您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2021
Wuhan Xinqidi Biotech Co.Ltd
本企业通过iso9001质量体系认证

T调节失调FH-B-T雷姆淋巴细胞合作与不利的抗pd-1反应有关。EGFR-突变型肺癌

 二维码
发表时间:2021-10-25 15:07作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(NSCLC)EGFR)突变通过不明确的机制对Pd-1抑制剂表现出不利的反应。假设EGFR突变改变肿瘤免疫相互作用,通过单细胞转录分析比较EGFR突变体(EGFR-MT)和野生型肿瘤(EGFR-WT)肿瘤浸润淋巴细胞.我们发现B细胞,产生CXCL 13的滤泡辅助分子CD4。+T(T)FH)样细胞和组织驻留记忆CD8。+T(T)雷姆)EGFR-MT肿瘤样细胞减少。缺口-RBPJ调节网络,对T的持久性至关重要。雷姆状态,被扰动,以及T之间的相互作用FH在EGFR-MT肿瘤中,B细胞通过CXCL 13-CXCR 5轴消失.值得注意的是,T的比例雷姆-样细胞可预测非小细胞肺癌的抗PD-1反应.我们的发现表明T的损害FH-B-T雷姆三级淋巴结构形成与T调节失调的协同作用雷姆稳态与T的丢失FH-B串扰,是EGFR-MT肺癌中不利的抗PD-1反应的基础.

导言

表皮生长因子受体EGFR)突变是导致肺腺癌一种重要分子亚型的致癌性改变的主要驱动因素,在东南亚人群中占40-60%,在白种人中占10-20%。1。肺癌患者致敏-EGFREGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)作为一线治疗药物的临床应用价值1,2,3。然而,获得性耐药性不可避免地在9-18个月内发生,这是EGFR-TKIs有效性的主要限制因素。1,2,3.

程序性死亡受体-1(pd-1)抑制剂通过为非小细胞肺癌(NSCLC)患者提供持久的应答来改善生存结果。4,5,6,7。因此,这些抑制剂被用作非小细胞肺癌的一线和二线治疗。4,5,6,7。随着基于检查点抑制剂的临床试验数量的增加,对EGFR突变型(EGFR-MT)肺癌患者综合免疫治疗的兴趣也增加了。然而,最近的大规模临床试验和Meta分析数据显示,与EGFR野生型(EGFR-WT)患者相比,这些EGFR-mt患者的治疗结果并不理想,这表明EGFR-mt患者并没有受益于pd-1抑制剂。8,9,10。此外,本品还用于治疗pd-L1阳性的EGFR-TKI幼稚患者。EGFR突变没有表现出客观的反应效益。11。最近的一项临床试验报告称,抗pd-l1抑制剂(Atezolizumab)与贝伐单抗和化疗联合使用,对未通过tki的EGFR-mt患者有较好的生存效果。12。确定PD-1抑制剂在EGFR-MT患者中疗效低于EGFR-WT的机制可以指导治疗策略的制定,以改善这些患者的生存结果。

我们预测NSCLC患者EGFR-MT肿瘤的TME与EGFR-WT肿瘤的TME不同.然而,以往应用免疫组织化学(IHC)方法的研究并没有对两种肺癌亚型的TMES进行全面的比较。单细胞RNA序列分析(scrna-seq)能够对包括肿瘤在内的实体组织的细胞异质性进行高分辨率的解剖.系统比较EGFR-WT和EGFR-MT两种肿瘤的单细胞转录谱,可以发现NSCLC肿瘤分子亚型间存在差异的免疫细胞亚群,其中一些可能为临床预后的差异提供重要线索。此外,识别生物标志物和治疗靶点可以提高抗PD-1的免疫治疗水平.尽管多项scrna-seq研究已经描绘了肺癌的免疫细胞景观。13,14,15,16,EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤还没有进行系统的比较.

在本工作中,我们比较了两种肺癌分子亚型中肿瘤浸润免疫细胞的单细胞转录组,并寻找与之相关的关键细胞亚群及其分子特征。EGFR突变。我们发现B细胞,产生CXCL 13的滤泡辅助分子CD4。+T(T)FH)样细胞和组织驻留记忆CD8。+T(T)雷姆)与EGFR-WT相比,EGFR-MT细胞耗竭。T的稳态雷姆细胞与CXCL 13-CXCR 5轴间串扰FH而B细胞在EGFR-MT肿瘤中调控失调.最后,细胞毒性T的比例雷姆-表达特征估计的类似细胞对抗PD-1反应有很高的预测价值.总之,这些结果表明了T的重要性。FH-B-T雷姆淋巴细胞协同形成三级淋巴结构(TLS)抗肿瘤免疫。此外,它在EGFR-MT肿瘤中的损害导致对抗Pd-1免疫治疗的不良反应.

