分析IL 36aC/EBPβ诱导通孔CpG甲基化水平对小鼠巨噬细胞半CRE·C/EBP的影响

白细胞介素-36(IL-36α)是IL-1细胞因子家族中的一个新成员，在诱导后的上皮组织和多种髓系细胞中高表达。转录因子(TF)C/EBPβ特异结合到一个必需的半CRE·C/EBP基序IL36a启动子诱导IL36a在LPS刺激下表达。C/EBPs通过与含有5‘-磷酸胞嘧啶-鸟嘌呤-3’二核苷酸(CpG)的识别序列结合来调控基因表达，其甲基化可能影响TF结合和基因表达。在这里，我们证明了半CRE·C/EBP元素在IL36a启动子在小鼠RAW264.7细胞株和原代小鼠巨噬细胞中有不同程度的甲基化。我们证明了C/EBPβ与半CRE·C/EBP元素在IL36aLPS刺激后的启动子对CpG甲基化不敏感，半CRE·C/EBP元件中CpG的甲基化不会改变LPS诱导的CpG甲基化。IL36a与相似基因相关的启动子活性IL36aMrna拷贝数和亲IL-36α蛋白在两种细胞类型中的表达量。总之，我们的数据表明，C/EBPβ结合到半CRE·C/EBP元件和随后的基因激活是独立于半CRE·C/EBP基序的CpG甲基化状态的，并强调了C/EBPs识别甲基化和非甲基化基序的潜力。

白细胞介素(IL)-36细胞因子是IL-1细胞因子家族的一个亚家族，由三种细胞因子(IL-36α，IL-36βIL-36γ)和IL-36受体拮抗剂(IL-36 RA)组成，在宿主免疫中起重要作用。1]。IL-36细胞因子在不同组织中表达，如巨噬细胞、树突状细胞、角质形成细胞和肺上皮细胞。2,3,4,5,6,7]。它们与白细胞介素36受体(也称为IL-1R-样2)结合，在许多不同的细胞上广泛表达，包括小鼠骨髓来源的树突状细胞CD4。+T细胞、单核吞噬细胞和皮肤、肺和消化道组织的各种上皮细胞[4, 8, 9]。与IL-1受体类似，IL-36受体通过配体结合激活跨膜IL-1受体辅助蛋白，通过丝裂原激活的蛋白激酶和核因子-κB(NF-κB)激活的转录激活胞内信号，从而引起炎症反应。10,11,12]。在转录水平上，IL-36α和IL-36γ本身分别受NF-κB、C/EBPβ和T细胞表达的转录因子T-box的调控。2, 3].

DNA甲基转移酶对胞嘧啶残基的DNA甲基化是一种表观遗传修饰，参与哺乳动物的发育、谱系鉴定和转录调控。13]。传统上，基因启动子的DNA甲基化被认为是通过抑制某些转录因子(TF)与其结合位点的结合而使转录沉默。14,15,16,17]或间接结合含有甲基-cpG(MCpG)-结合域(Mbd)的TFs，从而生成组蛋白去乙酰化酶，进而促进局部染色质缩合[18]。近年来，越来越多的缺乏Mbds的TFs被证明与转录因子结合位点(TFBS)结合，甚至在它们被甲基化时也是如此，这反对CpG甲基化总是抑制转录的范式。例如含有C2H4锌指结构域的转录激活因子，如Kaiso和krueppel样因子4[19, 20]，具有螺旋螺旋dna结合结构域的蛋白质，如zhx 1/2和pax 6[21, 22]，如c-MYC和ARNT 2等含有螺旋环-螺旋结构域的TFs[23, 24，而TFs属于bZIP蛋白家族，如C/EBPs[25, 26].

C/EBP转录因子属于bZIP转录因子家族，参与组织特异性基因的表达、增殖、分化和炎症。27]。特别是C/EBPβ可调节炎症基因，如细胞因子IL-6、IL-12p40和IL-36α[3, 28, 29]、趋化因子IL-8和巨噬细胞炎性蛋白-1α[28, 30以及诱导型一氧化氮合酶(NOS 2)和环氧合酶-2[31, 32]在巨噬细胞中。C/EBPβ结合及随后的基因表达需要与其他C/EBP家族成员或CREB/ATF家族成员形成同源二聚体或异二聚体。通孔BZIP域[33]。一致序列以及C/EBPs识别的复合位点可以包含一个中央CpG二核苷酸[27]。几项研究表明，如果CpG二核苷酸甲基化，C/EBPs可以在体外和体内以相似甚至增加亲合力的方式结合这些序列。17, 25, 26, 34]。因此，这种甲基化可以在cre样序列上产生C/EBP结合位点，从而导致C/EBPs激活分化特异基因的子集，同时抑制CREB成员对这些基因的激活[25]。这种对结合dna甲基化状态不敏感的结构基础最近已经被揭开，并被证明是被中介的。通孔所谓的甲基-艺术-G三合会[35].

