NF-κB在正常妊娠和宫内发育迟缓孕妇免疫中的调节作用

宫内生长受限(IUGR)是围产期死亡的主要原因，没有有效的治疗方法，在全球范围内影响5-10%的妊娠。抑制促炎Th1/Th17免疫是妊娠成功的必要条件。然而，在IUGR中，炎症反应增强，对导致这种异常的机制了解有限。母体T细胞的调控是由核因子Kappa B p65(NF-κB p65)驱动的，我们以前已经证明，P65在母体T细胞中的降解是由Fas激活引起的。表达Fas配体(FasL)的胎盘外显子在妊娠期间具有免疫调节作用。本研究的目的是探讨成功妊娠所需的NF-κB调节机制和来源，以及是否在IUGR中废除这一调节机制。应用流式细胞术，我们证明p65+Th1/Th17细胞在正常妊娠时减少，而在IUGR期间没有减少，这种表型在非妊娠T细胞与正常母体血浆共同培养时得到加强。我们还发现，与正常妊娠相比，IUGR血浆中分离的外体FasL表达减少，数量减少。在这项研究中，我们强调了FasL的潜在作用。+异位小体可调节孕期T细胞中NF-κBp 65的表达，并可能是导致P65调节失调和炎症反应的第一证据。

宫内生长受限(IUGR)是导致胎儿发病的第二大原因，仅次于早产。1。没有已知的治疗IUGR，早期分娩仍然是唯一可行的治疗IUGR。然而，早产会给婴儿带来很大的风险，并可能导致儿童和成年期的慢性疾病，如胰岛素抵抗、肥胖、心血管和肾脏疾病。2,3,4,5,6。IUGR的确切原因尚不清楚。然而，了解孕妇在怀孕期间免疫适应的作用，对于制定预防IUGR等与妊娠相关的病理疾病的新策略具有重要意义。7,8,9,10,11,12,13.

正常妊娠过程中，T-助手(Th)1向Th2偏倚转变，导致母血免疫耐受和抑制。14。相反，妊娠并发症如反复自然流产和子痫前期(PE)与Th1细胞因子增加有关，包括白细胞介素(IL)-6、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(α)。15,16,17,18，可以作为妊娠病理的标志。19。正常妊娠还需要增加免疫抑制性Treg/Th17比值，这一现象的突出表现是合并了类风湿性关节炎和多发性硬化症的妇女在妊娠晚期自身免疫症状的改善；以Th17增加和Tregs减少为特征的疾病。20,21,22。与Th1/Th2相似，报告了妊娠并发症PE和反复自然流产中Th17/Treg亚群的不平衡。23,24。因此，了解正常妊娠时T细胞亚群间免疫平衡的调节机制，有助于阐明IUGR等并发症时的免疫状况。

核因子Kappa B(NF-κB)在调节T细胞的发育和分化为效应细胞亚群中起着不可或缺的作用。NF-κB由5个亚单位(p50、p65/rela、c-rel、p52和relB)组成，被多种刺激激活，导致细胞因子、粘附分子、细胞周期调节因子和细胞存活因子等基因的转录。NF-κB信号异常与多种人类疾病相关，包括癌症、慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病，如RA和MS。25,26。有限的体外和体内研究让我们深入了解NF-κB在妊娠期间的作用(载于SakowiczA.2018)。27)。因此，NF-κB在人类怀孕期间的作用还不清楚.我们以前已经证明，调节Th1反应的p65亚基28和Th17细胞的分化29，在CD3中减少。+妊娠全过程T细胞30。研究还发现，p65在CD3中的表达受到抑制。+T细胞抑制Th1转录因子Tbet31，以及抑制刺激佛波酯引起的Th1、γ、IL-2和TNF-α细胞因子的产生。32。NF-κB调节T细胞功能相关基因的转录，如Th1分化和克隆扩张。33，和Th17分化34怀孕期间T细胞p65的减少可能解释了为什么正常妊娠中存在Th2/Treg偏倚。鉴于这些结果，单个T细胞亚群中p65表达的改变可能是妊娠期间观察到的T细胞功能变化的原因。同样，不能下调NF-κB可能会导致炎症性T细胞反应的增加与不良妊娠结局如IUGR有关。

