Rc1-4填充启动后的顺序免疫诱发了一种非v3靶向抗体Ab1245。
我们之前描述了一种针对免疫原rc1的v3-糖聚糖贴片，它是从设计的v3免疫原11 mutb中修改而来的。16，去除连接在gp 120残基N 156上的N-链糖聚糖。Gp 1204。RC1和11 MUTB均来自CLADE A BG 505 SOSIP.664原生类Env三聚体。12。Rc1-4填充和11 MUTB-4填充分别由rc1和11 mutb修饰，以减少对非目标表位的抗体应答。11,17,18,19通过插入PNGSS向残基中添加糖聚糖230Gp 120, 241 Gp 120, 289Gp 120，第344条Gp 1204。此外，为了增强抗体的亲和力和限制抗体进入环境三聚体的途径，我们使用spyTag-spycatcher系统在vlps上进行了多种免疫原的研究。20,21。用rc1-4填充-vlps启动四个nhp。4(I)VLPs与11 MUTB-4 Fill耦合。16(CLADE A)，(Ii)与B41 SOSIP(CLADE B)耦合的VLPs(CLADE B)；(Iii)在9个月内与AMC 011和DU 422 SOSIP(CLADS B和C)相结合的VLPs22(无花果)1A).
图1：连续免疫诱发猕猴AB 1245的特征。a猕猴连续免疫方案，在40周内产生Ab1245。bAB 1245重链和轻链与其种系前体序列的比对。与BG 505 Env的接触由残基周围的彩色盒表示(CDRH 3接触残基的青色盒；重链和轻链接触残余物的暗粉色和淡粉色盒)。指出CDRs中的残基；CDRs之间的残基位于框架区域(FWRs)。VDJ连接得到的CDRH 3残基在顶端种系序列中表现为破折号，在成熟的Ab1245序列中，种系前体的变化表示不同的残基。残余物使用Kabat公约编号。cSEC-MALS谱BG 505 SOSIP.664 Env三聚体，与Ab1245和8ANC195 Fabs的三倍摩尔过剩络合。左：280 nm处吸光度(左)y-轴)在Superdex 200 10/300 GL凝胶过滤柱上绘制洗脱体积图，每一峰测定摩尔质量(右)y-轴)。右图：显示预测和计算的分子质量的表格。d质量光度法结果。衍生分子质量(Mw)被列出为Env三聚体(BG 505或BG 505)。N611A)在未添加Fab的情况下孵育，或以所指示的Fab(Ab1245、Bg1或8ANC195)作为独立测量数的均值和标准差。Fabs/trimer行显示每个Fab/Env三聚体复合物的预期Fabs数。预测的质量行表示假定310 kDa的BG 505三聚体的质量(由SEC-MALS导出)，(c)加50 kDa每到法布。
B 1245的重链和轻链的序列是从BG 505和B41 SOSIP作为诱饵捕获的一种增强的NHPs中分离出来的B细胞克隆而成的。13,22(无花果)1B)。重链和轻链分别来自于猕猴V基因片段IGHV 4-2*01和IGLV 9-1*01，分别有14%(重链)和5%(轻链)氨基酸变化。值得注意的是，重链(Cdrh 3)的第三个互补区(Cdr)比典型的猕猴cdrh3s长(24个残基，而平均为13-15个残基)。23).
