比较scrna-seq分析显示，非小细胞肺癌中EGFR突变型肿瘤与野生型肿瘤的免疫细胞亚群存在差异。 比较两种不同的肺癌分子亚型的细胞景观 EGFR 我们从10例分期为IA-IIIA的非小细胞肺癌患者的肿瘤标本中制备了突变状态：5例EGFR-WT和5例EGFR-MT(补充数据)。 1 )。针对肿瘤浸润免疫细胞的情况，我们对CD 45进行了分类。 + 从肿瘤组织中提取白细胞，并使用10X基因组学技术对个别患者进行scRNA-seq(图1)。1A 和补充图。斯 1 )。共对33,719个细胞进行了测序，其中31,887个细胞通过了质量控制(补充数据) 1 )。我们使用seurat v.3.0软件包对scrna-seq数据进行预处理。 17 并通过UMAP维数缩减将它们可视化。 18 。在不同患者的数据集之间观察到系统的偏差(图一)。 1B )。为了纠正批处理效应，使用seurat v.3.0集成scrna-seq数据，该方法基于典型相关分析和样本间锚定数据集。 17 ...经批量校正后，UMAP维数降低了患者的均质种群结构和突变状态。 1C )。利用网络社区检测算法，我们定义了18个聚类(C0-17)，它们对应于不同的细胞亚群(图1)。 1D )。基于典型标记基因的表达(附图)。斯 2 )，我们注释了主要细胞类型的集群，例如CD8。 + T细胞(C0，C2，C11，C14)(附图)斯 3 和 4 )，CD4 + T细胞(C1，C3，C5，C6和C9)(附图)斯 3 和 4 )，调节性T细胞(C4)(补充图4)。斯 3 和 4 )，自然杀伤(NK)细胞(C13)(附图)。斯 5 )，自然杀伤T(NKT)细胞(C7，C10，C12)(附图)。斯 5 )，B细胞(C8)(附图)。斯 6 )、巨噬细胞和单核细胞(C15)(补充图1)。斯 7 )，树突状细胞(DC)(C16)(附图)。斯 8 )和固有淋巴样细胞2(ILC 2)(C17)(补充图1)。斯 9 )。在EGFR-WT和EGFR-MT之间，许多簇的细胞分布明显不同。 1E )，说明两种非小细胞肺癌分子亚型在肿瘤浸润免疫细胞组成上的差异。这些簇的大部分由10名患者中的大多数细胞组成，没有对特定患者的严重偏见。然而，最小的三组细胞--C15(巨噬细胞和单核细胞)、C16(DC)和C17(ILC 2)--大多来自患者6(P6)(图6)。 1F 和补充数据 2 )。因此，我们将这些聚类排除在下游分析之外，以避免基于病人偏见的数据形成假设。
图1：肺癌标本的比较scRNA-seq分析概述。 a 10例突变型或野生型EGFR肺癌标本(P1-10)scRNA-seq分析的原理图概述。 b , c UMAP显示scRNA-seq数据之前( b )和之后( c )批校正。 d 18组(C0-17)免疫细胞的UMAP图分为主要免疫细胞类型。群集数的顺序对应于相对单元格数。用标准标记基因表达对聚类进行批注。 e UMAP绘制了来自EGFR-WT(左)或EGFR-MT(右)的18组免疫细胞。 f 每名病人18组的细胞计数。 g 镶嵌图共18个簇，每个簇由EGFR-WT组和EGFR-MT组组成.红色表示丰度显著减少，而蓝色表示丰度显著增加。 p -数值<0.05，\x{e76f}Pearson剩余值>4 p -数值<0.0001)。这个 p -马赛克图中所示的数值是从单面卡方检验中得到的.源数据作为源数据文件提供。
为了研究EFGR-WT和EGFR-MT之间15个细胞亚群(C0-C14)的比例变化，我们用Pearson残差法评估了观察到的细胞计数与每个子集的期望计数之间的偏差。 r )。当残差的符号指示观察到的计数与预期计数的差值方向时， r >0和 r < 0 represent augmentation and depletion compared to the expected count, respectively. We considered only subsets with r >3.5和 r < −3.5 as augmentation and depletion with high confidence, respectively, for follow-up functional interpretation (see “Methods” section for a detailed description of r 阈值选择)。我们使用马赛克图可视化拟合优度检验的结果，其中与预期细胞计数偏差的子集以蓝色(增强)、红色(耗尽)或灰色(无显着性变化)表示。 1g )。所有子集的拟合优度也用卡方统计量( p -图的价值。 1g )。我们观察到高于阈值水平的增强或耗尽( r >3.5或 r < −3.5) of the cell count for EGFR-WT and EGFR-MT from eight subsets (Supplementary Data 2 )。我们期望对EGFR-WT和EGFR-MT之间的差异累积亚群的成功解释将为了解EGFR-MT非小细胞肺癌患者不利的抗PD-1反应的机制提供线索。描述每种主要细胞类型(如CD8)的单个亚群+ T，CD4 + T细胞、Treg细胞、NK细胞、NKT细胞和B细胞)，我们鉴定了一个子集的差异表达基因(Degs)，与同一主要细胞类型(子集-deg)的所有其他亚组(子集-deg)和每个子集(组-deg)的EGFR-WT和EGFR-MT之间的差异表达基因(Degs)(补充数据)。 3 ).