结果

比较scrna-seq分析显示,非小细胞肺癌中EGFR突变型肿瘤与野生型肿瘤的免疫细胞亚群存在差异。

比较两种不同的肺癌分子亚型的细胞景观EGFR我们从10例分期为IA-IIIA的非小细胞肺癌患者的肿瘤标本中制备了突变状态:5例EGFR-WT和5例EGFR-MT(补充数据)。1)。针对肿瘤浸润免疫细胞的情况,我们对CD 45进行了分类。+从肿瘤组织中提取白细胞,并使用10X基因组学技术对个别患者进行scRNA-seq(图1)。1A和补充图。斯1)。共对33,719个细胞进行了测序,其中31,887个细胞通过了质量控制(补充数据)1)。我们使用seurat v.3.0软件包对scrna-seq数据进行预处理。17并通过UMAP维数缩减将它们可视化。18。在不同患者的数据集之间观察到系统的偏差(图一)。1B)。为了纠正批处理效应,使用seurat v.3.0集成scrna-seq数据,该方法基于典型相关分析和样本间锚定数据集。17...经批量校正后,UMAP维数降低了患者的均质种群结构和突变状态。1C)。利用网络社区检测算法,我们定义了18个聚类(C0-17),它们对应于不同的细胞亚群(图1)。1D)。基于典型标记基因的表达(附图)。斯2),我们注释了主要细胞类型的集群,例如CD8。+T细胞(C0,C2,C11,C14)(附图)斯34),CD4+T细胞(C1,C3,C5,C6和C9)(附图)斯34),调节性T细胞(C4)(补充图4)。斯34),自然杀伤(NK)细胞(C13)(附图)。斯5),自然杀伤T(NKT)细胞(C7,C10,C12)(附图)。斯5),B细胞(C8)(附图)。斯6)、巨噬细胞和单核细胞(C15)(补充图1)。斯7),树突状细胞(DC)(C16)(附图)。斯8)和固有淋巴样细胞2(ILC 2)(C17)(补充图1)。斯9)。在EGFR-WT和EGFR-MT之间,许多簇的细胞分布明显不同。1E),说明两种非小细胞肺癌分子亚型在肿瘤浸润免疫细胞组成上的差异。这些簇的大部分由10名患者中的大多数细胞组成,没有对特定患者的严重偏见。然而,最小的三组细胞--C15(巨噬细胞和单核细胞)、C16(DC)和C17(ILC 2)--大多来自患者6(P6)(图6)。1F和补充数据2)。因此,我们将这些聚类排除在下游分析之外,以避免基于病人偏见的数据形成假设。

图1:肺癌标本的比较scRNA-seq分析概述。
figure1

a10例突变型或野生型EGFR肺癌标本(P1-10)scRNA-seq分析的原理图概述。b, cUMAP显示scRNA-seq数据之前(b)和之后(c)批校正。d18组(C0-17)免疫细胞的UMAP图分为主要免疫细胞类型。群集数的顺序对应于相对单元格数。用标准标记基因表达对聚类进行批注。eUMAP绘制了来自EGFR-WT(左)或EGFR-MT(右)的18组免疫细胞。f每名病人18组的细胞计数。g镶嵌图共18个簇,每个簇由EGFR-WT组和EGFR-MT组组成.红色表示丰度显著减少,而蓝色表示丰度显著增加。p-数值<0.05,\x{e76f}Pearson剩余值>4p-数值<0.0001)。这个p-马赛克图中所示的数值是从单面卡方检验中得到的.源数据作为源数据文件提供。

为了研究EFGR-WT和EGFR-MT之间15个细胞亚群(C0-C14)的比例变化,我们用Pearson残差法评估了观察到的细胞计数与每个子集的期望计数之间的偏差。r)。当残差的符号指示观察到的计数与预期计数的差值方向时,r>0和r < 0 represent augmentation and depletion compared to the expected count, respectively. We considered only subsets with r>3.5和r < −3.5 as augmentation and depletion with high confidence, respectively, for follow-up functional interpretation (see “Methods” section for a detailed description of r阈值选择)。我们使用马赛克图可视化拟合优度检验的结果,其中与预期细胞计数偏差的子集以蓝色(增强)、红色(耗尽)或灰色(无显着性变化)表示。1g)。所有子集的拟合优度也用卡方统计量(p-图的价值。1g)。我们观察到高于阈值水平的增强或耗尽(r>3.5或r < −3.5) of the cell count for EGFR-WT and EGFR-MT from eight subsets (Supplementary Data 2)。我们期望对EGFR-WT和EGFR-MT之间的差异累积亚群的成功解释将为了解EGFR-MT非小细胞肺癌患者不利的抗PD-1反应的机制提供线索。描述每种主要细胞类型(如CD8)的单个亚群+T,CD4+T细胞、Treg细胞、NK细胞、NKT细胞和B细胞),我们鉴定了一个子集的差异表达基因(Degs),与同一主要细胞类型(子集-deg)的所有其他亚组(子集-deg)和每个子集(组-deg)的EGFR-WT和EGFR-MT之间的差异表达基因(Degs)(补充数据)。3).

EGFR-MT肿瘤中细胞毒性NK细胞比例下降,而低细胞毒性NKT细胞比例增加。

NK细胞和NKT细胞是天然免疫系统的细胞毒性淋巴细胞,在激活适应性免疫系统之前提供了机体的第一道防线。虽然这些细胞具有有限的抗原特异性和较低的记忆生成能力,但它们可以通过细胞毒性分子直接杀死癌细胞。19。细胞毒性NK细胞(C13)的亚群在EGFR-MT中被耗尽,但其意义并没有超过预先确定的阈值。r=−3.34)(图3。2A)。在NKT细胞的三个亚群(C7、C10和C12)中,NKT-C7和NKT-C10在EGFR-MT中的比例显著增加(r分别=6.35和10.57;2A)。子集-DEG分析表明,在EGFR-MT中缺失的NK-C13和NTK-C12分别表达了更多的参与激活的基因。TNFRSF 18, IL2RB, CD7, CD 44, TYROBP,和TNFRSF1B)20,21,22(无花果)2B)和细胞毒性(PRF 1GZMB)23(无花果)2C)比其他子集。相比之下,NKT-C7和NKT-C10在EGFR-MT中所占比例增加,而这些亚组表达的激活或细胞毒性基因水平低于其他亚群。总之,NKT-C10在所有NK和NKT细胞亚群中可能具有最低的细胞毒性活性,因为参与激活和细胞毒性的基因的表达低于所有其他亚群(图1)。2B,c),这与EGFR-MT(r=10.57)(图1。2A)。总之,单细胞转录组分析显示NKT细胞亚群增加,与EGFR-MT激活和细胞毒性相关的基因表达相对较低。

图2:基于标记基因表达的NK、NKT和B细胞亚群特征。

aNK和NKT细胞的UMAP和镶嵌图。这个p-马赛克图中所示的数值是从片面的卡方检验中得到的.b, c与激活有关的基因表达小提琴图(b)和细胞毒性(c)NK或NKT淋巴细胞的跨亚群(H,高表达水平;L,低表达水平)。根据激活和细胞毒性相关基因的表达水平,对每个子集进行了表征。例如,NKT-C7具有低活性和高细胞毒性的特点。dUMAP和B细胞镶嵌图。e在EGFR-WT或EGFR-MT肿瘤B细胞中参与抗原呈递和处理的基因表达的小提琴图。

