CRC患者组织中增强子分布的全基因组研究
为了全面了解大肠癌患者组织中活性增强子的全基因组观，我们从大肠癌患者中收集了80对组织(肿瘤及癌旁组织)。这些组织取自武汉大学中南医院(武汉)接受外科治疗的患者，在采集组织时没有具体的标准。患者多来自中国华中地区，尤其是湖北省。我们优化了芯片-Seq协议，并对这些样品进行了H3K27ac芯片-Seq，以及相应的mRNA和输入DNA测序。一些样本在研究中失败了，最终，我们从74个CRC组织和73个本地组织中获得了高质量的测序数据，其中73个是配对的。1A，补充图。沙一和补充数据1)。我们还对43对组织进行了H3K4me3芯片-Seq。共获得高质量测序样品524份，其中H3K27ac 147份，H3K4me3 86份，RNA-Seq 144份，基因组测序样品147份(Sup)。数据2)，为CRC研究提供了重要的表观基因组信息。
图1：CRC患者组织中活性增强子的注释。A研究CRC患者肿瘤和自然组织增强子景观的实验工作流程。B大肠癌患者肿瘤及自然组织中增强子成分的基因组分布。C饱和分析显示，随着肿瘤标本的增加，新获得的增强剂所占的百分比与总显着性增强剂相比较。D人基因表达的折叠变化(FC)和p.adj比较肿瘤组织和自然组织。红点代表肿瘤上调基因，蓝点代表天然组织上调基因，灰色点代表基因没有改变。E归一化芯片-seq和rna-seq Meta轨迹显示h3k27ac和mrna信号MYC启动子和增强子位点。F我们的患者数据与20个Coad细胞株(GSE 77737，Andrea J.Cohen等)之间的增强子位点重叠。G在本研究中发现的新增强子在CRC中所占的百分比。
在生物信息学分析方面，我们首先通过远离转录起始点(TSS)的H3K27ac峰来鉴定每个组织中的活性增强子。为了避免人工结果的干扰，至少在两个样品中出现的促进剂被认为是显著的促进剂。我们的分析显示，在土著组织中共有27,156种显著增强子，在肿瘤组织中有39,207种，其中大部分分布在基因内含子和基因间区域，如图所示。1B和补充图。S2A)。同时，我们分别在自然组织和肿瘤组织中分别鉴定了9896和10663个活性启动子(附图)。S2A)。饱和分析表明，用不到40对样本进行分析时，肿瘤的增敏剂达到80%，50对左右的增加率达90%，表明本研究中使用的样本大小足以进行统计分析(图一)。1C)。我们从公共数据库下载了CRC细胞系HCT 116中的H3K4me1(ENCODE，ENCFF557VIT)和BRD 4(GEO，GSM 3593876)芯片-seq数据，并计算了重要CRC肿瘤增强位点H3K4me1和BRD 4信号的RPM值。我们的分析表明，我们研究的H3K27ac峰与已发表的BRD 4和H3K4me1信号(Sup)有很好的相关性。无花果。S2B&C)。我们的RNA-Seq分析发现2226个上调的不同表达基因(DEGS)和1979年下调的DEGS在CRC肿瘤中的表达(图)。1D)。与TCGA数据相比，多个DEG重叠(SUP)。无花果。S2D)。有多个增强子的基因所占的比例(Sup)。无花果。S2E). MYC是众所周知的癌基因22结果发现，在63对肿瘤组织中，MYC的表达率为87.5%，是相应组织的2倍以上。H3K27ac轨道对其增强器显示为一个例子(图)。1E)。在邻近的自然组织中，MYC其增强子和ERNA上的H3K27ac信号与背景非常接近；在肿瘤组织中，MYC高表达，并伴有H3K27ac在其增强子和Erna表达上的升高(如图所示)。1E)。一项早期研究报告了多个CRC细胞株和少数CRC样本中的活性增强剂。33。两项研究的比较表明，我们在CRC中发现了11796种不同的主动促进剂，占总促进剂的32.4%。1F，G).