最近，我们报道了C/EBPβ使转录激活IL36a 通孔一个重要的半CRE·C/EBP位点，包含一个中央CpG二核苷酸[3]。对于IL-36细胞因子，据我们所知，没有关于表观遗传调控的信息，特别是关于CpG甲基化及其对转录因子结合的可能影响的信息。因此，我们在此分析了两种不同的小鼠巨噬细胞的甲基化水平及其对C/EBPβ结合和转录激活的影响。IL36a.

半CRE·C/EBP基因的差异甲基化IL36a小鼠巨噬细胞启动子

我们之前已经证明过IL36a在小鼠巨噬细胞中，C/EBPβ与半CRE·C/EBP元件的结合介导了巨噬细胞的mRNA表达。IL36a尽管启动子序列中存在经典的C/EBP识别位点[3]。本研究旨在探讨C/EBP与半CRE·C/EBP结合的特异性与甲基化水平的关系。

硅质分析IL36a启动子区位于转录起始点上游1120 bp，GC含量为43.21%，没有CpG岛，只有9个CpG二核苷酸。1A)。RAW264.7细胞基因组DNA的分离及含CpG半CRE·C/EBP区亚硫酸氢盐序列的低甲基化率为9.70±10.01%。1B和D)。而BMDMS中该位点甲基化水平为66.95±8.63%。1C和D两种细胞间甲基化程度差异有显着性(平均差异为57.2%；95%CI：44.5，67.5)。

A的示意图表示IL36a基因结构(Genebank条目KM 205447.1)，CpG岛，GC含量(上半部分)，以及表示CpG位点的启动子区域(棒棒糖，下部)。.的地位IL36a在小鼠2号染色体(红线)上，半CRE·C/EBP元件(橙色盒)和亚硫酸亚铁(−)序列分析的扩增区。B, C用亚硫酸亚铁测序法从RAW264.7(B)或BMDMS(C)中确定了(A)区的DNA甲基化状态。每一行代表单个克隆的测序结果(开放循环，未甲基化CpG；填充循环，甲基化CpG)。半CRE·C/EBP元素中的CpG用灰色箭头表示.D对RAW 264.7(浅灰点)和BMDM(深灰色点)DNA甲基化的定量研究n=3(RAW 264.7)或n=4(BMDM)实验。在面板的左侧绘制单个数据点和汇总测量值(平均±sd)；在面板的右侧显示具有自举95%置信区间和重采样分布的效应大小(平均差、黑点)。

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C/EBPβ与甲基化半CRE·C/EBP元素的体外结合IL36a启动子

由于半CRE的CpG甲基化增强了C/EBP成员的结合，并能激活组织特异性基因表达，CpG在半CRE·C/EBP中的甲基化状态的显著差异可能导致C/EBPβ在RAW264.7巨噬细胞和初级BMDMs中的差异结合活性。因此，我们接下来用放射标记的寡核苷酸分析了C/EBP和CREB成员与核提取物中非甲基化和甲基化半CRE·C/EBP元素的结合，该寡核苷酸的区域从−314到−290，相对于小鼠的tss。IL36a基因。

我们首先用LPS刺激RAW264.7细胞的核提取物进行体外复合物形成的研究，在未甲基化探针的EMSA中，DNA与蛋白质的相互作用在未受刺激的细胞和LPS刺激的细胞中表现为两种主要的复合物。而迁移较慢的复合物的本构DNA结合活性几乎没有变化(箭头，图)。2A)LPS处理后的细胞提取物中，快速迁移复合物的结合活性增强.C/EBPβ、C/EBPδ、CREB-1和ATF-4抗体的超移实验表明，诱导复合物中只有C/EBPβ和一定程度的C/EBPδ。用甲基化探针观察到类似的诱导蛋白-DNA复合物的形成.与非甲基化探针相比，本构式DNA结合活性无法检测到。甲基化探针还与C/EBPβ和C/EBPδ结合，但不结合CREB-1或ATF 4。2A)。用未受刺激的核提取物和LPS刺激的BMDM的核提取物也得到了类似的结果.无论是否使用非甲基化或甲基化探针，脂多糖处理均诱导蛋白-DNA复合物与抗C/EBPβ抗体重叠，并在一定程度上被抗-C/EBPδ抗体所取代。同样，形成的配合物中也没有可检测到的CREB-1或ATF 4的含量(图1)。2B)。然而，在这两种细胞的提取物中，与甲基化探针形成的复合物似乎形成了比非甲基化探针更少的特异性配合物，这在RAW264.7巨噬细胞提取物中以甲基化探针的还原本构蛋白结合最为突出。