EGFR-MT肿瘤中细胞毒性NK细胞比例下降，而低细胞毒性NKT细胞比例增加。 NK细胞和NKT细胞是天然免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，在激活适应性免疫系统之前提供了机体的第一道防线。虽然这些细胞具有有限的抗原特异性和较低的记忆生成能力，但它们可以通过细胞毒性分子直接杀死癌细胞。 19 。细胞毒性NK细胞(C13)的亚群在EGFR-MT中被耗尽，但其意义并没有超过预先确定的阈值。 r =−3.34)(图3。 2A )。在NKT细胞的三个亚群(C7、C10和C12)中，NKT-C7和NKT-C10在EGFR-MT中的比例显著增加( r 分别=6.35和10.57； 2A )。子集-DEG分析表明，在EGFR-MT中缺失的NK-C13和NTK-C12分别表达了更多的参与激活的基因。 TNFRSF 18 , IL2RB , CD7 , CD 44 , TYROBP ，和 TNFRSF1B )20 ,21 ,22 (无花果) 2B )和细胞毒性( PRF 1 和 GZMB )23 (无花果) 2C )比其他子集。相比之下，NKT-C7和NKT-C10在EGFR-MT中所占比例增加，而这些亚组表达的激活或细胞毒性基因水平低于其他亚群。总之，NKT-C10在所有NK和NKT细胞亚群中可能具有最低的细胞毒性活性，因为参与激活和细胞毒性的基因的表达低于所有其他亚群(图1)。 2B，c )，这与EGFR-MT( r =10.57)(图1。 2A )。总之，单细胞转录组分析显示NKT细胞亚群增加，与EGFR-MT激活和细胞毒性相关的基因表达相对较低。
图2：基于标记基因表达的NK、NKT和B细胞亚群特征。 a NK和NKT细胞的UMAP和镶嵌图。这个 p -马赛克图中所示的数值是从片面的卡方检验中得到的. b , c 与激活有关的基因表达小提琴图( b )和细胞毒性( c )NK或NKT淋巴细胞的跨亚群(H，高表达水平；L，低表达水平)。根据激活和细胞毒性相关基因的表达水平，对每个子集进行了表征。例如，NKT-C7具有低活性和高细胞毒性的特点。 d UMAP和B细胞镶嵌图。 e 在EGFR-WT或EGFR-MT肿瘤B细胞中参与抗原呈递和处理的基因表达的小提琴图。
EGFR-MT肿瘤B细胞比例随抗原提呈减少而降低 B细胞分泌抗体中和抗原或标记肿瘤细胞，以防其他免疫细胞攻击。 24 。近年来，肿瘤浸润的B细胞通过形成TLS来促进肿瘤患者对免疫治疗和生存的反应，其中B细胞可以向T细胞呈递肿瘤来源的新抗原来激活它们。 25 ,26 ,27 ,28 。我们观察到与EGFR-WT相比，EGFR-MT中的B细胞明显减少( r =−6.23，图1。 二维空间 表明EGFR-MT肿瘤浸润B细胞的比例低于EGFR-WT.此外，我们还观察到来自EGFR-MT的B细胞的HLA基因表达水平较低(MHC I级： 赫拉-丙 和MHC二级： Hla-DPB 1 , HLA-DRB 5 ，和 Hla-DQA 2 )和 TAP 1 (抗原肽转运体参与处理抗原，将呈现给MHCⅠ级)(图1)。 2E )。这些结果表明，EGFR-MT中的B细胞对CD8的激活效果较差。 + 和CD4 + T细胞的表达低于EGFR-WT，这分别是由于MHCⅠ类和Ⅱ类的低表达所致.