虽然调控母细胞p65抑制的机制尚不清楚，但Fas/FasL信号通路可通过caspase降解调节p65的抑制。35,36。我们以前在Jurkat T细胞中的数据显示，Fas的激活降解了p65和T细胞受体跨膜蛋白CD3ζ，两者都是T细胞生存和功能的重要组成部分。37。此外，据报道，在孕妇血清中，CD3ζ表达缺失，从血清中分离出膜片段为FasL。+ 38。这些因素共同作用于血浆可溶性因子在调节母细胞p65表达和反应中的作用。怀孕期间，FasL+母体血浆中存在的微泡介导细胞凋亡，作为免疫保护机制之一39。外显子是一种小的分泌细胞外小泡(Esv)的亚型(30-150 nm)，已知具有影响细胞通讯的生物学功能，尤其是在癌症的进展过程中。40。由于外体的浓缩，在妊娠的整个过程中都会增加。41胎盘外显子表达FasL42外胚体可能在维持妊娠成功方面起着重要作用。然而，它们在妊娠并发症进展中的确切作用机制尚不完全清楚。

本研究假设妊娠成功所必需的母体T细胞表型的改变是通过抑制p65来调节的，并且可能是由母体血浆中的EVS介导的。

样本队列

收集健康非妊娠妇女(NP；n=11)、孕晚期正常孕妇(P；n=12)和孕晚期IUGR孕妇(IUGR，n=8)的全血。健康的NP妇女处于生殖年龄(21-38岁)，不使用口服避孕或合成激素，在月经周期的排卵前阶段(月经后7-14天)收集全血。正常的晚期妊娠被定义为不受PE、IUGR或任何其他重大医学疾病影响的孕妇，而不是任何形式的药物治疗。IUGR妊娠被定义为不受子痫前期影响的妊娠，出生体重<10百分位数的妊娠年龄，根据按国家出生体重百分位数调整的性别分类数据。43，伴有异常的脐动脉多普勒血流，定义为舒张末期无血流或反向血流。2/8例IUGR患者服用皮质类固醇(倍他米松)。参加这项研究的所有孕妇均为无效。这项研究得到了澳大利亚悉尼皇家北岸医院悉尼地方卫生区人类研究伦理委员会的批准(编号：1201-046 M)。所有实验均按照相关指导原则和规定进行。

PBMC、血浆和外显子的分离

采用Ficoll-Paque密度离心法从肝素锂管血中分离PBMCs，用流式细胞仪对NP、P和IUGR孕妇进行检测。血浆样品经389×离心得到。g在22°C下持续15 min，不加减速。用血浆培养PBMCs进行流式细胞仪分析，用NanoSight法测定EV浓度。根据制造商的协议，采用大小排阻色谱(SEC)柱(新西兰iZon Science)从血浆中分离出外显子。简单地说，等离子体在冰上解冻，然后以2,000×离心机离心。g持续20分钟，其次是12,000×g在4°C作用45 min，去除细胞碎片。柱用PBS洗涤，流速作为柱清洁度的衡量指标。随后，在柱顶加入0.5mL的等离子体，并在柱上加盖PBS，以防止过滤器干燥。在1.5mL微离心管中收集多个0.5mL的洗脱液，通过Sepharose基质进行分离。通过纳米粒子追踪分析(NTA)和纳米粒子追踪分析(NTA)，分别收集并测定了颗粒的浓度和纯度。

用纳米粒子追踪分析(NTA)鉴定血浆衍生囊泡

为了确定血浆中小泡的数量及其大小，在PBS(1：10,000)中稀释的血浆样品按照制造商的指示使用NanoSight NS 300(英国马尔文仪器公司)进行NTA。在自动设置下拍摄了3个60年代的视频，以确定每毫升颗粒和平均粒径.粒子浓度和粒度分布被自动分析用纳米粒子追踪分析软件3.2版。