EGFR-MT肿瘤B细胞比例随抗原提呈减少而降低

B细胞分泌抗体中和抗原或标记肿瘤细胞,以防其他免疫细胞攻击。24。近年来,肿瘤浸润的B细胞通过形成TLS来促进肿瘤患者对免疫治疗和生存的反应,其中B细胞可以向T细胞呈递肿瘤来源的新抗原来激活它们。25,26,27,28。我们观察到与EGFR-WT相比,EGFR-MT中的B细胞明显减少(r=−6.23,图1。二维空间表明EGFR-MT肿瘤浸润B细胞的比例低于EGFR-WT.此外,我们还观察到来自EGFR-MT的B细胞的HLA基因表达水平较低(MHC I级:赫拉-丙和MHC二级:Hla-DPB 1, HLA-DRB 5,和Hla-DQA 2)和TAP 1(抗原肽转运体参与处理抗原,将呈现给MHCⅠ级)(图1)。2E)。这些结果表明,EGFR-MT中的B细胞对CD8的激活效果较差。+和CD4+T细胞的表达低于EGFR-WT,这分别是由于MHCⅠ类和Ⅱ类的低表达所致.

CXCL 13生产T的比例FH-样细胞减少,而免疫抑制性CD4细胞减少。+EGFR-MT肿瘤中T细胞增多

连同CD8+T细胞,CD4+T细胞是调节适应性免疫的主要淋巴细胞,它们分化为多种辅助性T细胞,激活其他免疫细胞,包括细胞毒性T细胞。因此,各种常规CD4+T细胞参与抗肿瘤或促进肿瘤的过程,而CD4则参与。+Treg抑制TME的抗肿瘤免疫。我们获得了6个CD4亚群+T细胞(图1.3A),对不同类型的免疫标记基因进行子集-DEG分析(图1)。3B)。在六个CD4中+两个最大的亚组在EGFR-MT(c1和c3)中表现出明显的增强作用。r分别=8.48和7.66)。我们发现这些亚群显示了与CD4相关的基因的高表达。+T细胞介导的免疫抑制CD 5229,30, ANXA 131,32, ANXA 233,和CXCR 434)。以标记为基础的细胞身份相对不清楚的C5子集在EGFR-MT中表现出增强,具有亚阈值水平的显着性(r=2.74)。C6子集,注释为幼稚的CD4+T细胞的高表达CCR 7,EGFR-WT与EGFR-MT的相对丰度无显着性差异.

图3:基于标记基因表达和多路免疫荧光(IF)分析的CD4+T细胞亚群特征。

aCD4的UMAP和镶嵌图+T细胞这个p-马赛克图中所示的数值是从单面卡方检验中得到的.bCD4不同功能特性标记基因表达的点图+T细胞子集-degs表示为一个红色圆,其统计显着性由点大小表示.c小提琴图,以表达与滤泡辅助T细胞相关的基因。d演奏小提琴的情节CXCL 13EGFR-WT和EGFR-MT基因在C9细胞中的表达。eEGFR-WT肿瘤标本中CD4和CXCL 13的代表性多路复用器(标尺100μm:左,标尺50μm:右放大)n=14)和EGFR-MT(n=14)病人。星号标记双阳性CD4。+CXCL 13+细胞。fCD4细胞计数+、CXCL 13+CD4+T细胞/mm2EGFR-WT(n=5)和EGFR-MT(n(4)条形图显示肿瘤。gCD4细胞计数+、CXCL 13+CD4+T细胞/mm2来自独立患者的EGFR-WT(n=9)和EGFR-MT(n=10)验证用条形图(*)表示。p≤0.05,双面试验).h演奏小提琴的情节TSC22D3NR4A2在EGFR-WT和EGFR-MT的C4细胞中参与Treg活化的基因。数据用平均±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。

值得注意的是,c9的子集是CD4。+在EGFR-MT中消耗最大的T细胞(r=−7.37)。我们发现了几个与T有关的基因FH细胞(CXCL 1335, ICOS36, MAF37, PDCD 135,和SH2D1A35)在C9的子集中(如图所示)。3B,c和补充数据3)。T型FH据报道,细胞通过促进生发中心(GC)抗体亲和力的成熟来帮助B细胞。35。PD-1调节GC定位,帮助T的功能。FH细胞38。人TFHCXCL 13是B细胞向卵泡归巢的主要趋化因子35。CXCL 13一直与TLS的开发有关。39,40。CXCR 5,CXCL 13的受体和T的另一个标志FH细胞,未被检测为C9的一个子集-DEG。此外,C9子集不表示BCL 6,这是一个定义T转录因子的谱系。FH细胞35。这些CXCR 5和BCL 6-阴性TFH-在局部炎症部位发现产生CXCL 13的类似细胞。41,TLS开发经常发生。42。考虑到T的主要作用FH细胞是要招募B细胞,耗尽产生CXCL 13的T细胞。FHEGFR-MT中的样细胞可能导致TLS的形成效率低下。观察到的肿瘤浸润B细胞的耗竭(见图)。二维空间)还提示EGFR-MT中TLS的发育较低.最近,B细胞和TLS被证明与免疫治疗的反应有关。26,27,28。我们还观察到低得多的水平CXCL 13EGFR-MT在EGFR-WT肿瘤中的表达高于EGFR-WT(图1)。三维空间),这进一步支持了CXCL 13产生T的假设。FH-样细胞通过向肿瘤中的功能性TLS募集B细胞,参与抗PD-1反应.确认CXCL 13的减少丰度+CD4+将EGFR-MT中的T细胞与EGFR-WT肿瘤中的T细胞进行比较,从单细胞转录组的分析推断,我们在同一标本的档案组织标本中进行了多重免疫荧光(IF)染色。由于P3患者的样本数量不足以进行下游分析,因此我们可以获得9个先前样本的多路复用的结果。多路复接的结果证实了CD4的减少。+和CXCL 13+CD4+EGFR-MT中的T细胞与EGFR-WT肿瘤的比较(图1)。3E,f和附图。斯10,S11,补充数据4A)。尽管由于样本数量较少,这些结果在统计上并不显著,但与单细胞转录分析的观察结果是一致的。为了进一步验证这些发现,我们对19例EGFR-WT独立非小细胞肺癌患者的肿瘤样本进行了类似的分析。n=9)或EGFR-MT(n=10)(补充数据5A)。对于这个具有较大样本大小的验证集,我们可以观察到cxcl 13的频率显著降低。+CD4+EGFR-MT中的T细胞与EGFR-WT肿瘤的验证集比较(图一)。第三代和补充图。斯12,补充数据4C).