CXCL 13生产T的比例 FH -样细胞减少，而免疫抑制性CD4细胞减少。 + EGFR-MT肿瘤中T细胞增多 连同CD8 + T细胞，CD4 + T细胞是调节适应性免疫的主要淋巴细胞，它们分化为多种辅助性T细胞，激活其他免疫细胞，包括细胞毒性T细胞。因此，各种常规CD4+ T细胞参与抗肿瘤或促进肿瘤的过程，而CD4则参与。 + Treg抑制TME的抗肿瘤免疫。我们获得了6个CD4亚群 + T细胞(图1. 3A )，对不同类型的免疫标记基因进行子集-DEG分析(图1)。 3B )。在六个CD4中 + 两个最大的亚组在EGFR-MT(c1和c3)中表现出明显的增强作用。 r 分别=8.48和7.66)。我们发现这些亚群显示了与CD4相关的基因的高表达。 + T细胞介导的免疫抑制 CD 52 29 ,30 ANXA 1 31 ,32 ANXA 2 33 ，和 CXCR 4 34 )。以标记为基础的细胞身份相对不清楚的C5子集在EGFR-MT中表现出增强，具有亚阈值水平的显着性( r =2.74)。C6子集，注释为幼稚的CD4 + T细胞的高表达 CCR 7 和 卖 ，EGFR-WT与EGFR-MT的相对丰度无显着性差异.
图3：基于标记基因表达和多路免疫荧光(IF)分析的CD4+T细胞亚群特征。 a CD4的UMAP和镶嵌图 + T细胞这个 p -马赛克图中所示的数值是从单面卡方检验中得到的. b CD4不同功能特性标记基因表达的点图 + T细胞子集-degs表示为一个红色圆，其统计显着性由点大小表示. c 小提琴图，以表达与滤泡辅助T细胞相关的基因。 d 演奏小提琴的情节 CXCL 13 EGFR-WT和EGFR-MT基因在C9细胞中的表达。 e EGFR-WT肿瘤标本中CD4和CXCL 13的代表性多路复用器(标尺100μm：左，标尺50μm：右放大) n =14)和EGFR-MT( n =14)病人。星号标记双阳性CD4。 + CXCL 13 + 细胞。 f CD4细胞计数 + 、CXCL 13 + CD4 + T细胞/mm 2 EGFR-WT( n =5)和EGFR-MT( n (4)条形图显示肿瘤。 g CD4细胞计数 + 、CXCL 13 + CD4 + T细胞/mm 2 来自独立患者的EGFR-WT( n =9)和EGFR-MT( n =10)验证用条形图(*)表示。 p ≤0.05，双面试验). h 演奏小提琴的情节 TSC22D3 和 NR4A2 在EGFR-WT和EGFR-MT的C4细胞中参与Treg活化的基因。数据用平均±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。
值得注意的是，c9的子集是CD4。 + 在EGFR-MT中消耗最大的T细胞( r =−7.37)。我们发现了几个与T有关的基因 FH 细胞( CXCL 13 35 ICOS 36 MAF 37 PDCD 1 35 ，和 SH2D1A 35 )在C9的子集中(如图所示)。 3B，c 和补充数据 3 )。T型 FH 据报道，细胞通过促进生发中心(GC)抗体亲和力的成熟来帮助B细胞。 35 。PD-1调节GC定位，帮助T的功能。 FH 细胞 38 。人T FH CXCL 13是B细胞向卵泡归巢的主要趋化因子 35 。CXCL 13一直与TLS的开发有关。 39 ,40 。CXCR 5，CXCL 13的受体和T的另一个标志 FH 细胞，未被检测为C9的一个子集-DEG。此外，C9子集不表示 BCL 6 ，这是一个定义T转录因子的谱系。 FH 细胞 35 。这些CXCR 5和BCL 6-阴性T FH -在局部炎症部位发现产生CXCL 13的类似细胞。 41 ，TLS开发经常发生。 42 。考虑到T的主要作用 FH 细胞是要招募B细胞，耗尽产生CXCL 13的T细胞。 FH EGFR-MT中的样细胞可能导致TLS的形成效率低下。观察到的肿瘤浸润B细胞的耗竭(见图)。 二维空间 )还提示EGFR-MT中TLS的发育较低.最近，B细胞和TLS被证明与免疫治疗的反应有关。 26 ,27 ,28 。我们还观察到低得多的水平 CXCL 13 EGFR-MT在EGFR-WT肿瘤中的表达高于EGFR-WT(图1)。 三维空间 )，这进一步支持了CXCL 13产生T的假设。 FH -样细胞通过向肿瘤中的功能性TLS募集B细胞，参与抗PD-1反应.确认CXCL 13的减少丰度 + CD4 + 将EGFR-MT中的T细胞与EGFR-WT肿瘤中的T细胞进行比较，从单细胞转录组的分析推断，我们在同一标本的档案组织标本中进行了多重免疫荧光(IF)染色。由于P3患者的样本数量不足以进行下游分析，因此我们可以获得9个先前样本的多路复用的结果。多路复接的结果证实了CD4的减少。 + 和CXCL 13 + CD4 + EGFR-MT中的T细胞与EGFR-WT肿瘤的比较(图1)。 3E，f 和附图。斯 10 ，S 11 ，补充数据 4A )。尽管由于样本数量较少，这些结果在统计上并不显著，但与单细胞转录分析的观察结果是一致的。为了进一步验证这些发现，我们对19例EGFR-WT独立非小细胞肺癌患者的肿瘤样本进行了类似的分析。 n =9)或EGFR-MT( n =10)(补充数据 5A )。对于这个具有较大样本大小的验证集，我们可以观察到cxcl 13的频率显著降低。 + CD4 + EGFR-MT中的T细胞与EGFR-WT肿瘤的验证集比较(图一)。 第三代 和补充图。斯 12 ，补充数据 4C
