指数(JI)、蓝色)的患者与差异较多的患者(低于-中位TCR JI，RED)。 d 肿瘤纯度较高(中位以上、蓝色以上)的患者与低(中位以下、红色)肿瘤纯度的患者OS比较，差异有显着性(P<0.05)。 e CD3+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)较低(<中位、红色)CD3+TILs者OS值较高(不低于中位、蓝色)。 f 阳性(蓝色)程序性死亡配体-1(PD-L1)表达阳性患者与阴性(0，红色)Pd-L1表达者OS。生存分析采用双面对数秩检验。源数据作为源数据文件提供。
有趣的是，较低的肿瘤纯度，大概意味着更多的免疫浸润，与更长的OS有关(如图所示)。 7D ，HR=1.30， p =0.001)。这一发现得到了对66例SCLC患者的IHC数据的进一步支持，在这些患者中，CD3水平较高的患者观察到的OS要长得多(如图所示)。 7E ，HR=0.32， p =0.0167)或pd-L1阳性表达(如图所示)。 7F ，HR=0.35， p =0.0249)。CD3浸润较高的患者也可观察到DFS延长(附图)。 22A ，HR=0.30， p =0.0059)或Pd-L1阳性表达(补充图)。 22b ，HR=0.54， p 肿瘤中T细胞浸润增加与这些小细胞肺癌患者的疾病控制和生存密切相关。