肿瘤变异增强子位点的鉴定
为了确定肿瘤中特异性的活性增强子，我们首先对所有标本的增强子进行了比较，发现与相应的相邻组织相比，某些组织的H3K27ac峰(小于2500)或变异增强子位点(VELS，小于500)的数目相对较少(附图)。S3A和B)。我们认为这可能是因为抽样问题。因为当我们使用随机的临床解剖组织进行实验时，有可能一些组织样本中只有很少的细胞，或者它们的大部分细胞实际上与它们相应的细胞非常相似。所以，我们在下面的统计分析中排除了它们。我们总共确定了6690个重要的Vels，包括5590个增益Vels和1100个失落的Vels(图1)。2A，补充数据3–5该管道在附图中显示。S3C。在14例和19例复发阈值下，95%的增益和丢失VELS具有统计学意义(q-数值<0.1，成对t-测试，本雅明-霍奇伯格修正；图。2B)。支持这些分析的可靠性，显著增益VELS在肿瘤中的H3K27ac水平高于本地组织，而在显著丢失的VELS中则相反(补充图1)。S3D和E)。同时，与增益Vels相关的基因在肿瘤组织中的表达高于自然组织，而缺失的Vel相关基因在肿瘤中的表达被广泛抑制；表达变化的幅度与每个基因的Vels数呈正相关(补充图)。S3F)。接近于IL20RA和FOXQ 1失去的藤蔓PPARGC1B如图所示。2C，补充图。S3G和H)。所鉴定的VELS可以很好地区分自然组织和肿瘤组织(图1)。2A)。人类疾病本体论和GO分析表明增益Vels的相关基因与CRC高度相关。二维空间和补充图。S3I)，而丢失的VELS与正常结肠功能有关(补充图)。S3J)。为了进一步评价H3K27ac或增强子信息在鉴别肿瘤和正常组织中的作用，我们利用基因表达信息、H3K27ac基因增强子信息和H3K4me3启动子信息对癌旁组织和癌旁组织进行聚类分析。两种基因表达或显著增强子均能很好地区分癌旁和肿瘤标本，而不同的H3K4me3峰则无明显区别(图一)。2E-G)，提示增强子信息对肿瘤的鉴别是有用的。
图2：CRC变异增强子基因座的鉴定。AH3K27ac信号的丢失和增益VELS在所有肿瘤和自然组织。B增益和丢失VELS所需的复发均有统计学意义(P<0.05)。在左侧的两条垂直虚线突出显示在达到显著比例的切断(0.95，黑色虚线)时增益和丢失Vels的复发，右侧的两条线分别突出显示肿瘤或自然增益组织和丢失VELS中复发最高的两条线。对于增益Vels，当复发达到14时，显着VELS的百分比为95.635%；对于丢失Vels，当复发达到19时，显着VELS的百分比为96.273。P.adj表示调整后的BH值。t-测试p-价值。这里使用了一个双面测试。C有代表性的H3K27ac增益Vel轨道IL20RA基因座。DGRAGVELS参与的人类疾病本体论(Version3.0.0)。红条代表CRC相关疾病，黑条代表其他疾病。E–G用基因表达对肿瘤和自然组织进行分类的PCA分析(E)，所有显著增强剂(F)，以及发起人(G)使用患者的rna-seq和芯片-seq数据识别的信息。
CRC子群的增强子特征
为了进一步研究CRC各亚组的增强子特征，我们采用了一种常用的方法，即crc肿瘤的共识分子亚型(CMS)分类。35，并将患者分为四个亚组(图1)。3A和B，补充图。S4B-C)。基于已鉴定的Vels和亚类特异性Vels的相关分析表明，CMS 2组的组织相关性最高，而CMS 4的相关性最低(图4)。3C和D，补充图。S5)，这意味着CMS 4可能比其他的异构性更强。有趣的是，在比较四个亚组中的促进剂时，我们发现CMS 2的活性增强子、显著增益Vels和比增益Vels的数量最多(图1)。3E-G，补充图。S6A)。CMS 2中增益VELS的平均H3K27ac信号也高于其他三个信号(图1)。3F)。而这四组个体间的增益Vels值以及H3K27ac在基因组中的相关性均无显着性差异(附图)。S6B-D)。上述研究表明，CMS 2基团比其他基团更具有同质性，并且具有更多的活性增强子，这可能是它的一个新的特征。
图3：CMS亚群增强子的特征。A四个CMS子组成员的病人标识符。B用R包CMS呼叫机对CRC样本进行一致分子亚型(CMS)分类。CCMS1-4亚组肿瘤标本增益Vels区H3K27ac信号的相关性。用Spearman相关系数计算相关系数。D每个CMS亚组增益VELS所需的重现性以满足统计显着性(p.=‘class 5’>在不同的断线时<0.05).虚线突出了增益Vels在达到相当百分比的截断(0.9，黑色虚线)时的重现性。当复发达到切断时，CMS1=93.942%，CMS 2=93.615%，CMS 3=95.741%，CMS 4=93.548%。P.adj表示调整后的BH值。t-测试p-价值。这里使用了一个双面测试。E4个CMS亚组的亚组显著增益VELL数。F4个CMS亚组增益Vels区域的平均H3K27ac信号(RPM)。G每个CMS的亚组特异性增益VELL数。当一个CMS组中的一个Vel的平均RPM比其他三个组高1.5倍时，鉴定出其亚组特异性增益VELs。HCMS 2特异性增益VELL与基因本体(生物过程)和路径数据库(Reactome)中注释的基因集有很大的重叠，从而对目标基因进行功能注释。I归一化H3K27ac的元轨道赛尔和DPEP 14个CMS亚组的基因位点。
然后，我们研究了Vel相关基因的功能，并在每个亚组中鉴定了特异激活的增强子和基因。显示了每一组的一些代表性增强子和基因(补充图)。S6E-L)。对于CMS 2，我们发现它的特异性增益-Vel相关基因主要参与WNT信号传递、细胞迁移和脂类代谢过程。3H，补充图。S6M)。预期激活Wnt信号和增强细胞迁移，因为APC是crc中最常见的突变基因之一，细胞迁移是癌细胞的一个特征。36,37。脂代谢与CRC有关，但不同人群的结果不明确。38,39,40。我们的分析表明，脂代谢平衡失调可能与某些CRC亚组有关。一些cms 2亚组的Vel及其相关基因，包括那些参与脂质代谢的，例如赛尔和DPEP 1(无花果)3I，补充图。S7).
