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甲状腺乳头状癌发生发展过程中肿瘤生态系统的单细胞转录分析

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发表时间:2021-10-25 15:01作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

甲状腺乳头状癌(PTC)的肿瘤生态系统特征较差。应用单细胞RNA测序,我们分析了来自11例患者癌旁、局部/晚期肿瘤、最初治疗/复发淋巴结和放射性碘(RAI)难治性远处转移的158,577个细胞的转录序列,涵盖了PTC的综合临床过程。我们的数据确定了一个“癌症引发的”癌前甲状腺细胞的正常形态,但改变的转录。在发育过程中,我们还发现了三种恶性甲状腺细胞(滤泡样、partial-epithelial-mesenchymal-transition-like,脱分化样)的表型,它们的组成形成了大量的分子亚型、肿瘤特征和RAI反应。此外,我们还发现了一个独特的BRAF以脱分化样甲状腺细胞为主的类B亚型,丰富了癌相关成纤维细胞,预后差,免疫治疗前景广阔。此外,PTC中潜在的血管免疫串扰为抗血管生成和免疫治疗联合应用提供了理论依据.总之,我们的发现提供了对PTC生态系统的洞察力,这表明了潜在的预后和治疗的影响。

导言

在过去四十年中,美国甲状腺癌的发病率每年增长3%,主要是由于乳头状甲状腺癌(PTC)的上升所致。1。虽然大多数PTCs临床过程缓慢,但在诊断时已发展为局部甚至远处转移性疾病。在复发或转移的情况下,结合手术、放射性碘(RAI)消融和甲状腺刺激素(TSH)抑制,大多数病例仍能获得良好的预后,而一小部分患者最终会进展为RAI难治性(RAIR)状态,甚至会屈服于这种疾病,他们可能是分子靶向抑制剂和免疫治疗等替代疗法的潜在选择。2,3。进展性PTCs的发展趋势对临床实践提出了挑战,并促使研究人员进一步破译其生物结构。

Ptc的大规模测序提高了我们对它的遗传特性的理解。2,4,5。例如,检测到BRAFV600ETERT启动子突变有助于鉴别恶性甲状腺结节和鉴别具有脱分化潜能的患者。5,6...然而,从早期到晚期,或者从RAI到RAIR状态,PTC进化的生物学基础尚不清楚。虽然大片段测序可以勾勒出整个肿瘤实体的基因景观,但它不可避免地使不同细胞的表达谱平均化,并掩盖了肿瘤组分之间的关键差异。这突出了阐明复杂肿瘤微环境(TME)的组成、性质和潜在机制的迫切需要。单细胞RNA测序(scRNA-seq)使我们能够量化单个细胞的特征,是研究TME中细胞成分及其相互作用的有力工具。目前,scrna-seq已被广泛应用于多种癌症中。7。然而,对PTCs的单细胞分辨性能的改进仍然是不够的.

本文应用scRNA-seq对11例PTC患者的癌旁、局限性或晚期肿瘤、初治或复发淋巴结(LNS)和RAIR远处转移的158,577个细胞进行了分析,涵盖了本病的综合临床过程,填补了目前人类PTC单细胞图谱的空白。利用这一独特的资源,我们分析了PTCs中的细胞谱系、转录状态、发育轨迹和细胞-细胞串扰,从而揭示了PTC启动和发展的肿瘤生态系统。

结果

甲状腺乳头状癌生态系统单细胞表达图谱

为全面解决PTC发生和发展过程中肿瘤生态系统的异质性,我们用scRNA-seq(10X基因组学)对11例新鲜标本的肿瘤和基质细胞进行了分析。1A),包括6个癌旁组织,7个原发肿瘤,8个累及LNS,2个属于PTC远处转移的RAIR皮下位点。除经典PTCs外,3例经仔细病理检查诊断为滤泡变异(FV,例5和7)或高细胞变异(TCV,例6)。补充资料提供详细的临床病理资料。1。此外,还对这些患者的基因组突变进行了全外显子测序(Wes)和Sanger测序,以及与ptc相关的关键突变的状况(BRAF, RAS, TERT提供了(补充数据)2;补充表1)。除了病例4、6和7只有复发位点外,其余8例患者均采集成对样本进行scRNA-seq分析。例如,在病例11中,通过计算机断层扫描(CT)、临床检查和病理检查来确定所涉及的LNS和皮下远距离位点,以确保分析所需的组织是正确的(补充图)。1A,b)。通过这种方法,我们的队列涵盖了一个相对全面的组织镜像肿瘤的进展过程,包括癌旁,原发病灶,淋巴结转移和RAIR远处转移。