根据肿瘤浸润Tregs的高表达特征基因,将C4标记为Treg细胞。Foxp 3, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL10RA, MAGEH 1, 莱恩,和GATA 3)。他们还显示T细胞活化相关基因的高表达(CD 27, CD 28, ICOS,和TNFRSF 4编码OX 40,TNFRSF 9编码41BB,以及TNFRSF 18编码GITR)和检查点分子(TIGITCTLA 4)。相反,我们观察到EGFR-MT中Treg子集的耗竭(图)。3A)。然而,我们也发现EGFR-MT肿瘤的Treg细胞表达已知的促进Treg活性的基因。TSC22D3编码GILZ43NR4A244)水平明显高于EGFR-WT(图1)。3H和补充数据3),这可以弥补它的缺点。

细胞毒性CD8比例+ T雷姆-EGFR-MT肿瘤样细胞减少

CD8+T细胞聚集在四个不同的亚组(C0、C2、C11和C14),其中只有C2在EGFR-WT和EGFR-MT中所占比例有显著差异,尤其是EGFR-MT(r=−6.44)(图6。4A)。我们描述了CD8的每一个子集+T细胞基于各种类型的标记基因的表达(图一)。4B),发现C2亚群具有最高的细胞毒性,并表达ITGAE(亦称CD 103),是T的一个标志雷姆细胞45。此外,C2子集显示了更高的效应器签名(ID2IFNG)和内存签名(CD7)。T型雷姆摘要细胞是外周组织中效应记忆T细胞的一个子集,其在抗肿瘤免疫中的作用最近引起了广泛的关注。46,47。我们还发现C2子集高表达肿瘤浸润T的特征基因。雷姆-类似CD8+T细胞,如PDCD 1,HAVCR 2,LAG 3,但很少表达Tcf7,肺T雷姆抑制器48,49,50(无花果)4B)。以前,HAVCR 2(亦称提姆-3)已被报道为肺肿瘤T的特征之一。雷姆不涉及精疲力竭的细胞,而是反映一种功能状态的细胞。49。在这方面,我们将C2子集定义为T。雷姆-像细胞作为快速反应记忆的T细胞子集,T雷姆细胞构成性表达穿孔素(PRF 1)、颗粒酶B(GZMB)和IFN-γ(IFNG)。我们发现肿瘤浸润T雷姆-类子集表达了较高水平的.GZMB,而其他子集的表达量则低得多,表明T雷姆-样细胞亚群是肿瘤中一种主要的溶细胞淋巴细胞(如图所示)。4C)。高表达ENTPD 1(亦称CD 39)表明C2亚群是由肿瘤反应性T构成的。雷姆-类似细胞而非旁观者T细胞51(无花果)4D)。效应分子和标记物的表达表明C0和C11是效应分子CD8。+T细胞亚群具有较低的细胞毒性,而C14是一个幼稚的T细胞亚群(图1)。4E,f)。值得注意的是,我们观察到GZMB与T细胞活化相关的基因雷姆-EGFR-WT中的样细胞比EGFR-MT中的细胞(图1)。4G),表示T雷姆-EGFR-WT肿瘤中的类细胞在直接杀伤癌细胞方面具有最高的抗肿瘤活性。

图4:基于标记基因表达、多重免疫荧光(IF)和流式细胞术分析的CD8+T细胞亚群特征。

aCD8的UMAP和镶嵌图+T细胞这个p-马赛克图中所示的数值是从单面卡方检验中得到的.b影响CD8功能特性的标记基因表达点图+T细胞子集-degs表示为红色圆,其统计显着性由点的大小表示.c与细胞毒性有关的基因表达的小提琴图。d用于组织居住的特征基因表达的小提琴作图(ITGAE)和肿瘤反应性(ENTPD 1)CD8+T细胞亚群单个细胞的表达水平与小提琴图一起显示,并给出了表达每个标记基因的细胞比例(%)。e与效应功能相关的基因表达的小提琴图。f与T细胞的幼稚或记忆状态相关的基因表达的小提琴图。g细胞毒性和T细胞活化相关基因表达的小提琴图。为便于比较,两组(EGFR-WT和EGFR-MT)的小提琴图被融合.EGFR-WT高表达的DEGS为DEG组.hEGFR-WT肿瘤标本中CD8、CD 103和GZMB的代表性复用n=14)(标尺100μm:左,标尺50μm:右放大)和EGFR-MT(n(标尺100μm:左,标尺50μm:右侧放大)。星号标记三重阳性CD8。+CD 103+GZMB+细胞。iCD8细胞计数+、CD8+CD 103+,和CD8+CD 103+GZMB+每毫米2在EGFR-WT中n=5)和EGFR-MT(n=4)病人在条形图中被描绘。jCD8细胞计数+和CD8+CD 103+每毫米2EGFR-WT独立患者的肿瘤(n=9)和EGFR-MT(n=10)验证用条形图(*)表示。p≤0.05,双面试验).k7000例活门控CD3流式细胞术数据的TSNE可视化+从EGFR-WT中分离的细胞(n=3)和EGFR-MT(n(3)肿瘤标本。每个单元格被标记为一个点,其颜色刻度根据z-标记蛋白(CD8、CD 103或GZMB)的表达值。lCD 103表达的等高线图和总结图+CD8细胞+EGFR-WT中的T细胞n=16)和EGFR-MT(n=19)从独立病人中收集肿瘤以供验证(*)p≤0.05,双面试验).mGZMB表达式的有代表性直方图和总结图+CD8细胞+CD 103+EGFR-WT中的T细胞n=16)和EGFR-MT(n=19)从独立病人中收集肿瘤以供验证(*)p≤0.05,双面试验).数据用平均±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。