一个Ab1245 Fab与每个BG 505 SOSIP三聚体结合
为了确定Ab1245Fab与BG 505 SOSIP三聚体相互作用的结合化学计量学，我们采用尺寸排斥色谱结合多角度光散射(SEC-MALS)方法推导了BG 505-Ab1245 Fab配合物的绝对分子质量。BG 505与过量Ab1245 Fab(每gp 120-gp41原生质3法伯)一夜孵育时，我们观察到一种异种混合物，对应于每三聚体零到一个Ab1245，而与8ANC195Fab孵育则形成一个均一复合物，对应于每三聚体三个法布(图)。1C)，正如先前化学计量测量和结构所预期的那样24,25,26。为了验证每个三聚体中一个或多个ab 1245 Fabs在SEC-mals所需的色谱过程中没有解离，我们使用了质量光度法，一种为溶液中的单个蛋白质和复合物推导出近似质量的技术。27，单独测定BG 505的分子量，并与AB 1245或对照法布络合：8ANC195(每BG 505三聚体三个法伯)。24,25,26和Bg1(每BG 505三聚体两法布)24。与SEC-MALS的结果一致，质量光度法实验表明每种野生型BG 505三聚体与Ab1245 Fabs为零，而N611A突变BG505三聚体为零(图1)。1D)。我们的结论是Ab1245Fab不对称地与Env结合，每个三聚体有一个或零的Fabs。
Ab 1245在gp120-gp41接口处绑定。
为了进一步表征HIV-1 Env上的Ab1245表位，我们解决了AB 1245 Fab与BG 505 Env三聚体结合的单粒子低温-EM结构。为了形成配合物，我们用BG 505孵育了Ab1245 fab的三倍摩尔过剩量，然后再孵育出超过8NC 195三倍的摩尔量。28Fab增加复杂的质量并防止与偏好取向偏差相关的问题(表)1，补充图。1C)。这导致了复杂的形成与三个8ANC195法布和一个Ab1245Fab结合每BG 505三聚体(图一)。2A)，与化学计量学实验相一致。1C，d)。该复合物每BG 505三聚体有一个Ab1245 Fab，其解析率为3.7，并在整个复合物中显示出大致明确的侧链密度(图1)。2B；补充图。1F)。另一种3D级BG 505三聚体被观察到三种结合的8ANC195法伯和无Ab1245法伯(补充图)。1E).
图2：ab 1245绑定gp120-gp41接口。aAb1245-BG505-8ANC195结构的表征。蚕豆在卡通中显示，BG 505作为表面显示，而糖罐显示为棍子。在BG 505中，gp 120为浅灰，gp 41为深灰色。Ab1245 VH-五L深粉红色(重链)和浅粉色(轻链)；8ANC195法布为深绿色(重链)和浅绿色(轻链)。b侧视图(左)和从密度图的三聚体基(右)向上看3.7ab1245-BG505-8ANC195建筑群。颜色如(a). cAb1245 V近景H-五L域(卡通)与gp120-gp41交互与突出显示的CDRH 3(青色)接口。N链糖聚糖为浅灰(Gp 120)、深灰色(Gp 41)或黄色(N88)。Gp 120和N 241Gp 120球体。dVRC 34-AMC 011 SOSIP结构(PDB6NC3)的动画表现形式与c(左)相同，与三聚体(右)不同。VRC 34重链和轻链(PDB6NC3)分别为深紫色和浅紫色。
Ab1245-BG505-8ANC195复合物结构在Ab1245和8ANC195的gp120-gp41界面上显示了不重叠的表位(图1)。2A，b)。Ab1245 fab位于其主原生质体的gp 120和gp 41与相邻原生质体的gp 41之间的界面上(图1)。2C, 3A)。相反，8ANC195识别单个原生质体的gp120-gp41界面，而不与相邻的原生动物接触(图1)。2A, 3A)，以及与三位BG 505原始人的等效交互作用26。Ab1245表位与vrc 34的表位重叠，vrc 34是一种fp导向的bNAb，它在离三聚体基更近的位置上与三聚体三聚体化学计量比(Fab)结合。6比Ab1245表位(图1)更重要。