学习设计 PrE 0505，第二阶段，单臂，多中心研究，登记的病人以前没有治疗，不可切除的MPM( NCT 02899195 ；扩展数据图。 1 )。患者每3周接受一次硬脑膜瘤抗体(固定剂量为1,120毫克静脉滴注)，并以标准剂量与培美曲塞和顺铂联合使用，最长6个周期。对于肾小球滤过率为≥45 ml的患者，在第1周期中允许用卡铂代替顺铂。 −1 ≤60 ml min −1 ，对于另一例有记录的顺铂禁忌症患者(例如听力损失)，或由于顺铂在治疗期间的毒性。同时治疗后有稳定或有反应的肿瘤的患者从第一次研究治疗开始，继续使用杜鲁伐单抗，最长持续时间为1年。在前6名和15名患者登记后进行了一项协议定义的安全审查。在安全运行期间，预先规定的剂量限制毒性包括任何免疫介导的4级或更高级别的不良事件，或任何未解决的、免疫介导的3级或3级以上的不良事件。
研究的主要终点是总体生存(OS)，定义为从学习登记到任何原因死亡的时间。最后知道活着的病人在他们最后一次随访的日期受到审查。我们假设一个无效的假设，即中位OS与化疗免疫治疗的OS相等于单用培美曲塞/顺铂治疗12个月的OS(历史对照)。共有55个病人(50名符合条件)的32项事件的计划注册，允许90%的功率在0.058-0.037的OS危险率降低37%，基于Wald测试测井失效率参数，使用单面I型错误率为10%。这相当于操作系统中位数从12个月提高到19个月的58%。 4 。次要终点包括PFS、最佳客观反应和毒性( 方法 )。PFS的定义是从学习登记到有记录的疾病进展或因任何原因死亡的时间，以先发生者为准。没有经历过感兴趣的事件的病人在他们最后一次活着并且没有进展的那一天受到审查。探索的终点包括研究对化学免疫疗法反应的基因组和免疫学基础；为此，我们进行了整个外显子测序(Wes)，并结合了全基因组范围的焦点和大规模拷贝数畸变分析和序列反褶积( 方法 )。同时，我们评估了肿瘤内T细胞储备和功能新抗原特异性T细胞反应( 方法 和扩展的数据图。 1 和 2 ).
参加者 2017年6月12日至2018年6月21日，PrE 0505在美国15个学术和社区癌症中心登记了55名患者。符合条件的患者为18岁或18岁以上，其组织学上未选定的MPM被认为是不可手术的，东方合作肿瘤学组(ECOG)的表现状态评分为0或1，有足够的器官功能，包括≥45毫升的功能。 −1 对胸膜间皮瘤采用疗效评价标准(RECIST)1.1改良的可测量疾病 23 ,24 。主要排除标准是免疫缺陷，持续的全身免疫抑制治疗，积极的自身免疫或传染病和临床上有意义的并发癌症。表中概述了人口统计和疾病特征。 1 中位年龄68岁(35~83岁)，多数为男性(82%)，75%为上皮样组织学。通过研究人员评估继续受益的患者( n (20)在放射学进展过程中被允许继续治疗。
功效分析 所有患者都包括在符合条件的人群中进行疗效分析。中位随访时间为24.2个月，共发生33起死亡事件.所有患者的OS中位数分别为20.4个月(95%可信区间：13.0-28.5，80%CI：15.1~27.9)，明显长于12个月的历史对照(单侧)。 P =0.0014；图1。 1A )，观察到的危险率为0.034。6个月、12个月和24个月存活患者的估计百分比分别为87.2%、70.4%和44.2%。PFS中位数为6.7个月(95%CI：6.1~8.4，80%CI：6.3~8.2；图1)。 1B )。在6个月、12个月和24个月时，存活和无进展患者的估计百分比分别为67.3%、18.2%和6.1%。客观有效率(ORR)为56.4%(95%CI：42.3~69.7%，80%CI：46.8~65.5%)。无完全缓解(CR)，部分缓解(PR)31例，稳定型(SD)20例。1例因缺乏后续疾病评估而无法评估疗效，3例患者以进展性疾病(PD)为最佳疗效(图1)。 1C，d )。在非预定义的亚组分析中，组织学观察到ORR、PFS和OS有显着性差异。上皮样肿瘤患者的ORR高于非上皮样肿瘤患者(分别为65.9%和28.6%)。 P =0.03)。同样，上皮样MPM患者的OS中位数明显延长(24.3个月对9.2个月，危险比(HR)=0.27，95%CI：0.13-0.57， P < 0.001; Fig. 1E )和PFS(8.2个月对4.9个月，HR=0.30，95%CI：0.16-0.58， P < 0.001; Fig. 1F )与非上皮样MPM组比较。
