慢性乙型肝炎患者免疫指标与肝硬化的关系

与慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染相关的宿主免疫应答和慢性炎症在肝硬化、肝癌等肝病的发病机制中起着关键作用。我们对175例HCC，117例肝硬化和165例非肝硬化对照者进行了长期乙肝病毒感染的前瞻性队列研究。采用多变量多因素Logistic回归分析和典型判别分析(CDA)方法，对发生肝硬化者与正常人及HCC与肝硬化患者的102个指标进行比较。采用左一出交叉验证法生成接收机操作特性曲线，比较各标记组的预测能力。经多变量调整后，HGF(Q4v1OR：3.74；p-趋势=0.0001)、SLAMF 1(Q4v1OR：4.07；p-趋势=0.0001)、CSF 1(Q4v1OR：3.00；p-趋势=0.002)、UPA(Q4v1OR：3.36；p-趋势=0.002)、IL-8(Q4v1OR：2.83；p-趋势=0.004)和OPG(Q4v1OR：2.44；p-趋势=0.005)均与肝硬化发展相关，这些指标预测肝硬化的准确率为69%。CDA分析确定了一个能够预测肝硬化发展的9个标记模型，准确率为79%。HCC组与肝硬化组无明显差异(P>0.05)。在这项研究中，我们评估了慢性乙肝病毒感染者肝脏疾病的免疫标记物.在必要的验证中，这些发现强调了免疫过程在乙肝相关肝硬化中的重要性.

世界卫生组织估计，全世界有2.57亿人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染。1。尽管在过去几十年中做出了重大的公共卫生努力，但与乙肝病毒相关的肝硬化和感染人群中肝癌风险的增加仍然是一个主要的健康问题。2。肝病的病因是多种多样的。然而，据估计，肝硬化和肝癌中可归因于乙肝病毒感染的比例分别高达30%和53%，相当于每年有20多万人死于肝硬化，30万人死于肝癌。3.

尽管肝脏疾病的风险有所增加，但大多数HBV感染者并没有发展成肝硬化或肝癌。慢性乙型肝炎病毒感染和随后的疾病的自然史仍有待充分阐明，这既受病毒(HBVdna水平、基因型和突变模式)又受宿主特定因素(年龄、性别、遗传多态性和免疫状态)的影响。宿主免疫反应在慢性乙肝病毒感染的易感性中起着关键作用；5-10%的急性乙肝病毒感染成人由于适应性免疫反应不足而未能清除病毒并发展为慢性疾病。4。对乙肝病毒在肝病发病机制的研究主要局限于实验性和小规模的临床模型，但始终显示慢性炎症在疾病进展中的作用。一些研究表明，乙型肝炎病毒特异性T细胞、趋化因子介导的中性粒细胞浸润、淋巴细胞和自然杀伤细胞在乙肝相关肝损害中发挥作用。5,6。这种炎症性微环境导致氧化应激，最终促进库普弗细胞通过核因子B(NF-κB，NF-κB)激活星状细胞，导致进行性纤维化，最终导致肝硬化。6,7,8,9.

循环免疫蛋白在肝癌发展的前瞻性队列研究中的作用已经被研究，显示了C-反应蛋白(CRP)等标记物的潜在用途。10,11、白细胞介素-6(IL-6)11,12，胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)13,14，以及细胞间粘附分子1(ICAM-1)15预测癌症的发生。然而，据我们所知，还没有研究全面评估循环免疫蛋白在慢性HBV感染者肝硬化发展中的作用。肝硬化相关的发病率和死亡率，以及伴随的肝癌在肝硬化个体中的风险很高。因此，评估哪些循环标志物与肝硬化、慢性HBV感染和HCC与肝硬化有关，可能有助于阐明所涉及的生物学过程，并可能为风险预测提供依据。在本研究中，我们利用病毒载量升高和相关肝病/癌症-乙型肝炎病毒(Disple-HBV)队列的风险评估数据，广泛评估慢性HBV感染者循环免疫标记物与肝硬化之间的关系。