图1:PTCs中158,577个单细胞的表达谱。
figure1

a本文对23个样品进行了样品组成、加工和生物信息学分析的工作流程。b所有高质量细胞的T-SNE图,在本研究中按主要细胞谱系着色。c,主要细胞系的典型标记基因和策划人标记基因的热图。dT-SNE投影显示免疫细胞的景观,由团簇(左)和组织(右)着色。e对每个免疫细胞群的组织偏好估计滚装/。源数据在源数据文件中提供。

共有158,577个单细胞中位1,215个表达基因通过严格的质量过滤,并被纳入进一步的分析(图1)。1B;补充表2)。在整合了所有获得的细胞的转录数据后,我们首先应用低分辨率t-分布随机邻居嵌入(t-sne)聚类,确定了6种主要的细胞群,它们被标记为T/自然杀伤(NK)细胞(NK细胞)。CD3D, CD3E, CD3G, CD 247),B细胞(CD79A, CD79B, IGHM, IGHD)、甲状腺细胞(热重, 埃帕姆, KRT 18, KRT 19),髓系细胞(利兹, S100A8, S100A9, CD 14)、成纤维细胞(COL1A1, COL1A2, COL3A1, ACTA 2)和内皮细胞(PECAM 1, CD 34, 环磷酰胺5, VWF)(图1.1C;补充图。1C)。这些人群中的每一个都是从不同组织类型的不同患者中捕捉到的(补充图)。1D, e)。此外,所有这些细胞类型的进一步验证使用另一个scRNA-seq研究的PTC(补充图)。1F, g)8.

随后,我们试图通过高分辨率的t-sne分析来描绘一个更详细的免疫景观.根据T、NK、B和髓系细胞的差异表达基因(DEGS)类型,将其划分为22个较精细的亚类。1D)。具体来说,T细胞是根据细胞的表达水平而被二分法分割的。CD4CD8,进一步将CD4分为7个簇。+CD8细胞和4组细胞+NK细胞、B细胞和髓样细胞分别分为2、3和6个亚组。1D)。每个集群被赋予一个假定的身份,显示其潜在的功能能力,并表现出不同的组织富集偏好,以每个集群中观察到的细胞数与预期细胞数的比率来量化(滚装/)在以前的报告中9,10(无花果)1E;补充表3).

例如,CD4-c6和CD8-c4簇表达上调的水平。Foxp 3PDCD 1(编码程序性细胞死亡蛋白-1,pd-1),对应于调节性CD4。+T细胞(Treg)与精疲力竭的CD8+T细胞(Tex)9,两者均负调控抗肿瘤反应(补充表)3)。此外,c8-c3的细胞毒性标记基因也被上调。GNLY(编码颗粒素),可能作为效应T细胞11(补充表)3)。与癌旁组织相比,Tregs、Tet和效应T细胞均在肿瘤组织中富集,提示PTC环境中宿主免疫反应和肿瘤免疫逃逸共存。1E)。此外,ISG 15-表达CD4+T细胞明显富集于癌旁。以前的研究表明ISG 15可能参与自然杀伤(NK)细胞的增殖、树突状细胞的成熟或其他天然免疫反应。12,13,14。然而,这一子集群在PTC中的确切作用还有待进一步研究。

然而,细胞毒性CD8-c3-GNLY细胞并没有在皮下位点富集,取而代之的是Tregs和TENCE的丰度,以及另外两个免疫细胞簇,CD8-C1和Mφ-c3(图1)。1E)。C8-c1细胞具有较高的表达量。GZMK,据报道,它是效应细胞和耗尽的T细胞之间的中间状态。15,而Mφ-c3簇呈现出高水平的CCL 18在肿瘤前M2巨噬细胞中被上调16,17。同时,具有吞噬能力的Mφ-C1-RGS 1簇在此区域表现为稀疏。1E;补充表3)。这些结果提示PTC皮下转移的形成和发展可能需要比原发肿瘤和淋巴结病更多的免疫抑制性TME。