根据肿瘤浸润Tregs的高表达特征基因，将C4标记为Treg细胞。 Foxp 3 , IL2RA , IL2RB , IL2RG , IL10RA , MAGEH 1 , 莱恩 ，和 GATA 3 )。他们还显示T细胞活化相关基因的高表达( CD 27 , CD 28 , ICOS ，和 TNFRSF 4 编码OX 40， TNFRSF 9 编码41BB，以及 TNFRSF 18 编码GITR)和检查点分子( TIGIT 和 CTLA 4 )。相反，我们观察到EGFR-MT中Treg子集的耗竭(图)。 3A )。然而，我们也发现EGFR-MT肿瘤的Treg细胞表达已知的促进Treg活性的基因。 TSC22D3 编码GILZ 43 和 NR4A2 44 )水平明显高于EGFR-WT(图1)。 3H 和补充数据 3 )，这可以弥补它的缺点。
细胞毒性CD8比例 + T雷姆 -EGFR-MT肿瘤样细胞减少 CD8 + T细胞聚集在四个不同的亚组(C0、C2、C11和C14)，其中只有C2在EGFR-WT和EGFR-MT中所占比例有显著差异，尤其是EGFR-MT( r =−6.44)(图6。 4A )。我们描述了CD8的每一个子集 + T细胞基于各种类型的标记基因的表达(图一)。 4B )，发现C2亚群具有最高的细胞毒性，并表达 ITGAE (亦称 CD 103 )，是T的一个标志 雷姆 细胞 45 。此外，C2子集显示了更高的效应器签名( ID2 和 IFNG )和内存签名( CD7 )。T型 雷姆 摘要细胞是外周组织中效应记忆T细胞的一个子集，其在抗肿瘤免疫中的作用最近引起了广泛的关注。 46 ,47 。我们还发现C2子集高表达肿瘤浸润T的特征基因。 雷姆 -类似CD8 + T细胞，如 PDCD 1，HAVCR 2， 和 LAG 3 ，但很少表达 Tcf7 ，肺T 雷姆 抑制器 48 ,49 ,50 (无花果) 4B )。以前， HAVCR 2 (亦称 提姆-3 )已被报道为肺肿瘤T的特征之一。 雷姆 不涉及精疲力竭的细胞，而是反映一种功能状态的细胞。 49 。在这方面，我们将C2子集定义为T。 雷姆 -像细胞作为快速反应记忆的T细胞子集，T 雷姆 细胞构成性表达穿孔素( PRF 1 )、颗粒酶B( GZMB )和IFN-γ( IFNG )。我们发现肿瘤浸润T 雷姆 -类子集表达了较高水平的. GZMB ，而其他子集的表达量则低得多，表明T 雷姆 -样细胞亚群是肿瘤中一种主要的溶细胞淋巴细胞(如图所示)。 4C )。高表达 ENTPD 1 (亦称 CD 39 )表明C2亚群是由肿瘤反应性T构成的。 雷姆 -类似细胞而非旁观者T细胞 51 (无花果) 4D )。效应分子和标记物的表达表明C0和C11是效应分子CD8。 + T细胞亚群具有较低的细胞毒性，而C14是一个幼稚的T细胞亚群(图1)。 4E，f )。值得注意的是，我们观察到 GZMB 与T细胞活化相关的基因 雷姆 -EGFR-WT中的样细胞比EGFR-MT中的细胞(图1)。 4G )，表示T 雷姆 -EGFR-WT肿瘤中的类细胞在直接杀伤癌细胞方面具有最高的抗肿瘤活性。
图4：基于标记基因表达、多重免疫荧光(IF)和流式细胞术分析的CD8+T细胞亚群特征。 a CD8的UMAP和镶嵌图 + T细胞这个 p -马赛克图中所示的数值是从单面卡方检验中得到的. b 影响CD8功能特性的标记基因表达点图 + T细胞子集-degs表示为红色圆，其统计显着性由点的大小表示. c 与细胞毒性有关的基因表达的小提琴图。 d 用于组织居住的特征基因表达的小提琴作图( ITGAE )和肿瘤反应性( ENTPD 1 )CD8 + T细胞亚群单个细胞的表达水平与小提琴图一起显示，并给出了表达每个标记基因的细胞比例(%)。e 与效应功能相关的基因表达的小提琴图。 f 与T细胞的幼稚或记忆状态相关的基因表达的小提琴图。 g 细胞毒性和T细胞活化相关基因表达的小提琴图。为便于比较，两组(EGFR-WT和EGFR-MT)的小提琴图被融合.EGFR-WT高表达的DEGS为DEG组. h EGFR-WT肿瘤标本中CD8、CD 103和GZMB的代表性复用 n =14)(标尺100μm：左，标尺50μm：右放大)和EGFR-MT( n (标尺100μm：左，标尺50μm：右侧放大)。星号标记三重阳性CD8。 + CD 103 + GZMB + 细胞。 