学习人口

揭示乙肝病毒是一项纵向的、基于社区的队列研究，旨在更好地了解慢性乙肝携带者中肝癌的自然历史和危险因素。4。一九九一年至一九九二年，台湾七个乡共招募了23,820名年龄介乎30至65岁的人士。对基线样本进行血清学评估后，4155名参与者被确定为乙肝表面抗原(HBsAg)-血清阳性，其中3653名为丙型肝炎抗体阴性，没有HCC的证据。收集年龄、HBV基因型、吸烟、饮酒、体重指数(BMI)、糖尿病史等协变量。乙肝病毒是由台湾国立大学公共卫生学院(台湾台北)机构审查委员会批准的，所有参与者都提供了知情同意，这项研究是按照所有相关的准则和规定进行的。

肝硬化和肝癌的发展都是密切跟踪在揭示-乙肝病毒队列通过半年或一年的检查，直到2008年12月31日。肝硬化采用高分辨率、实时腹部超声及定量评分系统，反映肝脏表面特征(正常、不规则、起伏)、肝实质纹理(正常、不均匀、粗大)、肝内血管大小(正常、模糊、狭窄)和脾大小(正常、扩大)。1999年后，通过与台湾健康保险数据库的数据连接，进一步诊断肝硬化，并经医学图表审查确认。通过超声、α-甲胎蛋白检测或与台湾国家癌症登记处的数据联系，对肝癌的诊断也进行了类似的评估。另外还进行了与国家死亡证明计划的联系，并通过对组织病理学记录的医学审查，验证了肝癌的发病情况；当使用至少两种成像技术(腹部超声、血管造影或计算机断层扫描)和(或)一种成像技术和(或)一种成像技术以及血清α-甲胎蛋白水平为≥400 ng/mL时，肝癌病例得到了证实。

在病例对照分析中，92例肝硬化患者和129例慢性乙肝病毒携带者(即对照组)在性别、采集样本年龄、HBVdna水平(<10,000或≥10,000拷贝/mL)以及从进入到取样±2年的时间上进行了配对。为了确保这项研究有足够的动力，采用了性别、样本采集年龄和HBVdna水平(<10,000或≥10,000拷贝/mL)的频率匹配方法，对另外25名肝硬化患者和36名对照组进行了鉴定。在样本选择的时候，肝硬化被评估到2004年，肝癌一直持续到2011年；控制直到随访结束才被要求生存。

标记测量

经收集后，所有样本均存放于台湾台北中央研究院70°C，直至250升肝素血浆被装入96个井板，运至国家癌症研究所。选定的样本来自基线或尽可能接近基线。用Olink(瑞典乌普萨拉)炎症和心脏代谢板对184个免疫蛋白进行评价，每个面板需要1μL的样本。炎症小组是与炎症相关疾病的专家密切合作设计的，包括许多细胞因子、趋化因子和其他被认为与癌症相关的炎症标志物；心脏代谢小组之所以被选中，是因为它包含了最特异的肝脏蛋白质。对12例慢性HBV感染者和12例慢性丙型肝炎病毒感染者的48份盲质对照样本进行了分析。除12个标记外，其余所有标记的检出限均达到90%以上--这些标记被排除在分析之外；另有69个标记因组内相关系数<80%而被排除在外，另有一个标记因变异系数>25%而被删除(补充表)。S3)。最后，共有102个标记被包括在内。

统计分析

血清学标记被评定为分类变量，并按以下方式分组：对于在≥中可检测到的标记，75%的对照者根据检测极限(LLOD)以上的值创建四分位数，LLOD处的四分位数分配到最低四分位数。对于在50-75%的对照组中可以检测到的标记，创建了四个类别，LLOD的参与者被分配到最低的四分位数，其余的被划分为梯田。对于25%-50%的对照组中可检测到的标记物，在LLOD以样本组成的样本组成了最低的畸胎层，其余两类是根据LLOD之上的中间分裂值计算出来的。最后，对于在<25%的人群中可检测到的标记，在LLOD以上的标记的基础上创建了二进制编码。