我们在整个幻灯片中使用多路复用的IF来评估选定分子(CD8、CD 103和GZMB)的蛋白表达,以确定T的存在。雷姆-档案组织标本中的类似细胞。CD8丰度+、CD 103+CD8+,以及GZMB+CD 103+CD8+T细胞在EGFR-MT中倾向于低于EGFR-WT(如图所示)。4H,i和附图。斯10, 11,补充数据4A),与基于转录水平的结果一致。19例非小细胞肺癌患者肿瘤样本的验证集(补充数据)5A),我们可以观察到CD8的丰度明显降低+和CD 103+CD8+EGFR-MT中的T细胞与EGFR-WT的比较(图1)。4J和补充图。斯12,补充数据4C)。为进一步验证,我们使用多种抗体(包括抗CD8、抗CD 103和抗gzmb)进行了流式细胞仪分析,以验证另一组由35例非小细胞肺癌患者EGFR-WT(n=16)或EGFR-MT(n=19)(补充数据5B)。T雷姆-CD8细胞中CD 103和GZMB高表达,类细胞亚群高度富集。+与EGFR-MT相比,EGFR-WT中的细胞(圆点内的面积)。4K)。CD 103的比例+CD8细胞+细胞和GZMB细胞+CD8细胞+CD 103+EGFR-MT组细胞数明显低于EGFR-WT组(见图)。4L,m)。因此,CD8的消耗+ T雷姆-EGFR-MT肺癌中的样细胞经蛋白质免疫表型分析证实.

T的稳态雷姆-EGFR-MT肿瘤样细胞受损

到目前为止,我们对EGFR-WT和EGFR-MT进行的比较单细胞转录组分析显示,肺肿瘤中有三种淋巴细胞亚群明显减少。EGFR突变:B细胞,CD4+ TFH-样细胞和CD8+ T雷姆-像细胞考虑到肺癌患者EGFR突变表现出不利的抗PD-1反应,调节这些淋巴细胞亚群的协同作用可能对肺癌的抗肿瘤免疫有重要意义。主要溶细胞酶如穿孔素和GZMB在T中的高表达雷姆-类细胞,T的持久性雷姆肿瘤细胞状态可能是肿瘤细胞有效杀伤的主要决定因素。

T的稳态评价雷姆-在EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤中,我们测量了CD8之间的转移概率。+子集(C0、C2、C11和C14);图1。5A)基于速度分析的天鹅绒细胞(Velocyto)。52,根据未剪接mRNA与剪接mRNA的比值来估算。根据所有基因未来mRNA丰度的概率,我们可以预测每个细胞的未来状态(子集)。5B)。例如,EGFR-MT中从C2到C0的平均转变概率高于EGFR-WT,而从C2到C2(即C2状态的持久性)在EGFR-WT中高于EGFR-MT(如图所示)。5C)。我们比较和计算了EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤在C0、C2、C11和C14四个亚群之间的转移概率,以确定肿瘤的稳态变化。值得注意的是C2(T)雷姆从EGFR-WT和EGFR-MT中分离出的-样细胞的持久性概率分别为0.57和0.41。5D和补充数据6)。相反,所有其他子集在EGFR-WT和EGFR-MT之间表现出相似的持久性概率:C0为0.77比0.76,C11为0.16 vs.0.16,C14为0.042比0.034。我们还表演了scvelo53在没有稳态假设和观察到的一致结果的情况下能够估计RNA速度的分析(补充图)。斯13)。这些结果表明T的持久性雷姆EGFR-MT肺癌细胞状态受损.

图5:可预测肺癌抗Pd-1反应的TRM样子集稳态调节。

aCD8的UMAP图+具有四种不同细胞子集颜色代码的T单元格。b在预定义的CD8的UMAP图上显示了细胞的转移概率。+EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤的T细胞。只有三个主要的CD8亚群+T细胞(C0,C2和C11)出现在这里。较长的箭头表示更高的转换概率。c在两个不同的肿瘤组中,从C2子集到C0子集(上)和从C2子集到C2子集(即C2持久性)的转移概率分布的直方图。从这些直方图中,EGFR-MT的C2细胞更有可能过渡到C0,而EGFR-WT的C2细胞则倾向于在C2状态下存活。d三个主要子集之间的过渡摘要。C0和C11在EGFR-WT和EGFR-MT(中、底部)之间的持久性差异无显着性,而C2在EGFR-WT中的持久性高于EGFR-MT(TOP)。e火山图显示T雷姆-类细胞(C2)与其他CD8亚群比较+T细胞TFS用红色表示。fSpearman秩相关的热图可视化RBPJNOTCH 1与T相关的基因雷姆EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤中的细胞分化或维持(列)。g具有回归曲线的散点图,这些曲线突出了大幅度减少甚至反转之间的相关性。RBPJ与EGFR-WT肿瘤相比,EGFR-MT具有潜在的调节性靶基因。hT丰度的示意图雷姆-TCGA、LUAD和LUSC标本EGFR-WT和EGFR-MT中的样细胞,用CIBERSORTx标记矩阵评分法估算。i根据从永世癌症中心(YCC)招募的非小细胞肺癌患者(YCC)和Jung等人的非小细胞肺癌(NSCLC)患者队列描述抗Pd-1反应的瀑布图。基线代表CIBERSORTx评分的中位数,代表肿瘤浸润T的比例。雷姆-像细胞全p-数值是用单尾Mann-Whitney计算的。U试验(检测应答者状态与肿瘤浸润T比例的关系)雷姆-类似细胞)。j基于肿瘤浸润T比例的响应器接收机工作特性曲线下面积雷姆-像细胞源数据作为源数据文件提供。

