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人小肠神经内分泌肿瘤的独立体细胞进化

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发表时间:2021-11-15 10:14作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

小肠神经内分泌肿瘤(SI-net)是小肠最常见的肿瘤,常表现出一种奇怪的多灶表型,多个肿瘤聚集在一个有限的肠段内。Si-net也显示出一种不寻常的缺乏驱动突变,可以解释肿瘤的开始和转移扩散.作为多焦点SI网病变基础的进化轨迹可以提供对潜在肿瘤生物学的深入了解,但这个问题仍未解决。在此,我们测定了11例多灶性SI-网患者61例肿瘤和转移的全基因组序列,为阐明单个患者内肿瘤之间的系统发育关系提供了依据。个体内比较显示,在取样的肠道病变中缺乏共同的体细胞单核苷酸变异,这支持了一个独立的克隆来源。此外,在3例患者中,有2例独立肿瘤发生转移。我们的结论是,主要的多焦点的SI-网状结构通常由克隆独立的细胞产生,这表明这是一个致癌的局部因素所致。

导言

癌症被认为是一个包括随机致癌突变、选择和克隆扩展周期的进化过程。1。在大多数恶性上皮性肿瘤(癌)中,一个单一的原发肿瘤通常会形成,然后是随着细胞从肿瘤中扩散而产生的转移。更罕见的是,癌症反而表现出多焦点性,即原发部位多个单独的肿瘤,这可能是由于易受生殖细胞变异、局部致突变或肿瘤诱发突变克隆的局部扩散或扩展所致。2,3.

特别令人感兴趣的是小肠神经内分泌肿瘤(SI-Nets),这是最常见的小肠肿瘤,其中约50%的病例表现出一种引人注目的多焦点表型,通常涉及10个或更多形态相同的肿瘤聚集在一个有限的肠段,通常集中于区域淋巴结转移。4,5。据报道,硅网的发病率为每100 000人中有1.2人。5在诊断时常出现远处转移,从而妨碍治疗。4,6...然而,ssi-net的体细胞突变负担较低,而且不存在异常的体细胞驱动突变。7,8,9。因此,对潜在的致瘤机制了解甚少,缺乏可操作的基因药物靶点。

在SI-net中控制多个肠道肿瘤和转移的进化关系可以让我们洞察潜在的生物学,但是早期的确定这一点的努力已经产生了相互矛盾的结果。10,11。对多灶性SI-网原发肿瘤的拷贝数改变(Cna)的研究发现,染色体18(Chr 18)的缺失是最常见的cna,它会影响患者不同样本的染色体同源性。12,与独立的克隆来源或迟失的Chr 18相适应。另一种方法是,提出用多焦点的SI-net来表示来自区域淋巴结的转移,这与肠道肿瘤的有限的空间分布是一致的。13。增加挑战的是低突变负担,这减少了外显子遗传标记的数量。

在这项工作中,我们对来自11名患者的61例不同肠道肿瘤和相邻转移进行了全基因组测序(WGS),使我们能够最终确定单个个体内多灶性SI-网病变的进化轨迹。我们的结论是,初级多焦点的SI-网状结构通常是由克隆独立的前驱体产生的.此外,尽管克隆独立,我们发现一个以上的肠道病变可以引起转移在一个单一的SI网病人。

结果

多焦点SI-网的演化轨迹

我们最初对六个肠道肿瘤,三个相邻的淋巴结转移,两个腹膜转移和一个疑似SI-NET患者(患者1)的正常血液样本进行了全基因组测序(WGS)。1A)。所有病变均显示典型的SI-网形态,所建立的诊断性SI-net标记物呈阳性染色(附图)。1)。样品的排序平均覆盖范围为34.5-43.1×(补充数据)1)。接着是体细胞突变呼叫,使用严格的过滤器,包括严格的种群变异去除,以避免在系统发育分析中出现假阳性。由此产生的全基因组单核苷酸变异(Snv)负担从353个到1,749个不等(每mb 0.13-0.62);补充数据1).

图1:单个SI网患者的11个原发肿瘤和转移瘤的全基因组测序支持独立的克隆进化。
figure1

a1例患者(患者1)小肠切片,其中包括6个原发肿瘤(A-F)、3个淋巴结转移(G-I)和2个腹膜转移(J-K)。b基于全基因组测序的共享体细胞SNV的配对分析。原发性肿瘤C和五个转移瘤共有667个突变。给出了一个最大简约进化树,每个分支的SNV数由标度标记给出。在.CDKN1B,一个已知的司机事件,被指示。对所有主要分支的引导支持>=98%。c提出的模型,其中所有转移来源于一个单一的原发性肿瘤,其中所有的原发是不相关的体细胞进化。MET,转移;SNV,单核苷酸变异。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们确定了样本之间成对共享的体细胞SNV。令人惊讶的是,一个单一的原发肿瘤(表示C)和所有五个转移瘤(G-K)之间共有667个SNV,而其他样本之间基本上缺乏重叠突变(图一)。1B)。因此,这些结果与肠道肿瘤的共同克隆来源不相容,在晚期癌症的情况下,预计会导致数百到数千个共同的基因组突变。相反,系统发育分析支持肠道肿瘤是独立发展的,一个单一的、集中的肿瘤首先转移到淋巴结,然后再转移到腹膜(图一)。1B,c).