采用非条件多因素Logistic回归模型，评价慢性HBV相关性肝病个体分类循环免疫标志物与分期的关系，具体而言：肝硬化患者与对照组比较，HCC患者与肝硬化患者比较。之前已经描述过这些标记与HCC与对照之间的关联。16。利用先验知识和逆向选择对潜在的混杂因素进行评估。最终模型包括连续年龄、性别、连续随访年限、HBVdna四分位数(对照组<300~12 570、12 571-45、919、45、920~229、307、229、308+拷贝/mL)、血清丙氨酸转氨酶(ALT)(<15、15~44、≥45 U/L)、酒精、吸烟、乙型肝炎病毒e抗原(HBe抗原)。考虑到原发性肝癌中潜在肝硬化患者的比例很大，我们对免疫标记物与肝癌与肝硬化之间的关系进行了敏感性分析。经多项检验校正后，经本雅明-霍奇伯格错误发现率修正为10%，经统计学检验有显着性意义。为了解决感染持续时间差异的潜在担忧，我们利用对照组之间的中位消减值对乙肝病毒DNA水平进行了敏感性分析；此外，我们还建立了以标志物水平为结果的粗糙模型以及年龄、性别、ALT、饮酒、吸烟和HBeAg调整的线性回归模型，并测试了病例状态与病毒载量之间的交互作用。为了评估时间对循环标志物与疾病状态之间的关联的作用，对未进展为HCC(6.57岁)的肝硬化患者进行了按中位时间分层的额外敏感性分析。这些分析的统计学意义用α=0.0 5来确定。

用典型判别分析(CDA)识别循环免疫标记的线性组，用Logistic回归模型对同一比较组进行差异表达，用α=0.0 5确定后向选择的统计学意义。最后，保留一次交叉验证。17通过计算受试者操作特征曲线(AUCS)下的面积来评价和比较三种模型的预测能力：1.临床/人口学特征(年龄、性别、随访年限、HBV病毒载量、ALT、饮酒、吸烟、HBeAg)；2.临床/人口学变量加上在Logistic回归模型中具有显着性的标记物；3.临床/人口学变量加上在CDA中有显着性意义的标记物。为比较发生肝硬化的人与对照组和仅发生肝癌与肝硬化的人，分别生成了不同的数字。以DeLong、DeLong和Clarke-Pearson方法为基础，用α=0.0 5确定曲线比较的统计学意义。所有统计分析均采用SAS软件9.4版(SAS Institute，Inc，Cary，NC)进行。

117例肝硬化患者从标本采集到肝硬化发展的中位时间为6.57岁(0.36~11.98)，从样本收集到HCC诊断的中位时间为10.50年(0.07-18.40)。在性别分布、饮酒、吸烟、肝癌家族史或BMI方面，HCC患者、肝硬化患者和对照组之间没有显著差异。与其他组相比，HCC患者的基线ALT水平更高，HBeAg阳性的可能性更大(表)1)。约62%(109/175)的肝癌患者有潜在的肝硬化。

用多变量Logistic回归对个体标记物进行评估，发现与对照组相比，有6种蛋白与肝硬化呈正相关。与对照组相比，肝硬化患者在基线时信号淋巴细胞活化分子1(SLAMF 1)水平升高的可能性是对照组的4倍(OR)。Q4v.Q1=4.07[95%CI 1.85-8.99]；肝细胞生长因子(HGF)与OR相似。Q4v.Q1=3.74(95%CI 1.67-8.38)，集落刺激因子1(CSF 1)，OR值Q4v.Q1=3.00(95%CI 1.38~6.49)，尿激酶型纤溶酶原激活剂(UPA)伴ORQ4v.Q1=3.36(95%CI 1.52-7.40)，白细胞介素-8(IL-8)，OR值Q4v.Q1=2.83(95%CI 1.29-6.23)，OPG为ORQ4v.Q1=2.44(95%CI 1.14-5.22)(表)2)。在FDR校正后，与肝硬化患者相比，我们没有发现任何与肝细胞癌风险显著相关的标记物(补充表)。沙一)。这些无效的结果仍然存在于敏感性分析中，即免疫标记物和肝癌与肝硬化之间的关系，而肝硬化是根据肝癌病例中潜在的肝硬化的存在而分层的(补充表)。S2).