缺口-RBPJ维护T的调节网络雷姆EGFR-MT肿瘤细胞受扰

转录调控网络严格控制免疫细胞的分化和功能维持。我们假设T细胞内转录调节网络的调节失调雷姆细胞状态发生在EGFR-MT肺癌中.为了重建关键的调控网络,我们首先在C2子集中识别出与其他CD8不同的上调转录因子(TFs)。+细胞亚群(图1.5E)。在被放大的TFs中,ID2, RBPJ,和BHLHE 40与T有关雷姆细胞发育与动态平衡54,55,56。特别是,RBPJ与缺口相关联,形成维持T所需的转录激活剂。雷姆人体细胞55。接下来,我们比较了EGFR-WT和EGFR-MT之间的RBPJ共调节网络,以确定两种肺肿瘤分子亚型之间RBPJ调控靶点的得失。为了提高基因-基因相关分析对高度稀疏scrna-seq数据的鲁棒性,我们使用了Metacell。57分析方法,将单细胞转录组剖面划分为不相交的同质组.正如我们所预期的,我们观察到RBPJ还有许多已知的T基因雷姆细胞分化与维持45,46,47在C2细胞中来自EGFR-WT肿瘤的细胞(如图所示)。5F)。此外,NOTCH 1与相同的调节性靶基因高度相关,但与其他CD8相比,C2亚群中未见明显上调。+细胞亚群。有趣的是,许多转录相关RBPJ在EGFR-MT的C2亚群细胞中消失。特别是.的表达RGS 2, NOTCH 1,RGS 1, PDCD 1, CRTAM, CXCR 6, TIA 1, HIF1a, NAB 1,和ITGAE正相关RBPJ在EGFR-WT的C2子集中,EGFR-MT的C2子集中的基因-基因相关性丢失,甚至呈负相关(图1)。5G和补充数据7)。在EGFR-MT中,转录相关的缺失更为明显。NOTCH 1(无花果)5F和补充数据7)。这些结果表明肿瘤浸润性T细胞持续存在。雷姆细胞状态依赖于Notch-RBPJ调控网络,在EGFR-MT肺癌中调控异常.

肿瘤浸润性T细胞比例雷姆-样细胞对非小细胞肺癌抗pd-1反应有高度的预测作用。

考虑到肿瘤浸润T的比例雷姆-EGFR-MT肺肿瘤中的样细胞减少,对抗pd-1免疫治疗反应不佳,我们推测T的相对丰度。雷姆肿瘤中的类细胞本身可以预测抗Pd-1反应.目前对每种免疫细胞类型所占比例的金标准估计是用特定于每一种细胞类型的标准标记进行流式细胞术分析。然而,这种方法只适用于主要的细胞类型或特征良好的标记基因的亚型。单细胞生物学能够发现越来越多的细胞亚群,识别这些子集的特定标记将是一项艰巨的任务。因此,利用细胞类型特异性表达特征对异质细胞群中的细胞子集进行量化,最近得到了应用.为了推断肺癌组织中18种免疫细胞的表达特征,我们应用CIBERSORTx技术。58,提出了一种将特定细胞类型的基因表达特征推断为单细胞转录组谱的反褶积方法,并生成了一个由18个子集组成的特征矩阵(补充数据)。8A)。然后我们估计了T的相对丰度雷姆-肺癌(LUAD)和肺鳞状细胞癌(LUSC)肿瘤基因组图谱(TCGA)中的类细胞59。与单细胞转录组的结果一致,T的特征评分雷姆-在具有野生型EGFR的TCGA肿瘤中,样细胞显著高于突变型(p=0.0173,单尾曼恩-惠特尼U试验)(如图所示。5H和补充数据8B)。这一结果证实了推断的表达式特征是T相对丰度的一个合适的估计量。雷姆-肿瘤中的类似细胞。

接下来,我们评估了T的表达式签名。雷姆用大量的rna-seq数据和两组独立的非小细胞肺癌(GSE 126045和GSE 135222)的临床信息来预测抗pd-1免疫治疗的反应(GSE 126045和GSE 135222)。60,61。值得注意的是,我们观察到了特征性评分之间的正相关关系,表明肿瘤浸润性T细胞丰富。雷姆-类细胞和抗PD-1反应在这两个队列(图)。5I和补充数据8C,d)。在两个非小细胞肺癌组中,应答者的签名分数显著高于非应答者(p=0.0114和0.0404,单尾曼恩-惠特尼U测试)。此外,我们对表现出最高特征评分的患者进行了优先排序。这种分层导致大面积的接收机操作特征曲线(AUROC)评分,表明高丰度肿瘤浸润T。雷姆-样细胞是抗PD-1反应的一个预测指标。5J)。值得注意的是,Yonsei癌症中心招募的18名患者中只有2名。60EGFR-MT;一个是应答者,另一个不是(Jung等人的EGFR突变状态信息)。61)。因此,T的标识表达式签名雷姆-样细胞本身可以作为一种生物标记物,将肺癌患者分层进行抗pd-1免疫治疗,而不考虑他们的作用。EGFR突变状态。