这表明C/EBPβ能够结合非甲基化和甲基化的半CRE·C/EBP序列，半CRE·C/EBP元件的甲基化增强了蛋白结合的特异性。

甲基化不能增强C/EBPβ的结合

为了检测CpG甲基化是否增强C/EBPs与DNA探针的结合，并进一步分析CpG甲基化是否优先与非甲基化或甲基化半CRE·C/EBP寡核苷酸结合，采用不同的方法评估蛋白质-DNA复合物的形成。首先，我们进行了竞争EMSA。为此，一个含有C/EBP共识基序(5‘-TTGCGCAA-3’)的放射标记寡核苷酸与未受刺激和LPS刺激的RAW264.7细胞的核提取物共同孵育，同时存在大量未标记的未甲基化或未标记的甲基化半CRE·C/EBP-。IL36a以前使用过的寡核苷酸。如图所示。3A两种寡核苷酸浓度依赖性地降低了蛋白质-DNA复合物的形成，具有类似的抑制作用。

A采用放射标记C/EBP共识寡核苷酸探针和LPS刺激(4h，5g/ml)RAW264.7细胞的核提取物进行竞争EMSA。非甲基化或甲基化的Cre·C/EBP的10倍、50倍和100倍的摩尔过剩IL36a采用寡核苷酸对LPS刺激的RAW264.7核提取物进行竞争反应。给出了两个独立实验的一个有代表性的实验。B15%双三凝胶显示纯化的C/EBPβ-bZIP结构域(2.5g，箭头)用于荧光偏振(FP)测定。CC/EBPβ-bZIP结构域的fp与IL36a半CRE·C/EBP元素含有未甲基化(U，浅灰)或甲基化(M，深灰色)中央CpG。数据表示一次典型实验的平均±SD值，一式三份。D测定KD使用fp测试的值显示在(C)基于n=5项实验。在面板的左侧绘制单个数据点和汇总测量值(平均±sd)；在面板的右侧显示具有自举95%置信区间和重采样分布的效应大小(平均差、黑点)。

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接下来，我们确定了离解常数(KD)鼠C/EBPβ-bZIP结构域(图1.3B)双链半链CRE·C/EBP-IL36a用荧光偏振法检测未甲基化或甲基化CpG的寡核苷酸。3C)。C/EBPβ结合域将未修饰的寡核苷酸与aKD(0.0 8±0.0 3)M。三维空间)。在相同条件下，甲基化寡核苷酸与KD(0.10±0.0 3)M。三维空间非甲基化寡核苷酸与甲基化寡核苷酸无显着性差异(平均差异=0.0157 M；95%CI：−0.0213，0.0438)。

这些数据进一步表明，C/EBPβ可以识别位于IL36a体外CpG甲基化状态的启动子。

半CRE·C/EBP元件中CpG甲基化不受抑制IL36a启动子活性

其次，我们分析了半CRE·C/EBP元件的CpG甲基化在一个更类似于核体内情况的系统中的相关性。为了评价C/EBPβ与甲基化半CRE·C/EBP元件的结合是否具有生物学相关性，我们使用RAW264.7细胞进行了瞬时转染。这个IL36a启动子区是−357和−45之间相对于tss的基因诱导所必需的调控元件，克隆到报告质粒中，从质粒骨架(PCpGL)中删除所有CpG二核苷酸。36]，(图1.4A)。半CRE·C/EBP位点的CpG在pCpGL中-IL36a-357/−45质粒在体外经酶甲基化SSSI(CpG)甲基化酶和S-腺苷甲硫氨酸。通过限制性内切酶分析证实了甲基化的有效性。HPYCH4IV将未甲基化质粒完全线性化(星号，图)。4B而甲基化质粒没有线性化，表明完全甲基化(如图所示)。4B).