细胞培养与刺激

从NP、P和IUGR妇女中分离出PBMC，在0.5×10条件下培养。6在含苯酚、10%(v/v)热灭活胎牛血清(FCS)、100 IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中细胞/ml。细胞在37℃下加湿培养，加5%(v/v)CO。2。为比较T细胞表达特异性细胞因子的百分率，在37℃下用50 ng/mL PMA和500 ng/mL离子霉素(10 ng/mL)刺激PBMC 4 h，流式细胞仪检测。为评估表达p65的T细胞亚群的差异，在分离PBMC后立即用流式细胞仪对分离的PBMCs进行分析。

流式细胞术细胞染色

用流式细胞术检测T细胞亚群中细胞因子和p65的含量，用单克隆抗体和相应的同工型对照进行滴定，以确定最佳染色浓度(补充表1)。细胞离心，上清液丢弃，再悬浮于含有合适细胞表面抗体或同类型对照的荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液(PBS和0.1%BSA)中：抗CD4/8 FITC或抗CD 95 PE-Cy5。细胞在4℃黑暗中孵育30 min，然后用FACS缓冲液冲洗。保留染色用FACS固定液(含0.1%BSA和1%PFA的PBS)固定。固定后，用FACS缓冲液洗涤细胞，再悬浮于FACS渗透缓冲液(含0.1%BSA和0.1%皂甙的PBS)。细胞渗透后，在流式细胞术渗透缓冲液中加入适当的细胞内蛋白抗体：抗Tbet/GATA 3/RORγt/FOXP 3 AlexaFluor 647；抗IL-2/IFN-γ/IL-4/IL-17/TGF-βPE(均来自BD药物)；或抗NF-κBp65 PE(BioLegend)。细胞在4℃黑暗中孵育45 min，然后用FACS PERM缓冲液洗涤，再悬浮于FACS缓冲液中进行流式细胞仪分析。

流式细胞术

流式细胞术用FACSCalibur流式细胞仪进行，使用Flowjo软件Version 10(Becton Dickinson)。每个样本大约收集了10,000个淋巴细胞事件进行分析。根据PBMCs的大小和粒度，分别用正向散点图和侧散点图对PBMCs中的淋巴细胞进行鉴定。CD4门控后+或CD8+T细胞来自淋巴细胞群体，表达细胞内蛋白(细胞因子或p65)的百分比采用设置象限法，以未受刺激的细胞作为细胞因子分析的生物学阴性对照，或非培养细胞的相对同型对照进行p65分析。从这个门控群体中，用转录因子阳性来描述T细胞亚群.

WESTERNBLOTTING

分离的外小体颗粒在RIPA缓冲液中进行裂解，并进行Westernblotting。在10%(w/v)sds-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质样品，并将其转移到硝化纤维素膜上。30。用抗肿瘤易感基因101(TSG 101)(1：500，Santa Cruz)和FasL(1：1000，Santa Cruz)的原始抗体(补充表2)进行印迹检测。GAPDH(1：1000，Bio-Rad)作为加载控制.用与HRP(1：1000，Bio-Rad)结合的特异性二次抗体检测抗体结合，并以Luminata Classico WesternHRP底物(Merck-Milli孔隙)作为观察蛋白条带。每个印迹使用预混合试剂，利用ImageQuant LAS-4000发光图像分析仪显示蛋白质(GE Healthcare，澳大利亚)。密度测定用Image-J数字软件版本1.8.0进行，对甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的兴趣带进行了标准化分析。

统计分析

为比较妊娠队列，采用非参数Kruskal-Wallis与Dunn‘s多次比较试验，由于样本数量少(n=8-12)。所有数据均以中位数和四分位数区间表示(IQR；Q1=25和Q3=75百分位数)。统计意义被接受时p值<0.05。