甲状腺细胞的单细胞转录谱显示出一种组织起源相关的模式。

为了研究甲状腺细胞的单细胞转录异质性,我们采用了一种非线性降维技术&均匀流形近似与投影(Umap)。18,将它们沿着上皮细胞谱系分为9个不同的簇(图1)。2A)。UMAP图中的聚类分布显示,甲状腺细胞的表达程序具有明显的异质性,但与其样本来源密切相关(图1)。2B)。此外,我们发现C03、C05、C06和C09主要由单个样本的细胞定义。因此,我们使用每个簇的dgs进行了路径富集分析,并为每个簇确定了不同的上调和下调路径,表明它们的差异归因于肿瘤间异质性而不是批处理效应造成的生物多样性(补充表)。4;补充数据3)。在9个类群中,C01和C02分布于其他种群,这两个种群都主要来自于副瘤菌。相应地,绝大多数癌旁细胞归为C01/C02团簇,而C03-C09细胞几乎全部由原发肿瘤、LNS和皮下转移标本中的甲状腺细胞组成。2B,补充图。2A,b;补充表4C01/C02和C03-C09可能分别代表非恶性和恶性甲状腺细胞。

图2:不同组织类型间恶性甲状腺细胞及其转录异质性的鉴定。
figure2

36,265个甲状腺细胞的UMAP投影a)集群和(b)组织。cC01~C09甲状腺细胞簇间成对Spearman相关性的热图。显示TDS分数为(d)每个甲状腺细胞簇和(e)组织型。每组的细胞数列在补充表中。4。中线显示中间线(中心线),下铰链和上铰链显示25%-75%的四分位数范围(IQR),晶须在最大1.5x IQR范围内从铰链延伸到最远的数据点。(())之间顶部的热图。f)恶性和非恶性甲状腺细胞,(g)肿瘤源性和LN源性恶性甲状腺细胞,和(h)肿瘤源与皮下位点来源的恶性甲状腺细胞。源数据在源数据文件中提供。

为了进一步验证这一假设,我们用三种互补的方法澄清了它们之间的差异。首先,我们计算了所有簇的平均表达程序,其中C01和C02高度相关(Pearson‘s)R=0.82),而其余7个集群显示出更密切的联系(Pearson‘sR>0.62),提示C01/C02与其他群体的不同转录谱(图1)。2C)。其次,我们计算了每个甲状腺细胞的甲状腺分化评分(TDS),这是一种广泛应用的评估PTC分化状态的算法。4。C01/C02甲状腺细胞具有较高的TDs值,并可上调甲状腺分化相关基因,如TFF 3, TPO, 热重,和DIO 2,而c03-c09簇的tds评分较低,ptc相关基因的表达增加,例如S100A4, FN1, IGFBP 6,和KRT 19(无花果)二维空间;补充图。2C,d)。第三,我们根据癌症基因组图谱(Tcga)数据集(“方法”)中的ptc案例构建了机器学习分类器,该分类器在Yoo等人的研究中获得了97%的敏感性和96%的特异性。19(可查阅EBI欧洲核苷酸档案数据库,登录号为PRJEB11591)(补充表)5)。随后,将该分类器应用于scrna-seq谱,并显示出良好的鉴别能力,根据c01、c02和c03-09细胞的非恶性或恶性特性,分别达到95%、97%和98%以上(补充表)。6)。这些数据共同验证了我们的方法的准确性,该方法自信地区分PTCs中的恶性(C03-C09)和非恶性(C01,C02)甲状腺细胞。

对于恶性肿瘤,来自转移灶的甲状腺细胞的分化程度通常低于原发肿瘤的分化程度(图1)。2E)。因此,除了恶性和非恶性甲状腺细胞之间的整体差异(图)。2F),恶性成分中的转录异质性也值得进一步研究。与原发肿瘤的恶性细胞相比,其淋巴结转移的特征是基因的上调。MT1X, MT2A, MT1E, MT1G)在金属硫蛋白家族中。2G)。另一方面,与低tds评分一致的是,rai后皮下转移性甲状腺细胞缺乏。热重同时优先表达一组与上皮间充质转换(EMT)相关的基因。CLDN 3, CLDN 4),细胞周期(S100A4, HSPB 1)和应激反应(FOS, IER 2)(图1.2H)。此外,我们还鉴定了22个与TDS评分显著正相关的基因(Pearson‘s)。R>0.5,P < 0.05) at single-cell resolution (Supplementary Table 7)。其中,8个基因(MT1F, SORBS 2, MT1G, SORD, SLC26A4-AS1, PRDX 1, FCGBP, MATN 2)未被报道参与甲状腺分化。这些基因在PTC肿瘤发生中的作用和作用值得进一步探讨。