CXCL 13-CXCR 5介导的TFH-B和T雷姆-B相互作用在EGFR-MT肿瘤中调控失调

以前的研究也表明TFH细胞释放CXCL 13吸收B细胞进入TLS35,然后将肿瘤抗原呈现给T细胞。62。正如我们的研究所证明的,CXCL 13生产T的丰富程度。FH-EGFR-WT组的EGFR样细胞高于EGFR-MT组(图1).3E,f)。这些观察表明,吸收B细胞进入肿瘤的TLS在EGFR-MT中变得不那么有效,这可能是由于CXCL 13-CXCR 5介导的相互作用丧失,导致细胞毒性T细胞激活减少。为了检验这一假设,我们评估了T之间的细胞间相互作用。FH-样细胞(C9)、B细胞(C8)和细胞毒性T雷姆-使用CellPhoneDB的类细胞(C2)63。我们发现EGFR-WT中的细胞与细胞之间的相互作用比EGFR-MT更显着。6A)。我们发现TFH-B细胞通过CXCL 13-CXCR 5轴的相互作用在EGFR-MT(低配体和受体的平均表达)明显弱于EGFR-WT。值得注意的是,我们还可以检测到CXCL 13-CXCR 5-介导的T之间的相互作用。雷姆-B细胞在EGFR-WT中,而在EGFR-MT中不存在.的确,T雷姆-样细胞也表达CXCL 13虽然没有T那么多FH-像细胞

图6:tFH-B-T雷姆肺肿瘤中淋巴细胞的相互作用及其共同定位。

a总结CD8-C2(T)细胞间相互作用的点阵图雷姆-类似)、B和CD4-C9(T)FH-CellPhoneDB分析细胞。这里只有重要的配体-受体相互作用。圆的大小表示统计意义,颜色梯度表示基因对的平均表达值。bEGFR-WT中TLS样病变的代表多路免疫荧光(IF)n=14)(标尺100μm:左,标尺50μm:右放大)和EGFR-MT(n(下)(标尺100μm:左,标尺50μm:右侧放大)肿瘤。EGFR-WT中TLS样病变面积汇总图(n=5)和EGFR-MT(n=4)单细胞分析肿瘤(**)p≤0.005,双面试验)(上面板)和EGFR-WT(n=9)和EGFR-MT(n=10)独立患者的肿瘤供验证(*p≤0.05,双面试验)(下面板).cEGFR-WT肿瘤组织中CD4、CXCL 13、CD 103、CD8、CXCR 5和CD 20的代表性复用n=14)(左)(标尺100μm)和EGFR-MT(n14)(右)(标度BAR 100μm)患者。dEGFR-WT中TLS样病变中每种细胞类型数目的汇总图(n=5)和EGFR-MT(n(4)病人。CD4数+、CXCL 13+CD4+T细胞,CD8+T细胞,CD 103+CD8+T细胞在EGFR-WT中显著高于EGFR-MT(*p≤0.05,**p≤0.005,双面试验).eEGFR-WT中TLS样病变中每种细胞类型数目的汇总图(n=9)和EGFR-MT(n=10)独立患者的肿瘤进行验证。一直以来,CD4的数量+、CXCL 13+CD4+T细胞,CD8+T细胞,CD 103+CD8+T细胞在EGFR-WT中显著高于EGFR-MT(**)p≤0.005,*p≤0.0005,双面试验).fT模型的说明性总结FH-B-T雷姆淋巴细胞在肺癌抗肿瘤免疫中的协同作用。数据用平均±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。

最近,一个PD-1+CD8+在肺癌TLS的B细胞区附近检测到分泌CXCL 13的T细胞亚群。64。与EGFR-MT相比,EGFR-WT的B细胞在抗原处理和呈递过程中表现出更多的分子。三维空间)。这些分子将促进CD4的活化。+ TFH-样细胞(通过MHCⅡ级)和CD8+ T雷姆细胞(通过MHCⅠ级)。因此,抗原提呈能力的增强可能促进B细胞的增殖,刺激肿瘤特异性CD8。+ T雷姆细胞。在EGFR-WT中,CD8的丰度+ T雷姆-样细胞及其GZMB的产量均高于EGFR-MT(图1)。4H,i,k,m)。因此,CD8的比例增加了+ T雷姆-样细胞可以通过产生GZMB之类的溶细胞材料来有效地溶解癌细胞。

为了验证我们的假设,我们首先定义了tls样病变的区域(见“方法”部分),然后评估T的丰度。FH-类似(CXCL 13)+CD4+),B(CXCR 5)+CD 20+),以及T雷姆-类(CD 103)+CD8+)存档肿瘤组织标本TLS样病变中的细胞。有趣的是,我们发现在EGFR-MT中,TLS样病变的总面积明显小于EGFR-WT(图1)。6B、左、右面板和补充数据4A)。对于19个用于多路复用的独立肿瘤样本的验证集,我们还观察到EGFR-MT中TLS样病变的面积小于EGFR-WT(图1)。6B,右下面板和补充数据4C)。在整体tls样病变中,CD4的数量要少得多。+和CD8+在EGFR-MT中发现T细胞,而EGFR-WT中发现T细胞(如图所示)。6C,d和附图。斯10, 11)。值得注意的是,T的数目FH-类似(CXCL 13)+CD4+)和T雷姆-类(CD 103)+CD8+EGFR-MT细胞明显低于EGFR-WT(图1).6C,d和附图。斯10, 11,补充数据4B)。我们从19个独立肿瘤样本的验证集中观察到一致的结果(如图所示)。6E和补充图。斯12,补充数据4D)。这些结果表明,CXCL 13-CXCR 5介导的T之间的相互作用FH-B和T雷姆-B细胞支架TFH-B-T雷姆淋巴细胞在肺癌抗肿瘤免疫中的协同作用如图所示。6f.