妊娠期淋巴细胞中Th1和Th17细胞因子生成的变化

我们的小组和其他研究表明，Th1和Th17反应有明显的抑制作用，而与正常妊娠相关的Th2反应增加，而取消这些改变会导致病理性妊娠。24,31,44,45,46,47,48。为了在我们目前的患者队列中证实这些发现，采用流式细胞仪检测了NP、P和IUGR妇女淋巴细胞中细胞因子的产生情况。P组淋巴细胞表达促炎细胞因子的比例明显低于NP组(IL-2组：P<0.05)。p=0.04；干扰素-γ：p=0.03；和IL-17A：p=0.04)，但未用IUGR表示(见图)。1)。IUGR期间缺乏这些变化，这与以往的报告一致，即妊娠成功的特点是Th1/Th17细胞因子的分泌减少，而这种反应的损害导致包括IUGR在内的病理性妊娠。44,45,49。与Np相比，P中IL-4水平无明显变化，但在IUGR期间，IL-4水平较正常对照组显著降低(P<0.0 5)。p=0.01)(图1。1).

Th1和Th17在正常妊娠期间下降，但在IUGR中没有下降。

我们的数据显示，在正常妊娠期间，淋巴细胞对促炎细胞因子的调节明显降低，而IUGR则未观察到这些变化。此外，与NP相比，P淋巴细胞中p65水平降低，IUGR淋巴细胞中p65水平升高，这些变化引发了p65调节是否影响T细胞分化的问题。为了确定这一点，我们首先评估了转录因子在CD4中的表达。+和CD8+T细胞，并比较他们在我们的队列中的表达。

测定正常妊娠和IUGR妊娠时T细胞亚群的基本分布(即不受PMA刺激)。由于转录因子的表达与CD4或CD8的谱系无关，而是由两者共同表达。50，T细胞亚型被定义为：+特贝特+(Th1)；CD8+特贝特+细胞毒性1型(Tc1)；CD4+GATA 3+(Th2)；CD8+GATA 3+CD4+RORγt+(Th17)和CD4+Foxp 3+(图文)2)。与NP相比，P细胞中Th1和Th17细胞显著减少(Th1：p=0.03；Th17：p=0.005)。此外，与P相比，IUGR中Th1和Th17细胞显著增加(Th1：p=0.03；Th17：p=0.001)。Tc2细胞NP与P无明显差异，但IUGR较P显著升高(P<0.01)。p=0.008)。提示在IUGR中，促炎辅助T细胞亚群Th1和Th17与P.

P65在妊娠期外周血单个核细胞亚群中的表达低于IUGR。

我们以前曾报道过与np对照相比，孕妇PBMCs中p65的表达受到抑制。30,51，表明p65调节可改变细胞因子的产生。由于异常的细胞因子的产生与IUGR的妊娠有关，我们下一步将确定p65在IUGR中的表达是否也是异常的，这将解释IUGR细胞因子产生的变化。用FSC和SSC谱法测定p65在PBMC和淋巴细胞中的表达率。3a)。P65的百分比+与NP相比，P淋巴细胞和PBMCs细胞明显减少(P<0.05)。p=0.03和p分别=0.006)(图1。3(B)与我们先前公布的数据一致51。相反，p65的数量要大得多。+IUGR妇女PBMC和淋巴细胞与P妇女比较(p=0.04和p分别为0.001)，但两者无显着性差异(图1)。3b).这表明与P相比，IUGR中的p65没有受到抑制。

正常妊娠时p65在T细胞亚群中的表达发生了改变，而在IUGR中则被取消。

为了评估p65调节的变化是否支持在正常和IUGR怀孕期间观察到的Th1和Th17亚群的变化，p65的比例。+T细胞亚群用图中所述的门控策略进行评估。4A.与基础T细胞亚群相似，p65的百分比+与NP相比，P细胞中Th1细胞减少(P<0.05)。p=0.04)，但不包括IUGR(p=0.008；图1。4b)。P65也有类似的趋势。+Th17细胞，虽然没有达到统计学意义。与基础剖面相比，p65的百分比显著增加。+与NP相比，P细胞中有Th2细胞(P<0.01)。p=0.03)，但在IUGR(p=0.04)。T细胞表型的变化与p65有关。+P65中T细胞个体数量无差异低层细胞(补充图1)。这表明在IUGR的辅助T细胞亚群中，p65与P.