二维空间；补充图。2A)。Ab1245重链使大多数接触BG 505(只有三个轻链残基接触BG 505)，19个重链和轻链接触残基中除一个外都位于CDRs内，而不是抗体框架区(FWRs)(图1)。1B, 3B)。Ab1245CDRH1和CDRH 2环在残基Pro79之间与gp 120部分形成广泛的相互作用。Gp 120和Glu87Gp 120(无花果)3C)，而长(24-氨基酸)cdh 3环与gp 41残基以及gp 120末端的残基相联系，这些残基都符合先前定义的膜近端环。14(无花果)三维空间)。AB 1245轻链与相邻gp 41亚基的末端螺旋发生了接触，该亚基的构象从螺旋转变为部分无序的非结构区域，表明gp 41螺旋构象有可能空间干扰结合，这也是人类bNAb 3BC315与BG 505 Env三聚体相互作用的建议。29(无花果)3A，e)。Ab1245 Fab与BG 505接触的大部分是蛋白质残基，唯一的糖聚糖接触涉及抗体重链的第三个FWR(FRWH3)与Asn 448上的最终糖。Gp 120甘露聚糖(图1.3A)。相比之下，8ANC195表位包括与Asn 276残基所需的糖聚糖接触。Gp 120和Asn 234Gp 12026,30，vrc 34表位包括在残基Asn 88处与糖聚糖的接触。Gp 120和Asn 241Gp 1206(无花果。3A, 二维空间)。N-糖链附着在Asn 611上的可能性Gp 41与连接在Asn 611上的一种GlcNAc的密度相比，Ab1245结合原生质体上的此糖链缺乏密度，从而提示Ab1245 fab结合。Gp 41其他两个原生质体上的残基(附图)。2B)。然而，只有一种Ab1245 Fab与可溶性BG 505结合在一起。N611A三聚体(图1.1D)，这意味着Asn 611的存在Gp 41甘氨酸不能解释Ab1245与Env三聚体的亚化学计量比结合。
图3：Ab1245 CDRH 3使大部分接触BG 505环境。aBG 505三聚体的表面表征，颜色突出显示Ab1245的表位(浅色和暗粉红色，CDRH 3的接触点为青色，粉红色为糖胶接触点)和8ANC195(绿色，绿棒代表表位内的糖聚糖)。不属于表位一部分的糖聚糖被显示为灰色棒。bAb1245的卡通表示，附属物残馀原子显示为彩色球体。cGp 120与Ab1245CDRH1和CDRH 2环(暗粉色球)的相互作用。Gp 120是灰色的，与Ab1245的接触用橙色突出显示。Gp 120触点的侧面显示为棍棒。Ab1245表示如下(b). dAb1245CDRH3(青色球)与gp 120(浅灰)和gp 41(深灰色)的相互作用。接触残留物为橙色，文中讨论的侧链如图所示。eAb1245轻链(淡粉色球体)与相邻gp 41的末端螺旋相接触。接触残留物是橙色的侧链显示。
Ab1245 CDRH 3包含一个gp 41模拟模体。
与fp特异性bnb vrc 34的绑定不同6或任何其他报告的hiv-1抗体，b 1245与bg 505三聚体结合，导致fp(残基512)移位。Gp 41–527Gp 41)和FPPR(残留物528)Gp 41–540Gp 41)的第一原生质体中的gp 41亚基，它与Ab1245结合在一起(如图所示)。4A，b)。FP/FPPR位移是Ab1245CDRH3嵌入的结果(图1)。4A)。尽管HR1N(547)的gp 41残基Gp 41–568Gp 41)在Env三聚体的结构中(除非界面抗体被结合)，这个区域的N-末端残基，520，通常是无序的。Gp 41–546Gp 41，无论Env是否与gp120-gp41界面抗体络合(例如：gp120-gp41)。31,32)。在ab1245-bg 505配合物结构中，没有观察到跨越512的残基的密度。Gp 41–565Gp 41在AB 1245被束缚的初级gp 41上，gp 41的两个区域都无序。这种紊乱是由AB 1245结合造成的，因为残基520。Gp 41至546Gp 41在两个相邻的gp 41亚基中解析。4B，补充图。2C).