讨论

在本研究中,我们通过CD 45的不同亚群,对EGFR-WT和EGFR-mt肺癌进行了比较性的单细胞转录组分析。+免疫细胞用scRNA-seq阐明抗PD-1免疫治疗的不同应答率的机制。近年来,越来越多的证据表明,激活肿瘤细胞中的致癌途径可能通过调节免疫细胞的分化和募集来减少抗肿瘤免疫反应。65。我们的研究揭示了肿瘤浸润的B细胞CD4的显著耗竭。+ TFH-样细胞和CD8+ T雷姆-EGFR-MT肿瘤中的样细胞。此外,TFH-像,B,和T雷姆-EGFR-MT的样细胞表达与TLS形成、抗原提呈和细胞毒性有关的基因分别低于EGFR-WT。EGFR-WT和EGFR-MT患者组在发现和验证队列中分别对有吸烟史的男性和女性不吸烟者有偏见。以前的研究也报告了较高的患病率。EGFR-女性非吸烟者中突变型非小细胞肺癌患者多于男性吸烟者。66,67。检验性别或吸烟状况是否是观察到的T消耗的混杂因素。FH-像,B,和T雷姆-在EGFR-MT肿瘤中,我们分别比较了不同吸烟状态和不同性别的TCGA非小细胞肺癌组CIBERSORTx的CIBERSORTx评分。无论是EGFR-WT组还是EGFR-MT组,我们都可以观察到不吸烟者和女性三种细胞类型的显著减少(补充图)。斯14A),这表明,吸烟状态和性别都不是观察到的EGFR突变状态与TME表型之间的关联。此外,我们只观察到T的弱相关性。雷姆-pd-L1表达的样细胞丰度或TLS区(补充图)。斯14B),这表明PD-L1并不是我们观察到的EGFR突变状态与TME表型之间关联的混合体。总之,这些结果表明,更高的内在电阻EGFR突变型肿瘤抗PD-1免疫治疗的主要原因是这三种淋巴细胞亚群的耗竭,TLS抗肿瘤免疫的主要功能成分及其在肿瘤中的功能失调。此外,我们发现T的消失FH-B和T雷姆在EGFR-MT肿瘤中,CXCL 13-CXCR 5轴介导的B相互作用可能对肿瘤内TLS的形成产生不利影响。因此,针对这些细胞内和细胞间网络的基因可能改善EGFR-MT患者的抗PD-1反应.

以前的研究已经证明了肿瘤内T丰度之间的相关性。雷姆肺癌的细胞与患者预后49,68,69。在本研究中,我们证明了根据T细胞比例预测抗pd-1免疫治疗反应的可行性。雷姆-像细胞量化一个特定的肿瘤细胞亚群将是预测临床结果的一个有用的生物标记物。利用最近开发的cibersortx基因表达反褶积与单细胞转录组数据,我们提取了肺肿瘤中每个细胞亚群的表达特征,发现cbersotx的表达特征为cbersotx。+ T雷姆-样细胞对非小细胞肺癌两个独立队列的抗PD-1反应有很强的预测作用.值得注意的是,我们测试了T的表达签名。雷姆-从肺肿瘤中构建的类细胞可识别黑色素瘤队列中的抗Pd-1应答者,但未观察到预测能力。鉴于T雷姆细胞永久存在于外周组织中,这些结果可归因于T的组织特异性。雷姆细胞通过适应不同的局部微环境。

在本研究中,我们采用Pearson残差分析和马赛克图显示,系统地比较了样本组(EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤)之间的细胞子集分布。利用Bonferroni平差的卡方显着性检验,我们可以检索出与观察到的样本组间表型差异相一致的比例变化的子集。同一分析框架可应用于具有不同基因型和表型的样本组之间的各种比较单细胞转录组分析,并且对结果的解释是非常直观的。皮尔逊残差法可以用于两组以上的对比分析,如果不是太多的话。因此,我们期望在未来扩大Pearson残差框架在单细胞转录体分析中的适用性。

本研究有几个局限性。首先,虽然我们在TLS区发现了三个与抗肿瘤免疫相关的细胞亚群及其功能调控,但它们是否是独立或分级协调的仍是未知的。例如,如果由T生产的CXCL 13FH-样细胞促进T细胞的持久性雷姆-通过与所招募的B细胞相互作用,T细胞中CXCL 13表达的转录调控因子可能是改善EGFR-MT肿瘤抗PD-1反应的主要靶点。其次,本研究缺乏髓系细胞(如树突状细胞和髓源性抑制细胞)和基质细胞(如与癌症相关的成纤维细胞)的数据,这也有助于肿瘤与免疫之间的相互作用。虽然它们没有直接参与杀死癌细胞,但它们的活性通过细胞因子介导的细胞间通讯和肿瘤抗原的呈现来增强或抑制主要的细胞毒性淋巴细胞。因此,通过比较骨髓细胞和基质细胞的亚群,可以发现更多的细胞成分来确定抗Pd-1免疫治疗的反应。第三,我们的研究对非小细胞肺癌的腺癌亚型有偏见(它只包括一个鳞状细胞癌亚型的患者)。因此,本研究的一些发现可能仅与腺癌亚型有关。第四,2例G719A(P5)和G719S(P8)患者。虽然g179x被认为是致敏突变,但在第三阶段的试验中并没有将osimertinib与其他EGFR-TKIs相比较,以EGFR-突变型NSCLC患者为一线(Flaura)。3与外显子19del和L858R相比,在临床试验中所占比例偏低。第五,虽然我们证明吸烟状况和性别并不是EGFR突变体中TLS下降的原因,但我们不排除其他混杂因素。许多大样本的基因组和临床注释的肿瘤将提供一个更全面的评估,我们的发现。最后,尽管我们证明了T的稳态的重要性雷姆非小细胞肺癌(NSCLC)TME中抗肿瘤免疫的样细胞通过单细胞RNA速度和协同调控网络分析,无法提供本研究的功能验证。因此,我们需要在体外和体内条件下进行进一步的实验分析,以确定我们在未来研究中提出的机制。

最后,我们进行了一项比较单一细胞转录组的分析。EGFR-突变型和野生型肺肿瘤,发现几个关键的淋巴细胞亚群参与了抗PD-1反应的机制。特别是,我们阐明了TFH-B-T雷姆淋巴细胞协同是肺癌抗肿瘤免疫的关键。T的动态平衡失调雷姆细胞状态与TFH-B和T雷姆-B串扰参与EGFR-MT肺癌TLS的发展,可能是Pd-1阻断抗肿瘤免疫治疗不良反应的原因。我们的发现为制定策略以提高抗pd-1的疗效提供了指导。EGFR突变。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297