其中最不规范的(原木)2不同来源甲状腺细胞的折叠变化>2,fdr<0.05)。TMSB4X在PTC中未见报道,其在恶性细胞中的表达明显高于非恶性细胞(如图所示)。2F;补充表8)。此外,我们还观察到TMSB4X原发癌细胞向LN转移细胞的表达(图)。2G)。与scrna-seq的发现一致,tcga和prjeb 11591队列验证了TMSB4X从癌旁到N0期肿瘤到N1期肿瘤的大量表达(补充图.)3A,b)。在蛋白水平上,免疫组织化学(IHC)染色显示,与癌旁正常甲状腺细胞相比,2例肿瘤细胞(经典的PTC和FV-PTC,附图)中TMSB4X的表达明显增高。3C,d)。综合起来,这些数据突出显示TMSB4X作为一种具有暗示性的生物标志物,可能参与PTC的启动和进展。

具有致癌特性的癌前甲状腺细胞群的鉴定

如图所示。二维空间C01细胞与C02细胞TDS评分不一致,提示非恶性细胞内存在异质性表达。然后,我们试图探讨这两个群体之间的单细胞转录序列的差异。T-SNE分析表明,C01和C02细胞代表两种不同的非恶性甲状腺细胞状态(图1)。3A),根据京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析,C02簇在细胞增殖相关途径(氧化磷酸化、MYC_Target_V1)和应激反应(DNA修复、缺氧)中富集。4A)。此外,轨迹分析进一步表明了C01和C02种群之间的潜在跃迁(图1)。3B)。具体来说,从c01到c02到恶性(c03-09)簇,我们观察到经典甲状腺上皮标记物的下降趋势。热重, TPOIYD的上升趋势TMSB4X随着PTC的启动和进展,这种情况也随之增加(见图)。3C,补充图。4B)。因此,就转录谱而言,C02簇可能不是完全正常的甲状腺细胞,而是一种癌前状态。

图3:甲状腺癌前细胞的鉴定和转录特性。
figure3

a两组非恶性甲状腺细胞(C01和C02)的T-SNE投射。b用Monocle 2推断C01和C02细胞的潜在轨迹。箭头显示了从C01到C02簇的发展方向。c小提琴的情节显示了C01,C02和C03-C09集群之间的几个层次。表达水平热重, TPO,和IYD减少,而TMSB4XC01~C02和C03~C09甲状腺细胞持续增加。d例5原发肿瘤(T5)和癌旁肿瘤(P5)代表H&E染色,放大倍数分别为×20、×100和×400。进行了三个独立的实验,并产生了相似的结果。标尺(上)=300米;标尺(中)=100米;标尺(底部)=50米。e显示癌前癌旁甲状腺细胞TDS评分的X线图(n=1036),恶性癌旁瘤(n=118),肿瘤(n=1337)和淋巴结转移(n箱形图的中线为中线(中心线),上下铰链为25%-75%的四分位数范围(IQR),晶须从铰链延伸到最大1.5x IQR范围内最远的数据点。f例5甲状腺细胞(P5癌前细胞、P5/T5/LN5r恶性细胞)的轨迹分析箭头显示了从P5癌前甲状腺细胞到P5/T5/LN5r恶性甲状腺细胞的潜在进化方向。g正常甲状腺细胞(C01)与癌前细胞(C02)表达上调和下调基因表达的热图。源数据在源数据文件中提供。

为了评价癌前C 02团簇的组织学特征,我们回顾了病例5的苏木精-伊红(H&E)染色切片,其癌旁组织(P5)捐献了该簇中的大部分甲状腺细胞。从P5标本的病理切片中,我们通过组织学上正常的卵泡结构证实了C02细胞的非恶性性质,表明异常表达程序尚未引起细胞形态的明显变化(白箭,图)。三维空间)。然而,尽管术前检查在P5区域缺乏阳性发现,但我们在H&E染色切片中观察到这些C02甲状腺细胞(白色箭头)内有多灶性隐匿性肿瘤灶(黄色箭头)(如图所示)。三维空间).

然后评价P5和T5(原发肿瘤)恶性肿瘤细胞的差异。与T5细胞相比,P5隐匿性癌细胞不仅具有多样的形态特征和较高的TDS评分,而且还占据着与P5癌前细胞更接近的进化位置(图1)。3D,e,f),表明它们更可能来源于邻近的癌前细胞,而不是通过腺内转移的原发病变。换句话说,这些数据支持了这些表面正常但转录改变的癌前细胞(C02)的致癌性质,这些细胞可能为恶性生长的爆发提供了种子和土壤。