基线时按HBVdna水平分层的敏感性分析结果与初步分析中的结果相似。在病毒水平较高(≥为45,920拷贝/mL)的人群中，所有6个标志物均与肝硬化密切相关。在基线水平较低(<45,920拷贝/mL)的人群中，只有HGF、SLAMF 1、uPA和肝硬化之间的关系具有统计学意义(表)3)。在线性回归模型中，我们没有发现这些标记物与HBVDNA水平之间的数值关系的证据(数据未显示)。在评估时间是否在观察到的关联中起作用时，在血清采集后<6.57年被诊断为肝硬化的患者中，所有六项指标都与肝硬化的发展密切相关。此外，与原始分析相比，这些标记的影响大小在此子集中更大。血清采集6.57年后诊断为≥的患者中，HGF、SLAMF 1、CSF 1和uPA与肝硬化相关(表)4).

CDA分离出9个在肝硬化患者和正常人之间进行鉴别的标记物，包括HGF和SLAMF 1，以及血管生成素(Ang)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP 3)、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINA 5)、嗜酸性蛋白(CCL 11)、两个C-X-C基序趋化因子(CXCL 11和CXCL 9)和Stam结合蛋白(STAMBP)。比较组的ROC曲线仅为临床/人口学变量模型，曲线下面积(AUC)为63.3%。Logistic回归模型识别的6个指标除临床/人口学变量外，ROC曲线的可预测性提高到68.5%。最后，CDA分析的9个标记模型除临床/人口学变量外，AUC为79.3%。1)；ROC对比试验结果发现，与单纯的临床/人口学模型相比，与p值≤0.0001相比，标记包容模型的aUC曲线显著提高了可预测性。

接收机工作特性(ROC)曲线比较预测模型。

全尺寸图像

CDA分析结果表明：IGFBP 3、SLAMF 1、真核翻译起始因子4e结合蛋白1(4e-BP 1)、caspase-8(CASP-8)、T细胞表面糖蛋白CD6亚型(CD6)、三种白细胞介素(IL-8、IL-13、IL-24)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、干细胞因子(SCF)、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。由于在Logistic回归分析中缺乏显着性指标，仅产生两条ROC曲线，临床/人口学变量模型(AUC=86.6%)与CDA分析的11个指标(AUC=88.5%)之间无显着性差异(p-值=0.07)。1).

这是第一项研究，我们的知识，以评估广泛的免疫标记物，因为他们与肝硬化的发展，在前瞻性观察队列的乙肝病毒感染的参与者。在此，我们发现6个单独的蛋白(HGF，SLAMF，CSF 1，uPA，IL-8，OPG)与肝硬化的发生有显著的正相关关系，这些标记在收集样本后7年内发展为肝硬化的个体中具有特别强的相关性。这些免疫标记物与HCC之间缺乏联系，提示这些标记物可能影响HBV感染者的肝硬化，而不是进一步发展为HCC。与单纯的临床/人口学变量相比，六个指标的加入使肝硬化发展的可预测性提高了约6%(63%比69%)。除了单独评估这些标记物外，我们还评估了一种标志物的组合是否能很好地区分那些患有慢性乙肝病毒感染的人，他们会继续发展为肝硬化，而那些没有这样的人。该分析确定了一个由Ang、IGFBP 3、SERPINA 5、CCL 11、CXCL 11、CXCL 9、HGF、SLAMF 1和STAMBP组成的9个蛋白组，除临床/人口学变量外，还能在交叉验证模型中预测肝硬化的发展，准确率为79%。

我们的研究发现，HGF，CSF 1和uPA--这三个被认为与肝再生相关的标记--水平的增加与临床肝硬化的发生几率更高有关。HGF主要由间充质细胞分泌，具有调节细胞运动和发育的功能，在肝硬化患者中曾被证明是升高的。18,19。目前流行的假说是成纤维细胞促进HGF的产生，刺激Met阳性肝细胞的生长。在乙肝病毒等传染性药物反复损伤的情况下，肝细胞的持续再生会导致成纤维细胞过度生长，最终导致肝硬化的发展。20。虽然通过一种不同的方法，CSF 1控制巨噬细胞数量，促进肝脏天然免疫防御，并最终支持肝细胞损伤后的增殖。在移植和捐献者中，循环的csf 1被证明与快速的肝再生有关。21,22。同样，csf 1在急性肝损伤患者以及那些被诊断为肝硬化和肝癌的患者中也有升高的趋势。22。最后，uPA是一种丝氨酸蛋白酶，参与基质蛋白的直接和间接降解，在肝脏中具有双向作用。Upa细胞表面结合蛋白表达的增加导致肝细胞upa在肝再生早期增加，但在后期，upa来源的纤溶酶导致肝细胞生长受到抑制。23,24,25。而此前有报道称纤维/肝硬化患者uPA升高。26近年来，其对肝细胞的双重作用引起了人们对其在基因治疗中的应用的兴趣。27,28.