图4：Ab1245CDRH3模拟gp 41与色氨酸卡环的相互作用。aAb1245V之间交互的卡通表现H-五L结构域(粉红色，含cdrh 3的青色)和gp 41的色氨酸扣带(gp 41为深灰色，色氨酸残基为623)。Gp 41, 628Gp 41，以及631Gp 41(深蓝色)，gp 120为浅灰。M100c间的相互作用残基强生色氨酸卡环显示为棍子。b图示gp 41的未结合原生质体与gp 41中含有融合肽(红色)和融合肽近端区(FPPR，Green)的部分与gp 41色氨酸扣扣相互作用的相同视图(与(a))。M 530之间的相互作用Gp 41色氨酸扣呈棍子状。cGp 41(深灰色)和gp 120(浅灰)的表面表征，色氨酸卡环残基呈深蓝色。Ab1245CDRH3是带有Met100c棒表示的青色。强生旁白。dIggsAb1245或N6体外中和试验66(中和阳性对照)对指示的病毒株。除所列菌株外，B 1245在最高浓度为500 g/mL或1000 g/mL的条件下，对来自CE 0217、CNE 55、JRCSF、DU 422、T 250-4、TRO、X 1632、246 F3、CH 119、CE 1176、BJOX 002000_03_02、25710、X 2278、CNE 8和398F1的假病毒进行了室内检测。N6没有根据破折号指示的菌株进行评估，因为它的中和效力已经公布。66。鉴于N6对评估菌株具有预期的中和能力66，AB 1245无中和活性。
Ab1245-BG505-8ANC195结构中的gp 41残基之一，Met530Gp 41，通常插入到由Trp 623残基形成的gp 41‘色氨酸卡环’中。Gp 41、Trp 628Gp 41，以及Trp 631Gp 4114,15(无花果)4B)。色氨酸卡环被认为是稳定Env三聚体在其封闭的预融合构象和它的CD4结合的开放构象的关键相互作用，并且有人推测Met530的脱离接触。Gp 41从色氨酸卡环引发HR1伸长到全长螺旋和插入宿主膜所需的fp的大重排。14,15。然而，AB 1245绑定到的原始原生质体包含一个脱离接触的Met530。Gp 41，但采用了封闭的、预融合的三聚体的大多数结构特征(图1)。2A，b)。Ab1245结合的BG 505与其他封闭的Env三聚体结构变化有限，包括gp 41 fp和fppr区域紊乱，gp 41末端螺旋结构向非结构二级结构过渡，n88移动。Gp 120N 611的糖聚糖和密度的缺失Gp 41甘露聚糖(图1.4A；补充图。2B，c)。AB 1245结合BG 505三聚体在密闭构象中的稳定性Gp 41通过插入Ab1245CDRH3残基Met100c使色氨酸卡环合理化。1245 HC，在gp 41色氨酸卡环中模拟env残基Met530。Gp 41(无花果)4A，c).
一些hiv-1 gp 120-gp 41界面结合抗体在孵育30分钟至数小时后，诱导环境三聚体解离为原生质体。29,33。推测gp 41色氨酸卡环内残基的破坏是这些抗体诱导三聚体解离的机制。29,34,35。的确，Met530Gp 41，它是ab 1245结合所取代的无序gp 41区域的一部分，被认为是介导gp 41动力学的一个重要的锚定残基。36。然而，我们发现在Ab1245-BG505-8ANC195复合物的低温-EM结构中，Env三聚体没有被分解成原生质体，该复合物是在BG 505与Fabs共同孵育一夜后得到的，也没有表明SEC-MALS有解离的原生质体(见图)。1C)。我们假设Ab1245破坏色氨酸卡环不会导致三聚体解离，因为它插入了cdr 3残基Met100c。1245 HC模拟gp 41 Met530Gp 41稳定色氨酸的卡环构象(图。4A-C).