最不受调控的基因2正常甲状腺细胞(C01)与癌前细胞(C02)之间的折叠变化>1,FDR<0.05,反映了PTC肿瘤发生过程中的早期转录变化。第三代;补充图。4B),其中PKHD1L1在癌前和恶性甲状腺细胞中明显下调(补充图)。4C;补充表9)。在散装剖面中,我们观察到PKHD1L1肿瘤组织与正常甲状腺组织的表达比较(TCGA队列,附图)。4D)。同时,我们也发现PKHD1L1不同组织学亚型卵泡模式下降的表达(PRJEB 11591队列,附图)。4E)。此外,在TCGA数据集中,PKHD1L1不仅预测了严重的无疾病生存(Dfs),P=0.0063)在甲状腺癌(补充图)。4F),同时也预测了肺腺癌的整体生存率(OS)。P=0.0013)和黑色素瘤(P=1.2e-6)(附图。4G,h),建议PKHD1L1可能作为肿瘤抑制基因在多个实体肿瘤中发挥作用。

发育轨迹定义了与肿瘤特征和RAI治疗反应相关的恶性甲状腺细胞的不同状态。

收集了不同临床过程的四种病变,为我们分析甲状腺上皮系的进化动力学提供了机会。为了反映这一过程,我们使用Monocle对所有获得的甲状腺细胞进行轨迹推断。我们发现轨迹估计的伪时间与TDS的变化趋势很好地吻合,BRAFRAS分数(图1.4A;补充图。5A,b),表明假性时间进展与恶性程度增高有很好的相关性。随后,我们的轨迹分析产生了三个发展层次(状态1-3),其中正常的C01和癌前的C02簇位于右上角,表明在这张地图上细胞进化有一个明确的起点(图1)。4B;补充表10)。在确认了这个起始点后,我们清楚地确定了从正常细胞起始的状态1开始的发育路线,然后分叉为状态2或状态3分支,这些分支都有丰富的转移点(如图所示)。4B).

图4:轨迹分析显示甲状腺细胞有三种不同的转录状态。
figure4

a散点图显示TDS评分与所有甲状腺细胞轨迹分析推断的假时间值呈显著负相关。b所有甲状腺细胞的电位轨迹分别以组织型(左)或簇(右)表示三种不同的细胞状态(状态1-3)。箭头在轨迹上显示出潜在的进化方向。c示意图显示了TDS分数的显著差异,RAS分数和BRAF国家成绩1(n=7873),国家2(n=12 354)和国家3(n=16,038)甲状腺细胞。中线显示中间线(中心线),下铰链和上铰链显示25%-75%的四分位数范围(IQR),晶须在最大1.5x IQR范围内从铰链延伸到最远的数据点。dTf(转录因子)活性在三种甲状腺细胞状态下的热图,按风景评分。e不同甲状腺细胞状态下标记通路活动的差异,用GSVA评分。f病例11的甲状腺细胞发育轨迹,以组织型(上面板)或TDS评分(下面板)着色。源数据在源数据文件中提供。

对于这三种状态,(1)几乎所有具有正常滤泡上皮特征的癌旁甲状腺细胞都集中在状态1,这似乎是恶性评分所反映的惰性状态(图1)。4C;补充图。5C)。同时,单细胞调控网络推理和聚类分析也预测了SOX 9在正常甲状腺分支卵泡发生中的关键转录因子(TF)20(无花果)4D)。因此,状态1被称为滤泡样甲状腺细胞表型.(2)另一方面,状态2基本上是肿瘤和LN转移甲状腺细胞的一半混合,在恶性程序中呈中间状态(图1)。4C;补充图。5C)。与LN转移的高比例相一致,状态2甲状腺细胞具有EMT的几个特征,包括细胞外基质相关基因的表达增加。SDC 4, ECM 1, LGALS 1),上调的EMT相关TFs(HMGA 2Egr1)和丰富的EMT信号通路。4D,e;补充图。5D)。尽管如此,尽管某些甲状腺上皮基因被下调(TPO, TFF 3, DIO 2),它仍然保持其他上皮标记物的整体表达(热重, KRT 18, 埃帕姆)(附图。5E,f)。此外,我们没有检测到其他经典的emt tf,如twist 1/2、zeb 1/2和snai 1/2。实际上,这类转录程序并不支持完整的emt,而是反映了一种称为部分emt的生物学过程,这一生物学过程已被多种癌症所特有。21,22,23。结合在一起,状态2被称为p-EMT样甲状腺细胞表型.(3)国家3,TDS得分最低,RAS得分最高BRAF记分,包含绝大多数RAIR皮下转移甲状腺细胞(图1)。4C;补充图。5C,g,h)。同时,状态3甲状腺细胞优先上调去分化相关TFs(GATA 2, MYC, SOX 4)和通路(E2F_靶点,缺氧,MYC_靶_V1)(图1。4D,e),同时显示甲状腺上皮标记物的最低水平(热重, TPO, TFF 3, DIO 2, ID4)(附图。5E,f)。此外,我们还从基因表达总括(GEO,登录号:GSE 148673)数据库中获得了间变性甲状腺癌(ATC)的scRNA-seq数据,并对所有共享基因进行了PTC图谱分析。结果发现,3状态甲状腺细胞与ATC细胞的Pearson‘s相关系数高达0.72。此外,TMSB4X,如上文所述,PTC进展的一个潜在的生物标记物也在国家3的最高水平上表达(补充图1)。5i,j)。结合这些观察,我们将状态3称为脱分化(Dediff)样甲状腺细胞表型。