变异超增强子基因座的分析与验证
癌基因相关超促进剂的激活是肿瘤的重要特征之一。6。我们采用类似的方法来鉴定肿瘤组织中的变异型超增强子位点(Vsel)，包括334个增益vsels和121个缺失vsels，其中有几个已知的致癌靶点，如：MYC, VEGFA，和利夫(无花果)4A，补充图。S8A和B，补充数据6&7)。H3K27ac水平对VSEL的增益有显着性提高，而在丢失VSEL上则如预期的那样降低(图1)。4B和C)。如预期的那样，与增益VSEL相关的基因表达高于与丢失VSELs相关的基因(补充图)。S8c)。我们利用VSELS上的H3K27ac值将CRC患者与正常肠组织聚为一组(补充图)。S8D和E)。该分析区分了本地和肿瘤组织，并将CRC患者分为三个亚组(补充图)。S8D和E)。结果表明，VSELs可能有助于CRC的分类。我们比较了这两种分类方法，发现大多数CMS2组样本都是基于VSELS(补充图)划分为G1亚组的。S8F)，支持我们先前的结论，即CMS2组比其他组更同质。
图4：肿瘤特异性超级促进剂在大肠癌中的作用。A与顶级超级促进剂(SE)相关的基因按复发排序。红点代表肿瘤特异性SE基因，蓝点代表天然组织特异性SE基因。前10位肿瘤和本地组织特异性基因被列出。B–C增益VSELs区域的平均H3K27ac信号(RPM)B)和丢失的VSEL(C)在肿瘤和自然组织中。D亚标准化H3K27ac在IER 3基因位点上的轨迹。顶部的绿色轨迹代表HCT 116中的H3K27ac信号，底部的黑色和灰色线分别代表肿瘤和自然组织的平均信号。粉红色线指示dCas9-KRAB sgRNAs的靶位置。E显示相对mRNA水平的条形图利夫, SLC7A5, CYP2S1, PHF 19, RNF 43, CEBPB, TBC1D16, TNFRSF6B, VEGFA，和IER 3对照组和sgRNA组(n=3)。以EGFP为靶点的sgRNA作为对照进行了实验研究。*p < 0.05. FTranswell法检测稳定转染增强子dCas9-KRABsgRNAs的HCT 116细胞株。5E (n=3)。G–I用HCT 116稳定表达sgRNAs的细胞在裸鼠体内进行移植实验。这些肿瘤被描绘成(G)，并显示其体积和重量(H&I)。n=9适用于所有群体。数据以平均值±扫描电镜表示。统计分析是用一名双面学生进行的。t测试一下。p值在相应的项目上标记。
为了验证已鉴定的VSELs的功能，我们将CRC组织的H3K27ac型与HCT 116细胞的VSEL进行了比较。选择hct 116中出现的增益vsels，利用dCas9-krab系统抑制增强子的活性。41。由于一个SE通常覆盖一个相对较大的染色质区域，我们为每个SE设计了多个sgRNAs，并在HCT 116、RKO或SW 620(三个CRC细胞系)中获得了稳定的细胞系(图)。4D，补充图。中9，补充数据8)。我们共分析了11株肿瘤细胞，其中10例在多个细胞系中发现了其近端基因的表达，其中包括：IER 3, 利夫, SLC7A5、CYP2S1、PHF 19、RNF 43、CEBPB、TBC1D16、TNFRSF6B、和VEGFA(无花果)4A和E，补充图。中9)。对某些增强子来说，多个近亲基因的表达受到抑制(Sup)。无花果。中9)。我们还测定了一些基因座上的h3k27ac水平，发现dCas9-krab/sgRNA有效地抑制了h3k27ac对h3k27ac的增强子。CEBPE, CYP2S1, IER 3, PHF 19, RNF 43，和TBC1D16(补充图。S10A)。并与其在CRC患者组织中的表达进行比较。S10B)，我们的数据表明，上述SES对相应基因的表达有调节作用。此外，我们还建立了稳定的HCT 116抑制促进剂细胞系，并对其增殖和迁移能力进行了研究。细胞增殖和细胞周期差异不显著(附图)。S11A和B)然而，相当多的细胞系在多个细胞系中表现出较弱的迁移能力，包括PHF 19，LIF，SLC7A5，CYP2S1，RNF 43，VEGFA，和TBC1D16(无花果)4F，补充图。S11C-F)。为了进一步研究上述基因在大肠癌中的作用，我们用稳定的HCT 116细胞进行了异种移植实验，结果表明PHF 19和TBC1D16 SES的抑制对肿瘤的生长有明显的抑制作用，并证实了靶基因在随机选择的肿瘤中的表达。4G-I，补充图。S11G-K)。当SLC7A5SE受到抑制时，肿瘤生长也有下降的趋势，但差异不显著(图5)。4G-I).