APCpGL的示意图表示-IL36a-357/−45-荧光素酶报告结构。转录因子结合位点被指示。BPCpGL的体外甲基化IL36a-357/−45使用SSSI(CpG)甲基化酶和S-腺苷甲硫氨酸。质粒酶切后凝胶电泳证实甲基化。非甲基化质粒(通道1-3)完全线性化。HPYCH4IV(星号)HPYCH4IV不使甲基化质粒线性化(通道4-6)。消化PST我和KPN我释放IL36a-357/−45质粒插入C原264.7细胞共转染甲基化/非甲基化pCpGL-IL36a-357/−45与PRL-TK载体一起构建。转染后24h，LPS(100 ng/ml)刺激细胞8h或未处理。萤火虫荧光素酶活性雷尼拉荧光素酶，表达为荧光素酶诱导的折叠变化(LPS与ctrl之比)。n=4项实验。在面板的左侧绘制单个数据点和汇总测量值(平均±sd)；在面板的右侧显示具有自举95%置信区间和重采样分布的效应大小(平均差、黑点)。

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然后，将甲基化和非甲基化质粒转染RAW264.7细胞，8h后检测100 ng/ml LPS刺激细胞的荧光素酶活性。4CLPS刺激后，转染未甲基化报告质粒和甲基化报告质粒的细胞中荧光素酶的诱导量增加(两倍于ctrl)。转染非甲基化或甲基化质粒的细胞间荧光素酶诱导率无显着性差异(平均差异=6.94RLU；95%CI：−7.47，19.7)。

这些数据表明，半CRE·C/EBP位点的CpG甲基化对CpG甲基化没有显著影响。IL36aLPS刺激RAW264.7细胞的启动子活性。

半CRE·C/EBP元件中CpG甲基化对IL-36α表达无影响

接下来，我们分析了甲基化报告质粒转染细胞的边际表达差异是否反映了IL36a启动子在其“体内”背景下在细胞核中的激活。为此，我们直接比较了IL36aLPS诱导RAW 264.7细胞和BMDMs细胞半CRE·C/EBP位点甲基化水平差异显著(图1)。1)。用LPS刺激细胞8h，用qRT-PCR对分离的总RNA进行绝对定量。如图所示。5A, IL36aLPS刺激RAW264.7细胞和BMDMs后可检测到诱导作用。我们没有观察到有显着性差异的褶皱变化诱导。IL36aLPS刺激的RAW264.7细胞与骨髓基质细胞的mRNA表达(平均差异=−101.4；95%CI：−2276.3,1748.2)。此外，对RAW 264.7细胞和BMDMs细胞裂解液中亲IL-36α的westernblot分析也显示，LPS刺激后细胞因子的水平相似(见图)。5B)支持以下假设：半CRE·C/EBP位点的DNA甲基化不影响IL36a表情。

A用1g/ml LPS刺激RAW264.7细胞和BMDMs 8h，IL36a用qrt-pcr法测定mrna拷贝数。n=8项实验，并表示为IL36a诱导(LPS与ctrl之比)。在面板的左侧绘制单个数据点和汇总测量值(平均±sd)；在面板的右侧显示具有自举95%置信区间和重采样分布的效应大小(平均差、黑点)。B1g/mlLPS刺激RAW264.7细胞和BMDMs后8h及未处理的RAW264.7细胞前ILL 36α表达的Westernblot分析。在3个独立实验中，有一个具有代表性的westernblot。用密度法测定的前IL-36α与GAPDH的比值如下(任意单位，n=3次实验，平均±SD)。

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IL36a在不同的细胞类型和不同的组织中表达。11]。然而，关于表观遗传调控的信息，特别是关于CpG甲基化及其对转录因子结合的可能影响的信息，目前还缺乏。我们以前已经证明，在小鼠巨噬细胞中，LPS诱导的。IL36a基因表达需要C/EBPβ与半CRE·C/EBP元件结合。IL36a启动子[3]。在这里，我们观察到RAW264.7细胞和原代小鼠巨噬细胞中这一元素的差异甲基化，导致了甲基化差异是否指向表观遗传调控的问题。IL36a通过影响TF绑定和后续IL36a基因表达