除了总体情况,我们还分别描述了个体患者甲状腺细胞的进化路径。对于我们的scRNA-seq队列中的单个个体,甲状腺细胞进化动力学很好地符合病变的临床病理特征。例如,(1)在病例6中,右颈LN转移瘤(LN6r)的TDS评分较低,经病理诊断为TCV,这是一种典型的转移灶。BRAF-组织学亚型4。相应地,ln6r细胞在类似dediff状态下富集并增强。BRAF信号传递(附图)6A)。(2)同样,在病例10中,侵犯甲状腺软骨的进展期原发肿瘤(T10)比相匹配的LN转移灶(LN10r)更具有代表性的乳头状结构。根据这一病理观察,T10细胞在轨迹上比LN10r细胞更接近进化终点(补充图)。6B).

此外,单个个体的甲状腺细胞进化动力学也可以为其对RAI治疗的不同反应提供合理的解释。如上所述,来自两个RAIR皮下位点(SC4和SC 11)的甲状腺细胞主要位于状态3,TDS评分非常低(图1)。4F;补充图。6C),导致了一个关于RAIR病和丰富的Ddiff样细胞之间的密切关系的逻辑假设。值得注意的是,这一假设得到了我们队列中两个FV-PTC病例(例5和例7)病程的支持。(1)在病例7中,右LN转移瘤(LN7r)主要位于滤泡样和p-EMT样状态。6d)。尽管术前CT扫描和术后病理检查(15/31转移性LNS)有广泛的淋巴结参与,但经过两次辅助RAI治疗后,在12个月的随访期内,他没有发现血清甲状腺球蛋白(TG)和全身RAI阴性的肿瘤复发迹象。(2)与之形成鲜明对比的是,另一例FV-PTC患者(例5)的情况似乎要严重得多。这位15岁的男性,有一个大的原发病变,在初次手术中有广泛的颈部和肺转移,到目前为止已经经历了三次术后RAI治疗,累积剂量为400 MCI(补充图)。7a,b)。尽管第一次给予RAI后血清TG暂时下降,但在接下来的两次RAI治疗中,他的TG水平迅速反弹并超过了基线值,伴随着肺转移瘤的持续X线进展(补充图)。7A-c)。在发育轨迹上,我们发现这个病例含有大量的退化样细胞(补充图)。7D),这可能是他的RAIR临床课程的原因。

精散装分子亚型BRAF-类亚类,预后差,有良好的免疫治疗前景。

为了探讨甲状腺细胞scrna-seq衍生信号的共性和预后意义,我们通过基因表达与每个甲状腺细胞假时间的相关性,鉴定了480个假时相关基因(补充数据)。4)。由于这些基因纯粹代表甲状腺上皮谱系的特征,而不是各种肿瘤成分,因此我们的目的是改进传统的甲状腺上皮基因。BRAF-/RAS-类分子亚型算法4基于PAGS,使用集成两个大容量rna-seq轮廓的队列(tcga和prjeb 11591,补充数据)。5;“方法”)。一般来说,我们精细的分子分类改变了BRAF-类似或RAS-6.9%(42/613)患者在整体队列中的类似任务,包括RAS-以前被分类为BRAF-相似的亚型,反之亦然(图)。5A;补充数据5).