与IUGR相比，正常妊娠时T细胞亚群中p65的表达发生改变.(A)流式细胞术分析CD4/CD8中p65细胞的门控策略+T细胞。(B用流式细胞术检测NP(n=11)、P(n=12)和IUGR(n=8)中Th1、Th2、Th17、Treg细胞、Tc1和Tc2表达p65的百分比。盒形图和晶须图显示表达p65的细胞的中位数和IQR。*p < 0.05, **p < 0.01,NS=非显着性，由Kruskal-Wallis与Dunn的多重比较检验确定，因为样本数量少.(C)比较了p65在促炎和抗炎CD4中的表达率。+辅助性细胞亚群：Th1和Th2，或Th17和Treg，或CD8。+Tc1和Tc2分别来自非妊娠妇女(NP)11例，正常孕妇(P)12例，合并IUGR孕妇8例。方格图和晶须图表示比率的中位数和IQR。*p < 0.05, **p < 0.01, ns = non-significant, according to the Kruskal–Wallis. (D)用线性回归分析评价转录因子调控与CD4中p65表达的关系。+和CD8+T细胞。P65表达与CD4相关+Tbet(Th1)，GATA 3(Th2)，RORγt(Th17)，FOXP 3(Treg)，CD8+Tbet(Tc1)，或CD8+GATA 3(Tc2)。非妊娠(n=11；蓝色)；怀孕(n=12；绿色)；IUGR(n=8；红色)。流式细胞术数据用Flowjo软件第10版(Becton Dickinson)进行分析；网址：Https://www.flowjo.com/.

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在怀孕期间，支持和抗炎T细胞亚群之间的平衡对于维持妊娠成功是很重要的.细胞因子促进一个亚群的分化，抑制对立亚群的分化。52,53,54,55,56,57，我们评估了p65的比率。+Th1/Th2，Th17/Treg，Tc1/Tc2(图1)。4c)。这一分析表明，p65+P组Th1/Th2比值比NP组低4倍(P<0.01)。p与P相比，IUGR=0.003)和~9倍。p=0.003)。与NP相比，Th17/Treg比值降低了3倍(P<0.01)。p=0.01)。但IUGR与P的Th17/Treg比值差异无统计学意义(P>0.05)。p=0.09)。尽管CD4+和CD8+有相同转录因子的t细胞系在发育过程中，p65无统计学差异。+Tc1/Tc2比值这提示IUGR妊娠时不能抑制Th1和Th17细胞中的p65可能与病理有关。

综上所述，这些数据导致了对转录因子表达(CD4)所表示的T细胞亚群百分比之间是否存在相关性的调查。+特贝特+)和P65的百分比+来自每个子集的T细胞(即CD4)+P65+特贝特+)。为此，对T细胞亚群中转录因子的表达与p65的表达进行了线性回归分析。4d)。Tbet表达与p65显著相关。+两种CD4的表达+(R)2=0.86，p < 0.0001) and CD8+所有患者的T细胞(R)2=0.5，p < 0.0001). Significant correlation was also seen in CD4+P65表达与GATA 3(R)之间的T细胞2=0.22，p=0.008)，以及FOXP 3(R)2=0.29，p=0.002)。然而，在这两种情况下的显着性都显示出较低的R-平方值，表现出很高的变异性，这可能会影响这一预测的真正精度。P65在CD4中的表达与rorγt表达无显著相关性。+T细胞或GATA 3在CD8中的表达+T细胞。这些发现共同证明了CD4+Th1和CD8+Tc1的分化通过Tbet的转录调控，依赖于p65的表达。因此，这突出了在怀孕过程中严格规定P65的要求，以便为怀孕成功提供环境。