为了验证最初的发现,我们分析了来自10个SI网患者的另外50个肿瘤,再加上匹配的正常血液样本,使用WGS在29.8~45.0×覆盖范围内(患者2-11;图1)。2;补充数据1)。大部分的材料(病人3-11)是以前取样的肿瘤储存在一个局部生物库。在3~11例肠道肿瘤中,每个患者至少有一个淋巴结转移,其中3例为肝转移。其中4例为宏观正常小肠粘膜标本。选择具有足够的肿瘤材料和纯度的标本,并对所有肿瘤标本进行SI-Net标记染色(补充图2-5)。一个肿瘤的突变负担低于预期(143 Snv),原因是样品纯度低,而其他肿瘤的突变负担介于411到3 390 snv之间(每mb 0.15到1.21;补充数据)。1)。相比较而言,在正常粘膜标本中,有11到40种SNV被称为SNV,在这些样本中不存在广泛的克隆性突变,这支持了体细胞突变呼叫具有很高的特异性。

图2:来自另外10例SI-NET患者的50例原发肿瘤和转移的全基因组测序证实了独立的克隆来源。
figure2

a1例(患者2)小肠切片,原发肿瘤(A-K)11例,淋巴结转移(L)1例。白色标签显示所有已识别的肿瘤,而字母则显示具有足够纯度和肿瘤材料的测序样本。b2.原发性肿瘤G和转移共有1,214种突变。已知CDKN1B驱动事件在系统发育树中表示(每个分支中的SNV数由标度标记来表示)。c拟议模型。dl类似于面板b,根据另外9名患者的档案资料,其中还包括肝转移瘤和正常粘膜样本。对系统发育树中所有主要分支的自举支持率为100%。MET转移,SNV单核苷酸变异。源数据作为源数据文件提供。

与病人1的结果类似,在所有另外10名患者中,肠道肿瘤之间基本上没有共同的体细胞突变(图1)。2)。与之形成对比的是,单个转移瘤与特异性肠肿瘤之间存在较强的SNV重叠,除一组外,其范围为82~2053和290以上。例如,在病人2中,11例中单个肠肿瘤(G)与相邻淋巴结转移有显著的相关性(L;1,214例共有SNVS;图1)。2B)。与患者1相似,转移性原发肿瘤位于切除部位(图1)。2A,c)。其余病人样本缺乏详细的位置数据,因为这些数据来自档案材料。

单个转移瘤仅与单个原发肿瘤有可靠的重叠,而在3例(患者6、7和10例)中,我们发现两种不同的原发肿瘤已经转移,导致了独立的淋巴结或肝转移(图6、7和10)。2G,h,k)。考虑到原发性肿瘤缺乏共同的进化轨迹,这就支持了转移特性的获取在多焦点SI-net中并不罕见。在病人8中,样本系统发育提示来自单个原发性肿瘤(A)的两个独立的转移事件,一个早期的事件导致一个肝转移(D),一个后来的事件导致一个淋巴结转移(图C;图)。2I)。在原发和转移中,共享SNV的变异等位基因频率(VAF)通常高于其他变异,这与转移事件后持续的体细胞进化和亚克隆扩展相一致(补充图)。6)。在单个病例(病人9)中,淋巴结转移不能与两个可用的肠道肿瘤中的任何一个相关联,这很可能是由肠道病变的不完全取样所解释的(图一)。2J).