图1：无法切除的MPM化疗免疫治疗的结果。 a 、卡普兰-梅耶尔曲线(P<0.05)，用杜鲁伐单抗和铂联合培美曲塞治疗(P<0.01)。 n =55)。单面 P 基于Wald测试测井失效率参数的值为 P =0.0014，表明操作系统明显长于12个月的历史控制。 b 、卡普兰-梅耶曲线(P<0.01)。 n =55)。 c ，根据肿瘤从基线减少的最大百分比，用组织学亚型对靶点病变进行最佳改变的瀑布图(1)。 n =53例)。2例未对靶病灶进行随访测量的患者(一例疗效最佳，另一例有最佳疗效PD)被排除在外。 d 、蜘蛛图显示靶点病变随时间的变化( n 值得注意的是，在分析时，有4名患者继续有反应或SD。2例未对靶病灶进行随访测量的患者(一例疗效最佳，另一例有最佳疗效PD)被排除在外。 e ，根据组织学原理，系统的Kaplan-Meier曲线； P 值的显着性水平设置为0.05。 f ，根据组织学，PFS的Kaplan-Meier曲线； P 值的显着性水平设置为0.05。上皮样细胞。
源数据
安全 经过初步安全性分析，该研究纳入了55名患者的全部计划队列。最常见的治疗-紧急不良事件(TEAES)主要是低度，包括疲劳(67%)，恶心(56%)和贫血(56%)(扩展数据图)。 3 )。3级以上TEAE发生率为65.5%，包括贫血(20%)、低钠血症(9%)、疲劳(7%)、白细胞减少(5%)、血小板减少(5%)和高血压(5%)，其他3级或以上TEAE发生率均低于5%。未观察到5级TEAE。也没有特别感兴趣的意外不良事件(被定义为具有潜在免疫介导机制的不良事件)，而那些确实发生在2级或更低级别的事件(扩展数据图)。 3 )。在治疗方面，29例(53%)患者从治疗开始就接受了以顺铂为基础的化疗，其余患者开始使用卡铂，而顺铂组有7例在同时治疗期间改用卡铂。在PFS或OS方面没有统计学上的显着性差异，在此基础上接受了铂制剂(扩展数据图)。 3 )。所有登记在本研究中的患者至少接受了一个疗程的药物治疗，87.3%(48/55)的患者完成了6个周期的同时治疗。10例(18.2%)上皮样MPM患者完成了1年的研究治疗，5例(9.1%)患者因毒性而停止治疗。顺铂组(75~100次)、培美曲赛组(75~102次)和杜洛巴组(100%)的剂量强度中位数分别为100%和100%。29例顺铂患者中有2例(7%)因毒性而减少了顺铂的剂量，33例患者中有4例(12%)因毒性而减少了卡铂的剂量。1例(2%)患者因中毒而接受培美曲塞的剂量减少，而没有一例患者因毒性而接受杜鲁伐单抗的剂量减少(扩展数据如图所示)。 1 ).
基因组和免疫学探索性分析 如先前所示 17 ，这一队列中的MPM含有较低的TMB，有些肿瘤在DNA损伤修复基因的突变中含有高于预期的TMB(图一)。 2 、扩展数据图。 4 和补充表 1 –3 )。尽管认为tmb可能无法预测mpm对免疫治疗的反应，但考虑到低的突变负担，我们发现放射免疫治疗患者的肿瘤比无反应的肿瘤具有更高的非同义错义突变负担和更多的克隆突变。 P =0.086和 P 分别=0.072；扩展数据图。 5 和补充表 4 )，尤其是上皮样组织( P =0.051和 P 分别=0.025；扩展数据图。 5 和补充表 4 )。与上述结果相一致，在无反应的上皮样肿瘤中发现了一个反映亚克隆突变的APOBEC突变特征。 P =0.031；图1。 2 和补充表 4 )。为了将这些发现与tmb在预测标准护理治疗与化学免疫治疗的反应方面的潜在作用联系起来，我们分析了来自癌症基因组图谱(Tcga)的82例MPM肿瘤的肿瘤wes数据，该数据早于免疫检查点阻断的时代。在TCGAMPM队列中，TMB-低肿瘤(TMB小于或等于队列中的第二层； 方法 )显示PFS时间较长的趋势不明显，提示高TMB与PrE 0505队列中的临床反应之间的关系可能是由durvalumab驱动的。 方法 以及扩展数据图。 6 )。在PrE 0505队列中，观察到在达到12个月或更长时间的OS的患者中，染色质调节基因的突变有增加的趋势( P =0.063)。