妊娠期孕妇免疫细胞Fas表达变化

虽然调节母T细胞p65抑制的机制尚未建立，但据报道Fas活化可通过caspase降解调节p65的抑制。35。在Jurkat T细胞中，我们和其他人已经证明了特定的Fas激活和FasL+EVS降解p65和T细胞受体跨膜蛋白CD3ζ，这两种蛋白对T细胞的存活和功能都是不可或缺的。37,38。因此，我们检测了P，NP和IUGR妇女中Fas的表达，在PBMC、淋巴细胞、CD4中的表达无显着性差异(P>0.05)。+或CD8+任何一组患者之间的T细胞(补充图2)。

健康母亲血浆改变p65+T-单元子集

我们以前已经发现母血血浆改变p65在p65中的表达，从而分离的母细胞ev对T细胞p65的抑制作用大于np血浆中的tv，而在超离心后从母血浆中去除evs则阻止了p65在T细胞中的调节。37。虽然P细胞和IUGR T细胞的Fas表达也没有变化，但接下来我们将评估p65抑制的来源是否是由于母体血浆中的EVS所致。37,38以及哪个T细胞子集被调制。用20%(v/v)的20%(v/v)非孕、孕和IUGR孕妇血浆分离培养72h，用流式细胞仪进行检测。P65的数目+与NP血浆相比，NP妇女PBMC在P血浆中培养时，Th1和Th17细胞显著减少(Th1：p=0.03；Th17：p=0.03)(图1。5a)。相反，p65没有显着性差异。+NP妇女PBMC在IUGR血浆中培养时，Th1或Th17细胞与P血浆比较。此外，NP妇女外周血单个核细胞在IUGR孕妇血浆中培养的T细胞亚群与NP孕妇血浆相比，差异无显着性(P>0.05)。IUGR血浆显著降低p65含量+NP妇女PBMC中Th2细胞与P血浆的比较p=0.005)(图1。5a)。母体血浆除了改变T细胞表型外，还能改变Th1/Th2和Th17/Treg比值。P65显著下降10倍。+NP妇女PBMC对P血浆的Th1/Th2比值与NP血浆比较(p=0.02，与P血浆相比，IUGR血浆的反应增加了15倍(p=0.02)(图1。5b)。同样，p65+与NP血浆相比，P血浆中Th1/Th17比值降低(P<0.01)。p与P血浆相比，IUGR血浆反应显著增加(P=0.03)。p=0.03)(图1。5b)。这些结果表明P血浆具有调节T细胞表型的能力，而IUGR孕妇血浆调节p65表达和随后T细胞表型的能力有限。提示IUGR孕妇血浆中存在的Ev表型在病理妊娠中可能存在差异。

与正常妊娠相比，IUGR血浆中的血浆衍生囊泡减少。

为了阐明正常妊娠和IUGR妊娠时血浆中EVS是否存在差异，对NP、P和IUGR孕妇血浆中EVS的数量进行了量化。

虽然P或IUGR血浆中EVS的总数与NP血浆相比没有显着性差异(图1)。6(A)IUGR血浆中EVS含量低于P血浆(p=0.03)(图1。6A i)。此外，与NP和IUGR血浆相比，P血浆中体积在30~150 nm范围内的外小体显著增加(P<0.05)。p=0.04和p=0.03；图1。6A、II和6B)。采用westernblot分析进一步鉴定了分离的血浆外小体，以确定FasL的表达。TSG 101的表达证实了外显子的存在。6c)。P组FasL表达较NP组明显升高4倍(P<0.01)，IUGR组明显高于NP组(P<0.01)。p=0.02；图1。6CⅡ)，而TSG 101表达无统计学意义。此外，IUGR妊娠的外显子FasL蛋白表达明显低于P对照组(P<0.01)。p=0.03；图1。6C(二)。确定FasL表达减少是否归因于TSG 101的减少+FasL在IUGR中的表达与P相比有显着性差异(P<0.05)，FasL的表达与TSG 101相比有显着性差异(P<0.01)。6(2)FasL/TSG 101的表达与P相当，大于NP(图1)。6C三)。其中缺乏足够的FasL+母体血浆外小体可能是IUGR妊娠T细胞分化被取消的原因之一。