i CD8细胞计数 + 、CD8 + CD 103 + ，和CD8 + CD 103 + GZMB + 每毫米 2 在EGFR-WT中 n =5)和EGFR-MT( n =4)病人在条形图中被描绘。 j CD8细胞计数 + 和CD8 + CD 103 + 每毫米 2 EGFR-WT独立患者的肿瘤( n =9)和EGFR-MT( n =10)验证用条形图(*)表示。 p ≤0.05，双面试验). k 7000例活门控CD3流式细胞术数据的TSNE可视化 + 从EGFR-WT中分离的细胞( n =3)和EGFR-MT( n (3)肿瘤标本。每个单元格被标记为一个点，其颜色刻度根据 z -标记蛋白(CD8、CD 103或GZMB)的表达值。 l CD 103表达的等高线图和总结图 + CD8细胞 + EGFR-WT中的T细胞 n =16)和EGFR-MT( n =19)从独立病人中收集肿瘤以供验证(*) p ≤0.05，双面试验). m GZMB表达式的有代表性直方图和总结图 + CD8细胞 + CD 103 + EGFR-WT中的T细胞 n =16)和EGFR-MT( n =19)从独立病人中收集肿瘤以供验证(*) p ≤0.05，双面试验).数据用平均±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。
我们在整个幻灯片中使用多路复用的IF来评估选定分子(CD8、CD 103和GZMB)的蛋白表达，以确定T的存在。 雷姆 -档案组织标本中的类似细胞。CD8丰度 + 、CD 103 + CD8 + ，以及GZMB + CD 103 + CD8 + T细胞在EGFR-MT中倾向于低于EGFR-WT(如图所示)。 4H，i 和附图。斯 10 , 11 ，补充数据 4A )，与基于转录水平的结果一致。19例非小细胞肺癌患者肿瘤样本的验证集(补充数据) 5A )，我们可以观察到CD8的丰度明显降低 + 和CD 103 + CD8 + EGFR-MT中的T细胞与EGFR-WT的比较(图1)。 4J 和补充图。斯 12 ，补充数据 4C )。为进一步验证，我们使用多种抗体(包括抗CD8、抗CD 103和抗gzmb)进行了流式细胞仪分析，以验证另一组由35例非小细胞肺癌患者EGFR-WT( n =16)或EGFR-MT( n =19)(补充数据 5B )。T 雷姆 -CD8细胞中CD 103和GZMB高表达，类细胞亚群高度富集。 + 与EGFR-MT相比，EGFR-WT中的细胞(圆点内的面积)。 4K )。CD 103的比例 + CD8细胞 + 细胞和GZMB细胞 + CD8细胞 + CD 103 + EGFR-MT组细胞数明显低于EGFR-WT组(见图)。 4L，m )。因此，CD8的消耗 + T雷姆 -EGFR-MT肺癌中的样细胞经蛋白质免疫表型分析证实.
T的稳态 雷姆 -EGFR-MT肿瘤样细胞受损 到目前为止，我们对EGFR-WT和EGFR-MT进行的比较单细胞转录组分析显示，肺肿瘤中有三种淋巴细胞亚群明显减少。 EGFR 突变：B细胞，CD4 + TFH -样细胞和CD8 + T雷姆 -像细胞考虑到肺癌患者 EGFR 突变表现出不利的抗PD-1反应，调节这些淋巴细胞亚群的协同作用可能对肺癌的抗肿瘤免疫有重要意义。主要溶细胞酶如穿孔素和GZMB在T中的高表达 雷姆 -类细胞，T的持久性 雷姆 肿瘤细胞状态可能是肿瘤细胞有效杀伤的主要决定因素。
T的稳态评价 雷姆 -在EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤中，我们测量了CD8之间的转移概率。 + 子集(C0、C2、C11和C14)；图1。 5A )基于速度分析的天鹅绒细胞(Velocyto)。 52 ，根据未剪接mRNA与剪接mRNA的比值来估算。根据所有基因未来mRNA丰度的概率，我们可以预测每个细胞的未来状态(子集)。 5B )。例如，EGFR-MT中从C2到C0的平均转变概率高于EGFR-WT，而从C2到C2(即C2状态的持久性)在EGFR-WT中高于EGFR-MT(如图所示)。 5C )。我们比较和计算了EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤在C0、C2、C11和C14四个亚群之间的转移概率，以确定肿瘤的稳态变化。值得注意的是C2(T) 雷姆 从EGFR-WT和EGFR-MT中分离出的-样细胞的持久性概率分别为0.57和0.41。 5D 和补充数据 6 )。相反，所有其他子集在EGFR-WT和EGFR-MT之间表现出相似的持久性概率：C0为0.77比0.76，C11为0.16 vs.0.16，C14为0.042比0.034。我们还表演了scvelo 53 在没有稳态假设和观察到的一致结果的情况下能够估计RNA速度的分析(补充图)。斯 13 )。这些结果表明T的持久性 雷姆 EGFR-MT肺癌细胞状态受损.