图2：化疗免疫治疗间皮瘤的基因组情况。 X线反应患者的MPM存在较高数量的非同义错义序列突变( n =40 mpm肿瘤；平均每外显子有23对18突变用于应答和无反应肿瘤；mann-Whitney P =0.086)。对治疗有反应的上皮样MPM含有更多的克隆错义突变( n =29例肿瘤；Man-Whitney P =0.051和 P 错义突变和克隆突变分别为0.025)，亚克隆突变数以黄色插入数表示。中的反复失活改变 BAP 1 , CDKN2A , NF2 , TP 53 , SETD 2 和 PBRM 1 治疗反应无显着性差异。同样，体细胞 BAP 1 序列改变和 CDKN2A 40例MPMS中32.5%(13/40)和30%(12/40)存在纯合缺失，在治疗反应方面未见明显增加。特殊基因型与特殊治疗结果相关(pfs、≥、12个月和/或OS≥24个月)：患者178例存在肿瘤双等位基因灭活。 NF2 组蛋白甲基转移酶 SETD 2； 926例肿瘤双等位基因灭活 BAP 1 患者361例存在肿瘤纯合性缺失 BAP 1 在SWI/SNF核小体重构基因中 PBRM 1 。染色质调节基因的突变在达到12个月或更长时间的患者中被观察到丰富(Fisher‘s的确切结果)。 P =0.063)。我们发现HRD突变信号在有反应的肿瘤中有更高的贡献( n =40例患者；在有反应和无反应的肿瘤中，HRD的平均贡献率分别为9.1%和1.6%；Mann-Whitney P =0.043)。相反，APOBEC突变信号在无反应的mpm和上皮样mpm肿瘤中更丰富(mann-Whitney)。 P =0.058和 P 分别=0.031)。突变的特征是后果(误解、移码、无义和剪接位点)和复发(热点，描述为实心圆圈)，在截断突变(双等位基因失活，标记为‘x’)时，考虑野生型等位基因的缺失。来自329、351、629和923患者的肿瘤样本被排除在因肿瘤组织质量引起的躯体改变分析之外，此处未显示；这些患者被包括在种系分析中，患者629存在有害突变。 BAP 1 。BOR，最佳整体反应；Epi，上皮样；Sarc，肉瘤样。
源数据
然后，我们评估了非同义序列的改变相关的假性免疫原性肿瘤抗原(免疫原性突变(Imms)； 方法 和补充表 3 )并发现高主要组织相容性复合物(MHC)I级IMM负担( P =0.064)以及较高的MHC II级IMM负担( P =0.023)在有反应的肿瘤中(扩展数据图)。 5 和补充表 4 )，尤其是上皮样MPM( P =0.035和 P 分别=0.038)。有趣的是，与HLA I类等位基因发散假说一致的是，在HLA I类功能多样性的存在下，更有效的肿瘤免疫监测。25 P =0.06和 P 分别=0.003；扩展数据图。 7 和补充表 5 )。我们随后测试了两名获得长期临床反应的患者自身T细胞对imm衍生新肽的反应性。 方法 )。T细胞受体(TCR)克隆型扩增 SRPK 2 P.C234Y和 NDUFS 2 P.V412L突变在459例肉瘤样MPM患者和33个月的OS患者中显著(扩展数据图)。 8 )。同样，新抗原特异性tcr扩张也被注意到用于imms。 SCRN 1 P.V334A， PSD 2 P.C307Y， ZNF 469 P.P3471S和 CD 72 PT71A用于295例上皮样MPM，操作系统21.85个月(患者在数据锁定时保持无事件；扩展数据图。 8 ).