功能转录因子的预测与验证
为了探讨潜在转录因子(TFs)在CRC发病中的重要作用，利用HOMER软件对VELS的DNA序列进行了预测。得不偿失的名次被列出(图一)。5A和补充图。S12A和B)。提出了核心调节回路的假设，以识别细胞中的核心TFs。42,43。为了提高TF的预测能力，我们利用该方法对CRC组织中的关键TFs进行了识别(图1)。5B&C，补充图。S12C)。ASCL 2被预测为CRC特异性TF，得分最高(如图所示)。5C)。H3K27ACASCL 2增强剂在肿瘤中大大增加(补充图)。S12D)，并提出了基于TCGA数据的基因表达分析方法。ASCL 2在结直肠癌中高表达(附图)。S12E)。这些表明ASCL 2是crc中的一个关键TF，这与以前的出版物是一致的。44,45,46。由于ASCL 2已经在CRC中有了特征，我们没有进一步研究它的作用。
图5：CRC功能转录因子的预测。A荷马基序分析确定肿瘤增益区无核小体区(NFRs)内富集的DNA基序。B转录因子热图按预测的核心调节回路(CRC)的总程度(肿瘤-自然组织)排列。排在前30位的肿瘤和本土特异性TFs被列出。C散点图显示了在图5B中列出的特异性TFs的总程度(肿瘤-自然组织)和表达的FC(肿瘤/自然组织)。蓝点代表前30个肿瘤特异性TFs，红色点代表前30个本地特异性TFs。圆圈大小表示TFs在其特定组织中的平均表达(FPKM)。D, E流式细胞术检测HCT 116细胞株KLF 3击倒。用Westernblotting法测定KLF 3。p-值=1.06E−4(sgKLF3.1)和1.55E−4(sgKLF3.2)。n数据以平均值±扫描电镜表示。F–H KLF 3以sgRNA稳定敲除HCT 116细胞于裸鼠体内(10^6细胞梨小鼠)，n=10)。图为肿瘤(F)和肿瘤生长曲线(G)和重量(H)平均(±SEM)。P-sgKLF3.1和KLF3.2的G值分别为0.0261和0.0296H对于sgKLF3.1和KLF3.2，分别为0.0256和0.0355。统计分析是用一名双面学生进行的。t测试一下。*p < 0.05, **p < 0.01.
结合上述结果和已发表的文献，我们选取了大约10个TFs进行实验验证。不幸的是，某些基因在选定的细胞系中表达较低，或者基因敲除实验对某些基因无效。最终，我们只有4个基因被成功地敲除，包括KLF 3和麦福克两部小说马兹和RUNX 1，最近报告的两个信托基金在儿童权利委员会中运作，但没有很好的特征46,47,48,49。计算每个患者所选择的TFs的意义(补充图)。S12F)。在细胞增殖试验中，这些基因的敲除不影响细胞增殖；KLF 3，Maz，和RUNX 1被siRNAs击倒，或KLF 3CRISPR/sgRNAs击倒细胞，抑制细胞迁移，但不能麦福克(无花果)5D和E，补充图。S13, S14A和B)。我们的结果确认KLF 3参与了CRC，并证实了RUNX 1和Maz的作用。在核心调节回路分析中发现MAFK位于自然组织的一侧(如图所示)。5B)，我们的实验结果没有发现它在增殖或迁移中的作用，这表明麦福克虽然在DNA基序分析中预测到了它，但它并不参与CRC。进一步确认KLF 3，我们在hct 15和rko细胞中用crispr/sgRNAs将其打倒，并观察到类似的结果(补充图1)。S14C-F)。然后进行异种移植试验。KLF 3-HCT 116缺乏，结果表明：KLF 3击倒抑制小鼠肿瘤生长(图一)。5F-H).