图5：可预测肺癌抗Pd-1反应的TRM样子集稳态调节。 a CD8的UMAP图 + 具有四种不同细胞子集颜色代码的T单元格。 b 在预定义的CD8的UMAP图上显示了细胞的转移概率。 + EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤的T细胞。只有三个主要的CD8亚群 + T细胞(C0，C2和C11)出现在这里。较长的箭头表示更高的转换概率。 c 在两个不同的肿瘤组中，从C2子集到C0子集(上)和从C2子集到C2子集(即C2持久性)的转移概率分布的直方图。从这些直方图中，EGFR-MT的C2细胞更有可能过渡到C0，而EGFR-WT的C2细胞则倾向于在C2状态下存活。 d 三个主要子集之间的过渡摘要。C0和C11在EGFR-WT和EGFR-MT(中、底部)之间的持久性差异无显着性，而C2在EGFR-WT中的持久性高于EGFR-MT(TOP)。 e 火山图显示T 雷姆 -类细胞(C2)与其他CD8亚群比较 + T细胞TFS用红色表示。 f Spearman秩相关的热图可视化 RBPJ 或 NOTCH 1 与T相关的基因 雷姆 EGFR-WT和EGFR-MT肿瘤中的细胞分化或维持(列)。 g 具有回归曲线的散点图，这些曲线突出了大幅度减少甚至反转之间的相关性。 RBPJ 与EGFR-WT肿瘤相比，EGFR-MT具有潜在的调节性靶基因。 h T丰度的示意图 雷姆 -TCGA、LUAD和LUSC标本EGFR-WT和EGFR-MT中的样细胞，用CIBERSORTx标记矩阵评分法估算。 i 根据从永世癌症中心(YCC)招募的非小细胞肺癌患者(YCC)和Jung等人的非小细胞肺癌(NSCLC)患者队列描述抗Pd-1反应的瀑布图。基线代表CIBERSORTx评分的中位数，代表肿瘤浸润T的比例。 雷姆 -像细胞全 p -数值是用单尾Mann-Whitney计算的。 U 试验(检测应答者状态与肿瘤浸润T比例的关系) 雷姆 -类似细胞)。 j 基于肿瘤浸润T比例的响应器接收机工作特性曲线下面积 雷姆 -像细胞源数据作为源数据文件提供。
缺口-RBPJ维护T的调节网络 雷姆 EGFR-MT肿瘤细胞受扰 转录调控网络严格控制免疫细胞的分化和功能维持。我们假设T细胞内转录调节网络的调节失调 雷姆 细胞状态发生在EGFR-MT肺癌中.为了重建关键的调控网络，我们首先在C2子集中识别出与其他CD8不同的上调转录因子(TFs)。 + 细胞亚群(图1. 5E )。在被放大的TFs中， ID2 , RBPJ ，和 BHLHE 40 与T有关 雷姆 细胞发育与动态平衡 54 ,55 ,56 。特别是，RBPJ与缺口相关联，形成维持T所需的转录激活剂。 雷姆 人体细胞 55 。接下来，我们比较了EGFR-WT和EGFR-MT之间的RBPJ共调节网络，以确定两种肺肿瘤分子亚型之间RBPJ调控靶点的得失。为了提高基因-基因相关分析对高度稀疏scrna-seq数据的鲁棒性，我们使用了Metacell。 57 分析方法，将单细胞转录组剖面划分为不相交的同质组.正如我们所预期的，我们观察到 RBPJ 还有许多已知的T基因 雷姆 细胞分化与维持 45 ,46 ,47 在C2细胞中来自EGFR-WT肿瘤的细胞(如图所示)。 5F )。此外， NOTCH 1 与相同的调节性靶基因高度相关，但与其他CD8相比，C2亚群中未见明显上调。 + 细胞亚群。有趣的是，许多转录相关 RBPJ 在EGFR-MT的C2亚群细胞中消失。特别是.的表达 RGS 2 , NOTCH 1，RGS 1 , PDCD 1 , CRTAM , CXCR 6 , TIA 1 , HIF1a , NAB 1 ，和 ITGAE 正相关 RBPJ 在EGFR-WT的C2子集中，EGFR-MT的C2子集中的基因-基因相关性丢失，甚至呈负相关(图1)。 5G 和补充数据 7 )。在EGFR-MT中，转录相关的缺失更为明显。 NOTCH 1 (无花果) 5F 和补充数据 7 )。这些结果表明肿瘤浸润性T细胞持续存在。 雷姆 细胞状态依赖于Notch-RBPJ调控网络，在EGFR-MT肺癌中调控异常.