图5:大批量RNA-seq谱的修改分子亚型和反褶积。

a顶级假时间相关基因的热图(n=480)在613个PTCS中(TCGA和PRJEB11591)。分层聚类识别了PTCs的三种分子亚型。b三种PTC分子亚型的TDS评分差异,RAS-像(n=161),BRAF-就像-A(n=253)和BRAF-类似-B(n=199)在我们的研究中定义的。c患者无病生存的Kaplan-Meier图BRAF-就像-A(n=191)和BRAF-类似-B(n=171)TCGA队列中的PTCS。对数等级测试(双面)。d谷胱甘肽区的地块显示出明显丰富的路径BRAF-类-B亚型与BRAF就像-一个亚型eH&E染色或IHC图像显示有明显的免疫浸润,BRAF V600E突变蛋白和pd-L1蛋白在病例10原发瘤(T10)中的阳性表达。我们进行了三个独立的实验,并产生了类似的结果。标度BAR=50μm。反褶积分析显示甲状腺细胞表型组成。f) RAS-类亚型(n=161),(g) BRAF-类似-A亚型(n=253)和(h) BRAF-类似-B亚型(n=199)。在(b), (f), (g)和(h中线显示中线(中线),下铰链和上铰链显示25%-75%的区间范围(IQR),晶须在最大1.5x IQR范围内从铰链延伸到最远的数据点。源数据在源数据文件中提供。

类似于传统的散装分子分类4,精致BRAF-样肿瘤在转录输出方面也有很强的异质性,而甲状腺激素代谢相关通路的激活主要保存在精制的肿瘤中。RAS-类似肿瘤(如图所示)。5A;补充图。8A)。这些发现促使我们剖析了BRAF-像人口。此外,非监督聚类对精聚类进行了分类。BRAF-将PTCS分为两个不同的分组(BRAF-就像-A和BRAF-类似-B),其中BRAF-样-B亚型不仅与TCV的病理有关(P=1.7e-8),较低的TDS分数(P=2.2e-16)和高级阶段(P=0.0008)(图1。5B;补充图。8B,c),但同时也预测到DFS(P=0.0059)(图1。5C).

关于基因表达的签名,BRAF-相似-B亚型具有较高的免疫相关信号活性,包括但不限于pd-1、γ干扰素(IFN-γ)、主要组织相容性复合体(Mhc)-Ⅱ抗原提呈通路(图1)。5D;补充图。8D)。这些发现表明免疫治疗对这一亚群体有着很好的治疗潜力。在scrna-seq队列中,案例10是典型的BRAF-样-B亚型,表现为晚期原发肿瘤,免疫浸润明显,阳性表达。BRAFV600E-突变蛋白和程序性死亡配体1(PD-L1)蛋白。5E),以及更多的进一步研究BRAF-类-B样品需要进一步核实。此外,在案例10中,退化样细胞的主要比例(补充图)。6B)提出大量分子亚型可能在很大程度上取决于恶性甲状腺细胞表型的多样性。

胸腺细胞表型组成形成精细化体分类

为了检验上述假设,我们采用BisqueRNA方法,通过整体剖面的反褶积来量化相关细胞类型的比例。24。有趣的是,精化的散装子类型(RAS-就像,BRAF就像-ABRAF-样-B)与三种甲状腺细胞表型(滤泡样、p-EMT样、Dediff样)的丰度相一致.具体来说,(1)滤泡样甲状腺细胞是甲状腺的主要表型。RAS-类似肿瘤(如图所示)。5F),这与FV-PTCs在该大体积亚型中的富集是一致的。(2)BRAF-样-A型肿瘤主要由p-EMT样甲状腺细胞组成。5G),与其相对较高的LN转移率(41.4%,补充数据)一致5)。同时,肿瘤恶性程度的异质性也可能受瘤样细胞比例的影响,以病例8(17.5%,T4aN1bM0)和例9(7.3%,T1bN1aM0)为例。8E,f)。(3)相比之下,BRAF-样-B型肿瘤显示出明显的退变样甲状腺细胞优势(如图所示).5H),有可能解释这种RAIR易感亚型的更坏的预后,例如病例4和病例11在我们的队列中(图1)。4F;补充图。1A, 6C)。总之,甲状腺细胞表型组成是形成我们精细化体分类的一个重要因素,并有助于它们的临床病理和预后多样性。