CpG基序甲基化调控基因表达是几种普遍的表观遗传机制之一。37]。大多数数据将启动子区域的CpG甲基化与基因表达联系起来，这些数据来自于对基因在启动子区域的CpG岛(大于500 bp，观察到的CpG/预期CpG比值为0.65)的研究。38]。中央人民政府岛屿不存在于IL36a启动子。然而，启动子在转录起始点附近含有许多CPGS，其中一个位于关键的半CRE·C/EBP元件内。这种近端的、非岛状的cpgs现在被认为对基因表达的调控很重要，受这些非岛cpgs甲基化影响的启动子的例子包括：IL 2，NOS 2, MMP 13, Il1B，和IL18BP [39,40,41,42,43]。而在大多数情况下，CpG位点的甲基化导致转录失活，而其他基因甲基化则增加了TFs的结合，从而导致更强的基因表达。例子包括BGLAP-Rs1和MMP 9 [25]以及帕克斯2 [44]。这一调控在表观遗传学水平上可能服务和控制细胞/组织类型特异性的生理功能，或导致早期发育基因在恶性肿瘤中的重新激活。

本文中提出的几条证据表明，半-CRE·C/EBP元素甲基化在IL36a启动子对IL36amRNA表达凝胶位移实验和荧光偏振实验表明，C/EBPβ能够在体外结合Cre·C/EBP元件的非甲基化和甲基化形式，这与早期研究表明C/EBPβ与甲基化共识序列结合的结论一致。25]。有趣的是，我们还观察到C/EBPδ与两种探针的结合，尽管总体结合程度低于C/EBPβ。这与使用甲基化结合阵列显示甲基化抑制C/EBPδ结合的研究形成对照[26]。此外，我们没有检测到C/EBP、β/ATF 4杂二聚体的形成，这表明由于推测ATF 4不能诱导足够数量的ATF 4，所以在LPS刺激后未形成异二聚体。然而，对于这两种细胞类型的裂解物，我们在使用甲基化探针时检测到的非特异性结合较少，表明甲基化干扰了一些识别非甲基化探针的未知TFs的结合。因此，人们可以推测甲基化对IL36aMRNA在特定情况下的表达。的确，尹等人。证明大多数bZIP家族成员在甲基化时与其基序的结合减少(图5C，见[17])。这支持了一种假设，即BMDMs中半CRE·C/EBP元素的甲基化可能会增加C/EBPβ的特异性，这是该家族中容忍中央CpG甲基化的TFs之一。

与Rishi等人的研究相比，我们没有观察到增强的C/EBPβ与甲基化基序的体外结合。25]。自IL36a激活依赖于C/EBPβ-我们的数据表明，对CpG甲基化的转录调控的耐受性可能有助于克服其他抑制性表观遗传修饰。与此相一致的是，我们的发现与以前的报告一致，表明C/EBPβ在体内能耐受CpG甲基化[34]。此外，它还符合最近公布的数据，即使用甲基化和非甲基化库比较C/EBPβ体外结合的相对亲密度[45]。因此，我们分析了IL36a通过比较甲基化和非甲基化相对亲缘关系分别与一致C/EBP基序和一致CRE基序的半CRE·C/EBP元素，根据已公布的C/EBPβ同源二聚体结合数据[45]。这样的比较显示，半CRE·C/EBP基序的结合亲和力相对较低(与一致的C/EBP基序相比)，但甲基化序列和非甲基化序列之间没有差别(补充图)。1A)。相比之下，甲基化后C/EBPβ与一致的Cre基序的体外结合增强，证实了先前的数据[25]。这种甲基化不敏感性也反映在从低聚物富集表中衍生出来的能量标识中(补充图)。1B)。同样，在LPS刺激下诱导荧光素酶的表达，IL36a尽管甲基化程度存在差异，但两种细胞在蛋白水平上的mRNA表达和蛋白水平上的前Il-36α的数量并无显著差异。然而，由于BMDM群体中只有66%的细胞含有甲基化的半CRE·C/EBP元素，我们不能排除不完全甲基化对qRT-PCR和westernBlot检测的影响。综上所述，我们的数据表明，甲基化的这一主题并不影响内源性启动子活性。因此，我们推测，在不同的结合基序中，CpG中心两侧的半CRE·C/EBP元件和/或核苷酸的不对称性决定了CpG甲基化后是否存在作用或增强的结合。

总之，这里提供的数据强调了C/EBPβ识别甲基化和非甲基化结合位点的潜力。未来需要进行结构分析或硅模拟，以明确地阐明C/EBP与半CRE·C/EBP元素的结合机制。IL36a启动子。此外，我们的数据表明IL36a在小鼠巨噬细胞中，基因近端启动子区的半CRE·C/EBP元件的CpG甲基化很可能不受表观基因的调控。