Ab1245 IgG非中和性
虽然Ab1245 FAB绑定到BG 505 SOSIP Env(图1.1C，d我们观察到BG 505假病毒在Ab1245 IgG浓度高达1mg/mL时未被中和(见图)。4D)。此外，我们观察到Ab1245Fab在浓度高达100μg/mL时对8株假病毒没有中和作用。Ab1245表位的位置及其与BG 505 SOSIP结合的角度预测，病毒膜不存在空间位阻(图1)。2A，b)。由于膜结合和SOSIP端三聚体的构象是相似的。37,38,39，Ab1245缺乏中和不能归咎于AB 1245不能在病毒上与Env三聚体结合。
最近的一篇报道描述了rm20e1，一种从bg 505免疫的NHPs中分离出的抗体，它中和了n611A。Gp 41变异株bg 505，而非野生型bg 505。40。与ab 1245一样，RM20E1在与Ab1245表位重叠的表位上与BG 505 SOSIP亚化学计量学结合，但不取代FP或FPPR。以确定Asn 611是否Gp 41甘氨酸能干扰BG 505的AB 1245中和或在此位置含有甘氨酸的病毒株，我们还评估了AB 1245对BG 505的中和作用。N611A在611位置缺乏png的其他8株hiv-1株Gp 41。我们观察到Ab1245 IgG对任何病毒株在阳性对照IgG呈中和作用的情况下均无中和作用(如图1所示)。4D).
事实上，AB 1245是由SOSIP免疫原激发的，这意味着在其他疫苗试验中，不中和的gp 41模拟抗体可以被提高。Ab1245允许gp 41模拟的重要特性包括一个长的CDRH 3，其中一个蛋氨酸大致位于中间(Met100c)。1245 HC是24个氨基酸中的第11个残基。蛋白质数据库的检索41对于具有Ab1245CDRH3特征的Fab结构(22-26残基长度和7-13位置的蛋氨酸)，1657个具有这些特征的Fab结构(PDBs5CEZ、6E4X和2XTJ)显示出三个。然而，这些FAB的CDRH 3的构象并不像Ab1245 CDRH3的构象。由于Ab1245模拟gp 41所需的特征是罕见的(即在其他抗体结构的调查中未发现)，Ab1245 CDRH3特性(~24位残基CDRH 3，位于11位的蛋氨酸)可用于筛选激发的抗体序列，以鉴定可能非中和的Ab1245类抗体。此外，Ab1245-BG 505复合结构还可为SOSIP免疫原的工程提供参考，以防止围绕Met530的fp和fppr残基发生位移。Gp 41.
我们的结果表明，Ab1245至少与某些病毒毒株(如BG 505)结合，但不影响进入靶细胞。由于在不破坏CD4结合的位点上，每个Env三聚体中只有一个ab1245 fab结合，因此env三聚体仍应能够进行CD4诱导的构象改变。42,43,44,45允许协受体结合并随后将一个或两个三聚体FPs插入宿主细胞膜。这促使人们猜测，融合只需要将三个FPs中的两个插入到目标膜中。然而，也有可能是第三个FP，它是取代Ab1245结合，是无序的Ab1245-BG505结构(图一)。4A)，即使Ab1245结合，也能进入宿主细胞膜并插入自身，从而使每一个Ab1245结合的Env三聚体的三个FPs都能在膜融合中发挥作用。另外，Ab1245可能与病毒结合的Env三聚体在与CD4的相互作用中解离，为其缺乏中和活性提供了另一种潜在的机制。
本文报道的Ab 1245的特性表明，针对FP表位的中和抗体必须与FP直接结合，以防止它插入宿主细胞膜。因此，fp和fppr通过ab 1245等抗体通过gp 41模拟的位移可能不会导致中和。然而，通过阻断中和抗体，如vrc 34，一种直接与fp相互作用的抗体。6通过与HIV-1 envs、Ab 1245等抗体的结合，可以作为诱饵，保护Env上保守的表位不受中和抗体的影响。