间皮瘤的发生可能与肿瘤易感基因的生殖细胞突变有关，包括 BAP 1 , MLH 1 , MLH 3，BRCA 1 , BRCA 2 和 BLM 20 ,22 然而，生殖系MPM易感突变对化疗免疫治疗反应的潜在影响还没有得到评估。致病性生殖细胞失活突变的MPM易感基因( 方法 )，以参与dna损伤修复的人为主，其存活时间明显延长(log级)。 P =0.05和 P 所有患者和上皮样MPM分别为0.032； 3A-d )。有趣的是，散发的病人 BAP 1 携带杂合子体细胞失活突变的突变体mpm没有更好的放射反应或长时间OS，这可能暗示在生殖细胞bap 1缺乏的背景下，免疫监测机制不同。 26 ,27 。如前所述 4 ,28 、失活患者 BAP 1 生殖细胞突变较年轻( P =0.009) 29 ,30 ，以及肿瘤 BAP 1 发现双等位基因失活具有丰富的dna错配修复缺陷相关突变特征( P =0.003)。体瘤 BAP 1 失活突变具有较高的克隆性和较低的部分基因组，杂合性丢失(LOH)。 P =0.033和 P (分别=0.018)；显著的趋势是陆恭蕙的程度较低。 BAP 1 TCGA队列中突变型间皮瘤。有趣的是，这些发现并没有在含有细菌灭活剂的案例中得到证实。 BAP 1 突变，突出了种系和体细胞遗传背景之间的差异。此外，我们发现上皮样MPMs含有体细胞。 BAP 1 失活突变有较高的肿瘤内CD8 + T细胞浸润(扩展数据图)。 9 )。6例有效组织(4例)转录序列分析 BAP 1 野生型和两型 BAP 1 (突变体)表明颗粒酶B的表达水平较高。 BAP 1 突变型肿瘤，表明细胞毒性免疫反应活跃在小鼠的微环境中。 BAP 1 突变肿瘤(扩展数据图。 9 ).
图3：肿瘤易感基因的种系突变对联合免疫化疗结果的影响。 a , b ，在间皮瘤易感基因中携带已知有害生殖细胞突变的患者( 方法 )有一个更长的操作系统(日志级别) P =0.05)，尤其是上皮样MPM组(对数秩)。 P =0.032)。 c , d 的一个重点分析，包括有害的生殖细胞突变。 BAP 1 , BRCA 2 , MSH6 和 BLM -所有与dna损伤修复有关的基因对ddr基因中含有生殖细胞突变的患者来说，都显示出更长的OS的趋势(log-秩)。 P =0.12对所有病人和对数等级 P (上皮样肿瘤=0.082)。全 P 价值是双面的。DNA损伤修复
基因组的不稳定性，特别是大规模拷贝数的丢失，是mpm的标志。 18 ,29 ，我们的大规模拷贝数分析显示，重复的染色体臂丢失或LOH为4p，4q，6q，9p，10q，13q，14q，18q和22q，以及3p21.1的LOH/缺失。 BAP 1 谎言(无花果) 4A 、补充表 6 和 7 以及扩展数据图。 10 )。经常复制损失区域 LATS 1 (6q)， CDKN2A (9P) LATS 2 (13q)和 NF2 (22Q)位点。我们发现在没有射线反应的肿瘤中，染色体臂1p的LOH和染色体臂6q的半缺失(应答者24人中有2人，无反应者16人中有6人)。 P =0.04；图1。 4A )。有趣的是，缺失含有间皮瘤驱动基因的染色体臂6q。 LATS 1 , REV3L 和 SHPRH ，在没有治疗反应的上皮样肿瘤中更为突出(应答组21例中有2例，无反应组8例中有4例)， P =0.033)。由于DNA断裂在间皮瘤中经常发生 17 ,19 ，我们通过估算基因组中拷贝数断点的数量来量化染色体不稳定性。 方法 )，发现OS为12个月或12个月以上的患者上皮样MPM中的全基因组断点含量较高( P =0.053；图1。 4B 和补充表 4 )。TCGA间皮瘤组断点分析未能确定与OS的相关性(单变量Cox比例风险回归分析，HR=1.36， P =0.23)。此外，我们计算了一个综合同源重组缺陷(HRD)评分，包括端粒等位基因失衡、LOH和大规模状态转换，发现较高的HRD评分定义了长期生存的上皮样肿瘤( P =0.014；图1。 4C 和补充表 4 相反，TCGA间皮瘤组HRD评分较高与预后无关联(HR=1.02，均为连续变量)。 P =0.14)或二进制变量(HR=1.58， P 采用单因素Cox比例风险回归分析)。与这些发现相一致的是，DNA双链断裂修复缺陷的突变特征在放射性CR或PR患者的肿瘤中更丰富( P =0.043；图1。 2 和补充表 4 )。三例患者的基因组接近单倍化，这是一种现象，细胞失去几乎所有染色体的一个拷贝，然后重复其余的染色体，有趣的是，所有这些患者的OS为12个月或更长时间(图1)。 