例如,由于未能在正常血液中的特定位置检测到生殖细胞SNPs,可能会出现虚假的共享体细胞SNV,因为这一数据对患者中的所有样本都是通用的。然而,除了主要的遗传关系之外,只有少数的普通SNV被观察到(如图所示)。1B还有无花果。2B,d-l),其中一些可能因人工检查(补充数据)而被视为假阳性而被驳回。2)。在病人5中,另有一个肿瘤(D)与转移瘤(F)共有8个可信的SNV(图)。2F)。这种重叠增加到66当高置信度变异体被白化,以放松呼唤其他样本,允许更敏感地检测亚克隆共享SNV(补充图)。7)。这些变异在转移中以低VAF的形式存在,而在肿瘤中有正常的VAF,与样品处理过程中的污染相一致,或者可能是转移到两个肿瘤的同一个淋巴结,而D(补充图)的贡献很小。8)。在病人9中还发现了在肠道肿瘤(A)和淋巴结转移(C)之间共有的13个低VAF变异体,此外,在这两个样本中都发现了一个单一的高置信度变异体(补充图)。9)。在患者2中,主要转移原发肿瘤(G)与相邻肿瘤(F,5mm间隔,补充图)共有8个SNV。10)和转移(L)。2B)。所有三个样本均有正常的VAF分布,反对污染(附图)。11(除一项外,其余均通过手动检查(补充资料)2)。这种大小的重叠太小,不足以代表晚发癌症的共同克隆起源,而且很可能是由在生物体发育早期建立的特定血统的体细胞突变来解释的。14.

驱动突变和突变特征

病人的中位年龄为76岁,由68岁至81岁不等(补充表)1)。因此,观察到的负担和成对重叠变异体的数量大致相当于与正常人神经元相似的突变率,估计每年累积的变异量为23-40 snv/年。15(无花果)3)。突变特征的分析确实支持宇宙特征sbs 5的主要贡献,这是一种普遍存在的与老化相关的突变过程,即sbs 40,它与sbs 5密切相关。16(无花果)3)。所观察到的标记载量的变异性可能在一定程度上是方法学上的,因为样本的三核苷酸替换剖面实际上在整个队列中非常相似(补充图)。12)。患者的负担变异性在很大程度上是由可变样本纯度所解释的(补充图)。13)。这些结果证实了SI-NET的突变安静性质.

图3:11例患者潜在驱动突变和突变特征概述。
figure3

所有癌症基因普查(CGC)基因与非同义突变在多个样本显示。突变特征负载,即相对贡献,指宇宙v3定义。16并主要由密切相关的签名SBS 5和SBS 40(见“补充图”)。16“一个完整的签名传说)。系统发育关系以前从体细胞SNVS(图1)推断。1, 2)在底部表示。该图中的躯体SNV负担、潜在的驱动突变和突变特征负荷是用与系统发育分析相比不那么严格的种群变异过滤来确定的(见“方法”)。CGC癌基因普查,MET转移,SNV单核苷酸变异,5 mC 5-甲基胞嘧啶,DSB双链断裂。源数据作为源数据文件提供。

编码基因中潜在的体细胞驱动突变的分析反映了早期发表的结果,其中很少有变异CDKN1B作为主要的反复事件出现(八个样本,六个独立事件;图。3;补充数据3)7。在病人1中,相同的CDKN1B移行细胞在两个转移瘤(G,H)中发生,其模式与推测的系统发育一致(图1)。1B,c)。在病人2中,同样的CDKN1B在转移原发灶(G)和转移灶(L)中发现移行细胞,因此再次与系统发育一致,而1例非转移原发灶携带CDKN1B停止增益变体(图1.2B,c)。病人3和7CDKN1B转移性原发肿瘤的变异(停止增益和剪接供体)在相应的转移瘤中缺失(如图所示)。2D,H)。这些变异是大量的私人变异存在于相对较低的VAF在原发部位,并且可能是在转移后出现的(补充图5)。1415)。其他突变癌症基因普查17基因包括MUC 16(五个样本,四个独立事件),这是一种常见的假阳性基因,编码人类第二大蛋白质。18, KMT2C(五个样本,三个独立事件),FBLN 2(两个独立事件)ARID1B(两个独立事件;图。3). TERT启动子突变,是几种癌症类型中常见的非编码驱动程序事件。19,20,以及其他癌症基因的显著上游突变(补充图)。16)。因此,与其他报告一致的是,没有明显的驱动程序突变。CDKN1B,这不是转移所必需的。

拷贝数更改

对体细胞CNA的分析进一步支持了从体细胞SNVS推断的系统发育关系(图1)。4A)。患者1(C)的转移瘤在Chr 11上有明显的节段性缺失,在所有转移灶(G-K)中均有发现,而其他肠肿瘤则无明显节段丢失。同样,病人2(G)的转移瘤在chr 13(大量聚集的CNA,在两种状态之间振荡)上呈色原性。21,补充图。17,这种复杂的模式反映在相应的淋巴结转移(L)(图1)。4B)。患者2和7的chr 11和chr 20分别有改变,在原发肿瘤中存在,但在相关转移中不存在,因此可能发生在转移后。