根据HBV介导的炎症反应，我们发现IL-8和SLAMF 1的升高与临床肝硬化的发生有关。IL-8是一种CXC趋化因子，已被公认为急性炎症的主要因素。血清IL-8水平与慢性丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)患者的疾病进展有关。29,30。据报道，酒精性肝炎、缺血再灌注损伤和纤维化/肝硬化患者肝脏和循环中的IL-8水平均有所上升。31,32,33,34。同样，在Logistic回归分析中，经FDR校正后，CXCL 11和CXCL 9仅具有轻微的显着性意义，但在CDA分析中均被确定为肝硬化的鉴别指标。从我们的分析中可以看出，这些蛋白质水平的升高以前在肝脏疾病(不论是否有传染性病因)中都有报道，并且在功能上与炎症、肝损伤和纤维化有关。35,36,37。SLAMf 1(最近更名为CD 150)是一种调节转化生长因子-β信号的内源性物质，在组织修复、成纤维和癌变过程中发挥调节上皮间充质转化的作用。38,39,40。SLAMf 1水平的升高与转化生长因子-β1的上调、炎症和最近的肝硬化有关。41.

肝硬化可能与许多代谢紊乱有关，包括骨质减少症、骨质疏松症、胰岛素抵抗和营养不良。42,43,44。核因子受体激活剂κB配体(RANKL)和OPG通过与受体秩结合，共同维持骨稳态。OPG/RANKL系统共同作用于连接免疫系统和骨代谢。先前的研究表明，与非肝硬化慢性肝病患者和对照人群相比，肝硬化患者的OPG水平较高，RANKL水平较低。45据信，这一现象是由于一种补偿性反应，以制止受影响者的骨丢失。46。根据这些文献，但在慢性HBV感染者中，我们第一次发现OPG水平升高与肝硬化发展的几率增加有关。相反，低水平的IGFBP 3与肝硬化的发生有关。在CDA分析中，IGFBP-3被确定为区分肝硬化患者和正常人；肝硬化患者IGFBP-3水平下降的原因是IGFBP-3主要由肝细胞合成，并据报道与肝功能障碍的严重程度有关。47,48.

这项研究的一个主要优势是表明-HBV是一项特征良好的前瞻性队列研究，它提供了一个独特的机会来评估慢性HBV感染者的免疫标记物与肝硬化发展之间的关系；然而，这项研究确实有一些局限性。有可能有错误分类的倾向，因为肝硬化是在九九年后才与台湾健康保险资料库的资料连结诊断出来的，所以九一至九九年有可能出现肝硬化低诊断的情况。然而，队列参与者每6-12个月接受一次腹部超声检查，即使与保险数据库没有联系，也大大降低了诊断不足的风险。此外，我们没有使用抗乙肝病毒疗法的数据，这可能会掩盖协会；然而，抗病毒治疗直到2003年才得到台湾全民医疗系统的补偿，该系统涵盖了大部分研究期间，2003年之后，只有在严格的标准下才向高危患者提供抗病毒治疗。最后，由于样本数量有限，在分层分析中，血清标志物与疾病之间的分析可能不足。

更好地了解慢性乙型肝炎高危患者的自然病史，可为肝病的防治提供重要的理论依据。在这一新的，综合评价循环免疫蛋白，我们发现了几个标记，发现了显着地区分和预测肝硬化的发展，特别是在7年内诊断出的血液抽血。虽然长期感染HBV患者的筛查方案确实存在，但添加血清生物标志物可能有助于风险分层，以进一步加强这些程序。虽然这项研究需要复制，但这些发现强调了免疫和增殖途径在乙肝相关肝病中的重要性。