4A 以及扩展数据图。 10 )。这是合理的，突变和相关的新抗原包含在基因组区域中，每个癌细胞只有一个拷贝不能在选择性的治疗压力下被消除，因此，中介持续的新抗原驱动的免疫反应和长期的临床利益。与此相一致的是，我们发现，与非应答者相比，应答者在肿瘤基因组单拷贝区域中包含了更多的序列改变( P =0.027；图1。 4D )；值得注意的是，绝大多数是克隆人(93人中有71人，76%；补充表 8 )。为了进一步支持这些发现，我们调查了单个细胞(单倍体区)和每细胞两个拷贝(整倍体区)基因组区域的背景丢失率，并分析了来自tcga的1086例间皮瘤和非小细胞肺癌肿瘤的体细胞拷贝数。 方法 )。这些分析表明，单倍体区域的损失率一直低于整倍体区(扩展数据图)。 9 )，支持这一观点，即这些区域中包含的突变很难消除，并可能导致持续的抗肿瘤免疫反应。
图4：大规模拷贝数分析。 a 全基因组拷贝数分析主要揭示了基因组拷贝数丢失的区域(以蓝色表示)，并被用来确定完全等位基因不平衡的拷贝数断点和部分基因组的程度，反映基因组的不稳定性和肿瘤的非整倍体。在校正肿瘤纯度后，每条染色体显示相对拷贝率(log拷贝比)值，该值量化了每个基因组区域相对于平均基因组倍性的丰度。红色和蓝色分别表示复制的得失，而白色标记则表示复制中性区域。计算HRD评分时，考虑到端粒等位基因失衡、LOH和大规模状态转变.三个极端的LOH病例被注意到，其拷贝数模式暗示着基因组接近单倍化；这些患者在化疗免疫治疗后的OS为12个月或更多。 b , c ，较高的拷贝数断点数和较高的HRD评分可区分上皮样MPM与OS为12个月或12个月以上的患者( n =28例上皮样MPM肿瘤；Mann-Whitney P =0.0.05和 P 分别=0.014)。 d ，应答的肿瘤在基因组的单拷贝区域含有更多的突变，这表明这些难以消除的改变和相关的新抗原可能是抗肿瘤免疫反应的重要驱动因素。 n =40 mpm肿瘤；Mann-Whitney P =0.027)。方框图中的中线代表中位数；方框图的上限代表第三分位数(第75百分位数)；方框图的下限表示第一个分位数(第25百分位数)；上须是数据的最大值，其值在超过75百分位数的四分位数范围内1.5倍以内；下晶须是数据在第25百分位数下的1.5倍范围内的最小值。全 P 价值是双面的。等位基因IMB具有等位基因不平衡的基因组片段；Bor，最佳总体响应；CNA，拷贝数改变。
源数据
如以前报告的那样 15 P =0.018和 P 分别=0.006；图1。 5A-C 和补充表 4 和 9 )。我们研究了三名患者(295,459和926)肿瘤内T细胞库的重塑，他们有长期的治疗反应，但最终发展为获得性耐药，在治疗前和在获得性耐药时对肿瘤进行了连续取样。有趣的是，在获得性耐药时，TCR的克隆型扩张和回归显示了明显的重塑，从而使三例患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表现出明显的克隆性(图一)。 5D )。这些发现可能暗示一种有效的抗肿瘤免疫反应是由多克隆T细胞库介导的，依赖于较少的tcr效应细胞可能不足以引起有效的抗肿瘤免疫反应。
图5：治疗耐药时的基线TCR曲线特征和动态变化。 a 对肿瘤内T细胞库进行TCR Vβ测序，计算肿瘤内T细胞库的克隆性，并计算显性克隆( 方法 )在整个TCR储备中所占的比例被确定。CD8 + T细胞密度和pd-L1肿瘤比例评分显示每个可评价病例(缺失病例以灰色显示)。 b ，这些分析显示，在达到操作系统12个月或更长时间的患者的肿瘤中，TCR序列的克隆性较低(Mann-Whitney)。 P =0.018)。 c ，在操作系统较短的肿瘤中也能检测到较高的优势克隆(Mann-Whitney)。 P =0.006)。 d 3例患者在开始治疗前(295、459和926)和获得性耐药时的差异丰度分析显示TCR克隆型扩张(标记为显著阳性)和回归(标记为显着阴性)，患者926的PR和OS分别为27.8个月和27.8个月。肿瘤内TCR克隆的折叠变化 x 轴(对数比例尺)及相应的调整后的Mann-Whitney P 值显示在 y 火山地块的轴(−测井比例尺)。全 P 价值是双面的。Biph；双相；Bor，最佳整体反应；Epi，上皮样；IHC，免疫组织化学；NE，不可评估；Neg，显着阴性(回归TCR克隆)；NS，无显着性；pos，显著阳性(扩大TCR克隆)；Sarc，肉瘤样克隆。
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