图4:体细胞拷贝数的改变与从体细胞SNV推断的系统发生一致。
figure4

a所有样本的体细胞CNA谱(蓝色=缺失,红色=扩增;片段<25 kb是为了可视化目的排除的)。系统发育关系以前从体细胞SNVS(图1)推断。1, 2)在右边表示。整个染色体的丢失和增加都是基于种系SNPs(见附图所示)而分阶段进行的。18),两个染色体同源性以绿色和橙色表示,可能的双等位事件以黄色表示。b2例患者chr 13上嗜铬菌病的详细表现,主要表现为转移原发灶(G)和转移灶(L)。c例chr 18缺失在患者1。MET,转移;Chr,染色体。源数据作为源数据文件提供。

大约70-75%的SI-网状网已经被证明隐藏了半透明的chr 18的损失。22因此,我们在11例患者中的9例和61例肿瘤标本中的32例中观察到了Chr 18的丢失。然而,基于生殖系单核苷酸多态性(SNPs)的chr 18缺失的分期显示,基于snv的被认为无关的肿瘤常常经历不同的染色体同源性缺失,而相关肿瘤总是表现出相同的同源性缺失(P=1.2×10−4,相关单等位基因病例的二项式检验;图1。4A,c和补充图。18)。其他整个染色体事件(4、5、14和20)显示出与已建立的系统发育相似的一致/不协调的染色体同源性丢失或增益的模式(图1)。4A)。在其他反复发生的事件中,如前面所示,chr 11和chr 13上的片段性缺失。7,23,24。没有一种独特的CNA以与SNV为基础的进化树相矛盾的方式共享(图一)。4A).

据我们所知,以前在SI-net中没有报道过的嗜铬菌病,进一步得到了体细胞结构变化分析的支持。在27例框架内结构事件中,没有一例是明显的驱动因素,9例为患者2中chr 13上的染色体内染色体改变,它们共同存在于原发肿瘤和CNA所显示的转移灶之间,以在该染色体上隐匿嗜铬菌(G和L;补充图1)。19).

讨论

我们发现,在多焦点的SI-网中,肿瘤的发展是在多个克隆独立的细胞中开始的,导致了一组与体细胞遗传进化无关的肿瘤。此外,我们还遇到了两个独立的肠道肿瘤发生转移的案例,每一个都会引起不同的肝脏或淋巴结转移。虽然我们发现了目前流行的通过淋巴结向远处推进的模式(病人1),但我们的数据也表明,淋巴结和远处转移有时可能来自独立的种子事件(病人8),正如先前在结直肠癌中报道的那样。25。在后一种情况下,通过未发现的、未取样的或倒退的淋巴结转移,向远处的地点播种可能仍在进行。综上所述,我们的观察表明,转移特性的获取在多焦点SI-Net中并不少见,并强调了彻底切除所有肠道病变的重要性。以前对配对的单肠和转移样本进行的外显子分析已经产生了令人费解的结果,其遗传重叠的程度有很大差异,在某些情况下根本没有重叠。7,24,正如本研究中的一位患者所看到的,我们的结果表明,在这种情况下,没有对相关的原发肿瘤进行取样。

多灶性肠胰腺癌是遗传性肿瘤综合征的典型表现,如男性-1型和家族性腺瘤性息肉病(FAP).队列研究支持一些SI-网可能有一个可遗传的成分。26,27,并建议在家族性病例中优先发生多焦点性。28,29。然而,在所有si-net中,多焦点性是常见的。4,6,关键的临床参数,如生存率或诊断年龄,对于遗传性癌症来说通常较低,在有或没有多焦点的患者中是相似的。4,6。观察到SI-net中最常发生的体细胞遗传事件,即半共体chr 18缺失,可能会影响同一患者的母系和父系染色体同源性,这一观察表明,导致chr 18生殖细胞变异的原因在于杂合性的丧失。12。而肿瘤抑制因子DCCSmad 4已通过单倍不足被提名为这一事件的可能驱动因素,需要做更多的工作才能充分了解chr 18在si-net中的作用。30,31。此外,与细菌引起的胃肠道肿瘤形成鲜明对比的是,SI-net只影响有限的肠段.

鉴于普遍缺乏公认的基因驱动因素,并且根据我们显示克隆独立性的结果,我们建议今后的研究可以集中在可能导致多焦点SI-net出现的致癌局部因素上。这些因素理论上可以包括通过表观遗传事件或血液中也存在的早期遗传事件来启动某些EC细胞系的胚胎启动,或者是局部环境因素。虽然这些因素仍然难以确定,但可以指出,SI-net来源于上皮肠色素细胞(EC-细胞),这些细胞通过旁分泌和内分泌5-羟色胺分泌、突触样与肠神经系统的联系以及受体介导的对腔内内容的营养感应与周围环境发生内在的相互作用。32支持局部肿瘤环境变化的可能贡献。进一步的研究直接解决这类改变可能会进一步揭示克隆独立的多灶性肿瘤在SI-网络中的出现。


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