肿瘤浸润性T细胞比例 雷姆 -样细胞对非小细胞肺癌抗pd-1反应有高度的预测作用。 考虑到肿瘤浸润T的比例 雷姆 -EGFR-MT肺肿瘤中的样细胞减少，对抗pd-1免疫治疗反应不佳，我们推测T的相对丰度。 雷姆 肿瘤中的类细胞本身可以预测抗Pd-1反应.目前对每种免疫细胞类型所占比例的金标准估计是用特定于每一种细胞类型的标准标记进行流式细胞术分析。然而，这种方法只适用于主要的细胞类型或特征良好的标记基因的亚型。单细胞生物学能够发现越来越多的细胞亚群，识别这些子集的特定标记将是一项艰巨的任务。因此，利用细胞类型特异性表达特征对异质细胞群中的细胞子集进行量化，最近得到了应用.为了推断肺癌组织中18种免疫细胞的表达特征，我们应用CIBERSORTx技术。 58 ，提出了一种将特定细胞类型的基因表达特征推断为单细胞转录组谱的反褶积方法，并生成了一个由18个子集组成的特征矩阵(补充数据)。 8A )。然后我们估计了T的相对丰度 雷姆 -肺癌(LUAD)和肺鳞状细胞癌(LUSC)肿瘤基因组图谱(TCGA)中的类细胞 59 。与单细胞转录组的结果一致，T的特征评分 雷姆 -在具有野生型EGFR的TCGA肿瘤中，样细胞显著高于突变型( p =0.0173，单尾曼恩-惠特尼 U 试验)(如图所示。 5H 和补充数据 8B )。这一结果证实了推断的表达式特征是T相对丰度的一个合适的估计量。 雷姆 -肿瘤中的类似细胞。
接下来，我们评估了T的表达式签名。 雷姆 用大量的rna-seq数据和两组独立的非小细胞肺癌(GSE 126045和GSE 135222)的临床信息来预测抗pd-1免疫治疗的反应(GSE 126045和GSE 135222)。 60 ,61 。值得注意的是，我们观察到了特征性评分之间的正相关关系，表明肿瘤浸润性T细胞丰富。 雷姆 -类细胞和抗PD-1反应在这两个队列(图)。 5I 和补充数据 8C，d )。在两个非小细胞肺癌组中，应答者的签名分数显著高于非应答者( p =0.0114和0.0404，单尾曼恩-惠特尼 U 测试)。此外，我们对表现出最高特征评分的患者进行了优先排序。这种分层导致大面积的接收机操作特征曲线(AUROC)评分，表明高丰度肿瘤浸润T。 雷姆 -样细胞是抗PD-1反应的一个预测指标。 5J )。值得注意的是，Yonsei癌症中心招募的18名患者中只有2名。 60 EGFR-MT；一个是应答者，另一个不是(Jung等人的EGFR突变状态信息)。 61 )。因此，T的标识表达式签名 雷姆 -样细胞本身可以作为一种生物标记物，将肺癌患者分层进行抗pd-1免疫治疗，而不考虑他们的作用。 EGFR 突变状态。
CXCL 13-CXCR 5介导的T FH -B和T 雷姆 -B相互作用在EGFR-MT肿瘤中调控失调 以前的研究也表明T FH 细胞释放CXCL 13吸收B细胞进入TLS 35 ，然后将肿瘤抗原呈现给T细胞。 62 。正如我们的研究所证明的，CXCL 13生产T的丰富程度。 FH -EGFR-WT组的EGFR样细胞高于EGFR-MT组(图1). 3E，f )。这些观察表明，吸收B细胞进入肿瘤的TLS在EGFR-MT中变得不那么有效，这可能是由于CXCL 13-CXCR 5介导的相互作用丧失，导致细胞毒性T细胞激活减少。为了检验这一假设，我们评估了T之间的细胞间相互作用。 FH -样细胞(C9)、B细胞(C8)和细胞毒性T 雷姆 -使用CellPhoneDB的类细胞(C2) 63 。我们发现EGFR-WT中的细胞与细胞之间的相互作用比EGFR-MT更显着。 6A )。我们发现T FH -B细胞通过CXCL 13-CXCR 5轴的相互作用在EGFR-MT(低配体和受体的平均表达)明显弱于EGFR-WT。值得注意的是，我们还可以检测到CXCL 13-CXCR 5-介导的T之间的相互作用。 雷姆 -B细胞在EGFR-WT中，而在EGFR-MT中不存在.的确，T 雷姆 -样细胞也表达 CXCL 13 虽然没有T那么多 FH -像细胞