母亲免疫系统在维持妊娠成功方面起着至关重要的作用，但控制这一现象的机制尚不完全清楚。在本研究中，我们证明正常妊娠时Th1和Th17细胞因子的抑制作用在妊娠合并宫内发育迟缓时减弱，而NF-κB的抑制作用也同样减弱，这是一种调节T细胞免疫各方面功能的分子。此外，我们还展示了FasL的作用。+调节T细胞中p65的外小体，并提供第一证据表明异常的外体产生可能是与IUGR相关的免疫异常的基础。研究表明，维持妊娠是通过减少Th1和Th17细胞因子的产生来实现的。24,44,45,46,47,48Th1和Th17细胞因子的过度分泌可能是子痫前期、反复妊娠丢失和着床失败的原因之一。45,46,48,58,59,60。本研究发现妊娠晚期妇女外周血淋巴细胞Th1细胞因子IL-2和IFN-γ较正常妊娠组明显降低(P<0.0 5)。有针对性的是，在IUGR期间缺乏这些变化。这些发现证实了以前的报道，即妊娠成功的特点是Th1/Th17细胞因子的产生减少。44,45,49，而损害这一反应有助于IUGR。妊娠期细胞因子环境的抑制与PBMC和淋巴细胞p65的抑制有关。这意味着，在怀孕期间，而不是完全抑制p65，达到了一个临界水平的抑制，以看到在母亲的T细胞的作用。这可能是对胎儿抗原耐受的关键机制，最终防止与妊娠相关的病理并发症。这一观点得到了一份报告的支持，该报告显示p65的磷酸化程度决定着NK细胞的反应程度。61，T细胞也可能是如此。有趣的是，为这项研究招募的2/8 IUGR妇女服用倍他米松是为了减少严重早产儿出生的风险。尽管这些患者接受了免疫抑制剂的治疗，但正常妊娠和IUGR病理妊娠的细胞因子谱仍有差异。总之，与IUGR相关的炎症细胞因子环境也与PBMCs和淋巴细胞缺乏P65抑制有关，提示胎盘可能在IUGR期间支配母体免疫环境。

鉴于PBMCs和淋巴细胞中P65在正常妊娠和IUGR中的表达存在着关键差异，这与细胞因子谱的改变有关，本研究的另一个目的是确定哪些细胞类型在妊娠中显示p65减少，以及在IUGR期间是否受损。我们观察到p65的绝对数目显著减少。+正常妊娠时Th1细胞与NP妇女相比较，与激活后Th1细胞因子的产生相一致。这一数据与以前的报告一致，表明NF-κB与Th1细胞因子产生之间的联系。62，以及我们小组先前发表的数据，显示nf-κB易位的抑制导致np T细胞产生Th1细胞因子的减少。30。此外，我们的研究还显示p65和Tbet表达之间存在明显的相关性，从而突出了该途径在介导Th1免疫应答中的优先作用。尽管在本研究中观察到白细胞介素-17a的产量下降，但p65并没有减少。+Th17细胞有证据表明，p65参与了Th17的分化，而p65缺失的T细胞对IL-17基因的表达和Th17细胞的分化均有影响。34然而，一旦细胞分化为Th17表型，p65的激活就不再需要--表明它在分化中的作用，而不是特定于谱系的功能。除了观察到p65的下降+Th1+妊娠期细胞，P65增加+同时观察到Th2细胞。如证据所示，p50调节GATA 3的表达，而不是p65。63这一增加可能反映了在本研究中未评估的极化Th2细胞缺乏p65活化。此外，P65缺乏变化+Foxp 3+细胞提示，在怀孕期间，Treg细胞的转录调控可能不受p65的调控。然而，以前已经证明，nf-κB p65和Treg相关基因(如foxp 3)有一个特定于Treg家族的直接作用。64,65,66。尽管我们的结果没有显示出对p65的直接影响+FOXP 3细胞在怀孕期间，我们的数据显示p65和FOXP 3之间存在高度的正相关，提示p65对Treg的调节有潜在的作用。但其他典型的NF-κB亚基也可能调控Tregs的谱系特异性转录因子，如FOXP 3。这得到了其他证据的支持，表明c-rel而不是p65通过增强foxp 3的表达在Treg细胞的分化中起着更重要的作用。67,68。此外，p65的表达与妊娠期Th1/Th2和Th17/Treg免疫反应的比值降低之间的相关性(在IUGR期间未观察到)表明，淋巴细胞在IUGR期间向Th1和Th17促炎型分化，而Th1则是通过p65的异常调节而介导的。