图6：t FH -B-T 雷姆 肺肿瘤中淋巴细胞的相互作用及其共同定位。 a 总结CD8-C2(T)细胞间相互作用的点阵图 雷姆 -类似)、B和CD4-C9(T) FH -CellPhoneDB分析细胞。这里只有重要的配体-受体相互作用。圆的大小表示统计意义，颜色梯度表示基因对的平均表达值。 b EGFR-WT中TLS样病变的代表多路免疫荧光(IF) n =14)(标尺100μm：左，标尺50μm：右放大)和EGFR-MT( n (下)(标尺100μm：左，标尺50μm：右侧放大)肿瘤。EGFR-WT中TLS样病变面积汇总图( n =5)和EGFR-MT( n =4)单细胞分析肿瘤(**) p ≤0.005，双面试验)(上面板)和EGFR-WT( n =9)和EGFR-MT( n =10)独立患者的肿瘤供验证(* p ≤0.05，双面试验)(下面板). c EGFR-WT肿瘤组织中CD4、CXCL 13、CD 103、CD8、CXCR 5和CD 20的代表性复用 n =14)(左)(标尺100μm)和EGFR-MT( n 14)(右)(标度BAR 100μm)患者。 d EGFR-WT中TLS样病变中每种细胞类型数目的汇总图( n =5)和EGFR-MT( n (4)病人。CD4数 + 、CXCL 13 + CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，CD 103 + CD8 + T细胞在EGFR-WT中显著高于EGFR-MT(* p ≤0.05，** p ≤0.005，双面试验). e EGFR-WT中TLS样病变中每种细胞类型数目的汇总图( n =9)和EGFR-MT( n =10)独立患者的肿瘤进行验证。一直以来，CD4的数量 + 、CXCL 13 + CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，CD 103 + CD8 + T细胞在EGFR-WT中显著高于EGFR-MT(**) p ≤0.005，* p ≤0.0005，双面试验). f T模型的说明性总结 FH -B-T 雷姆 淋巴细胞在肺癌抗肿瘤免疫中的协同作用。数据用平均±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。
最近，一个PD-1 + CD8 + 在肺癌TLS的B细胞区附近检测到分泌CXCL 13的T细胞亚群。 64 。与EGFR-MT相比，EGFR-WT的B细胞在抗原处理和呈递过程中表现出更多的分子。 三维空间 )。这些分子将促进CD4的活化。 + TFH -样细胞(通过MHCⅡ级)和CD8 + T雷姆 细胞(通过MHCⅠ级)。因此，抗原提呈能力的增强可能促进B细胞的增殖，刺激肿瘤特异性CD8。 + T雷姆 细胞。在EGFR-WT中，CD8的丰度 + T雷姆 -样细胞及其GZMB的产量均高于EGFR-MT(图1)。 4H，i，k，m )。因此，CD8的比例增加了 + T雷姆 -样细胞可以通过产生GZMB之类的溶细胞材料来有效地溶解癌细胞。
为了验证我们的假设，我们首先定义了tls样病变的区域(见“方法”部分)，然后评估T的丰度。 FH -类似(CXCL 13) + CD4 + )，B(CXCR 5) + CD 20 + )，以及T 雷姆 -类(CD 103) + CD8 + )存档肿瘤组织标本TLS样病变中的细胞。有趣的是，我们发现在EGFR-MT中，TLS样病变的总面积明显小于EGFR-WT(图1)。 6B 、左、右面板和补充数据 4A )。对于19个用于多路复用的独立肿瘤样本的验证集，我们还观察到EGFR-MT中TLS样病变的面积小于EGFR-WT(图1)。 6B ，右下面板和补充数据 4C )。在整体tls样病变中，CD4的数量要少得多。 + 和CD8 + 在EGFR-MT中发现T细胞，而EGFR-WT中发现T细胞(如图所示)。 6C，d 和附图。斯 10 , 11 )。值得注意的是，T的数目 FH -类似(CXCL 13) + CD4 + )和T 雷姆 -类(CD 103) + CD8 + EGFR-MT细胞明显低于EGFR-WT(图1). 6C，d 和附图。斯 10 , 11 ，补充数据 4B )。我们从19个独立肿瘤样本的验证集中观察到一致的结果(如图所示)。 6E 和补充图。斯 12 ，补充数据 4D )。这些结果表明，CXCL 13-CXCR 5介导的T之间的相互作用 FH -B和T 雷姆 -B细胞支架T FH -B-T 雷姆 淋巴细胞在肺癌抗肿瘤免疫中的协同作用如图所示。 6f