目前，控制P65对妊娠成功的必要抑制的机制或来源尚未确定。我们已经证明Fas激活抑制了Jurkat T细胞中p65的表达，而p65的表达被Fas灭活抗体ZB 4所逆转。37。此外，在怀孕期间，T细胞中Fas的表达也增加了。47这可能是消除T细胞对胎儿抗原反应的机制之一。这与本研究的结果形成鲜明对比，因为在基础条件下，PBMC、淋巴细胞或T细胞中Fas的表达没有明显差异。妊娠期Fas表达缺乏的原因可能是抵抗过度凋亡和T细胞丢失的一种机制，因为母体T细胞也需要增强对微生物和细胞内病原体的免疫反应，而不仅仅是对胎儿的免疫耐受。因此，推测Fas表达的可得性并不决定怀孕期间p65的调控。由于p65的下调是妊娠特异性的，而且胎盘在母亲和胎儿之间的相声中起着至关重要的作用，因此胎盘产生的因素可能表达FasL，并能影响p65的调节，从而导致妊娠期间母细胞T细胞反应的改变。

细胞通讯是调节细胞内稳态的一种常见机制。明确的细胞间通讯机制包括：1)激素、细胞因子和趋化因子等以内分泌方式作用的可溶性介质；2)细胞间的直接粘附；3)通过纳米管传递信息。69,70。最近，外显子被认为是细胞间通讯的有力促进者。71。在我们的研究中，我们发现IUGR孕妇血浆中的外体总数(直径30~150 nm)与正常妊娠相比明显减少。在正常妊娠和病理性妊娠中，尤其是IUGR的作用还没有得到很好的研究，但IUGR患者与正常母亲相比，循环外小体的总浓度明显降低。72，这与我们的发现是一致的。这种外生体的缺乏很可能是与IUGR相关的胎盘功能不足的结果。73,74。此外，IUGR的外小体缺乏FasL的表达，提示Fas/FasL信号的缺失可能是导致IUGR炎症增加的原因之一，本研究的数据表明这可能是由于p65表达异常所致。这表明胎盘通过产生外体来引导T细胞向合适的表型转化为妊娠成功，从而确定了外胚体在妊娠期间调节p65的功能作用。

总之，我们的研究表明，正常妊娠与抑制p65和相应的减少促炎症细胞因子的产生有关。这有助于减少Th1/Th2和Th17/Treg免疫细胞的轮廓，并且在受IUGR影响的妊娠中改变。我们的发现扩展了我们对怀孕期间外胚体的作用的认识，并建议FasL+胎盘衍生外体可以执行母胎界面进入外周循环的母体免疫适应程序。缺乏足够的FasL+IUGR孕妇血浆中的外体，加上母体血浆不能减少炎症反应，意味着外胚层体是调控孕妇对成功妊娠的反应的关键。进一步探讨IUGR期间外小体的定性特性以及胎盘外小体的产生可能会更好地揭示它们在调节母体免疫中的作用。