癌相关成纤维细胞亚型及其对PTC生态系统的贡献

接下来,我们将注意力转向ptc中的基质细胞,其中癌相关成纤维细胞(Cafs)是tme中具有多种功能的关键成分。25。在scrna-seq数据集中,我们发现所有成纤维细胞,无论组织类型如何,都表达典型的caf生物标志物,包括维姆, S100A4, ACTA 2(α-sma)PDGRFA,并自信地定义为CAFs(补充图)。9a,b)。在无监督的t-SNE聚类中,CAFs被划分为四个不同的簇,根据相应转录组特征的相互排斥关系,表现出肌纤维母细胞或炎症表型(补充图)。9C-e)。归纳起来,星系团0,1和3在补充图中。9A由于α-平滑肌肌动蛋白(α)等典型的肌纤维母细胞标记物的上调,被鉴定为肌纤维母细胞cff(Myocaff),又称α平滑肌肌动蛋白(αsma)。ACTA 2)和收缩蛋白(TAGln, 梅尔克, MYL 9)(图1.6a,b;补充图。9E)。另一方面,附图中的簇2。9A表示优先表达ICAF特征的炎症亚型(ICAF),如CFD, 柏拉图2g2a, CCDC 80(无花果)6a,b;补充图。9E)。值得注意的是,尽管某些共同的上调免疫调节分子,大量的细胞因子的表达(如IL6, IL8),这是胰腺癌和乳腺癌中iCAFs的一个特征。26,27在PTCs的对应物中没有观察到,这表明ICAF相关的调节机制在不同类型的癌症中具有异质性。

图6:癌相关成纤维细胞的亚型及其对PTC生态系统的贡献。
figure6

a肌CAFs与iCAFs区别的T-SNE投影。bPTC肌钙蛋白和肌钙蛋白关键标记基因的T-SNE图谱。反褶积分析表明c)肌钙纤维和(d)三大类PTC分类中的iCAF(RAS-像(n=161),BRAF-就像-A(n=253),BRAF-类似-B(n=199)。中线显示中间线(中心线),下铰链和上铰链显示25%-75%的四分位数范围(IQR),晶须在最大1.5x IQR范围内从铰链延伸到最远的数据点。气泡图显示细胞因子、趋化因子和生长因子之间的配体-受体对。e)iCAF或(f)与其他细胞类型的肌钙蛋白,由CellPhoneDB推断。源数据在源数据文件中提供。

随后,我们对整合的块状剖面(TCGA和PRJEB11591)进行解构,分析了精化体亚型肌钙蛋白和肌钙蛋白的丰度。与以前的报告一致28,29BRAF-样亚型显示CAFs的比例明显高于RAS-类似的亚型,特别是BRAF-样-B型肿瘤,预测包含CAF峰值水平,而不考虑肌CAF或ICAF表型(图1)。6C,d)。为了验证这一发现,我们回顾了一个典型的案例10的H&E染色的幻灯片。BRAF-在我们的scRNA-seq队列中类似-B-ptc。在原发肿瘤的几个领域中,我们观察到明显的致密增生(补充图)。9F),从侧面证实了CAFs在TME中的广泛存在。

为了进一步阐明caf表型的潜在功能,我们使用了CellPhoneDB。30根据配体受体(L-R)对的相对丰度,推断iCAFs或肌钙蛋白与其他细胞类型之间的细胞-细胞通讯。尽管细胞因子表达不足,但趋化因子介导的信号仍能维持iCAFs的免疫调节能力,这意味着它们在TME中的重要作用是招募和交叉不同的免疫细胞(图1)。6E)。例如,人们预测iCAFs将与CD8显著交互作用。+T,NK和肿瘤细胞通过CCL5-ACKR 4复合物。6E细胞免疫调节是PTC中iCAFs的重要功能之一。同时,iCAFs还可能通过CCL3L3-DPP4相互作用参与天然免疫过程,iCAFs与髓系细胞之间有一定程度的相互作用(图1)。6E)。相比之下,由于缺乏明显丰富的L-R对,肌钙蛋白在PTC的TME中似乎缺乏明显的细胞间串扰(见图)。6f),表明肌钙蛋白往往对肿瘤的进展产生机械和化学的影响,而不是像其他实体肿瘤所描述的那样,通过直接的细胞通讯来影响肿瘤的进展。31,32,33.

Ptc生态系统中的血管免疫串扰提高了抗血管生成联合免疫治疗的治疗潜力。

为了进一步了解肿瘤间质,我们接下来探讨了另一个重要的基质元件-内皮细胞(ECs)的转录程序。肺癌ECs研究中功能相关基因的整合34我们将这些ECs分为动脉型、静脉型、淋巴型、幼稚型和尖端型。7A)。顾名思义,动脉ECs表达与动脉发育和重塑相关的高水平基因(FBLN 5, GJA 5, 日航1)和平滑肌收缩(PPP1R14A)(图1.7b),而静脉亚型则显示VWF(血管性血友病因子)和与白细胞募集相关的基因(ACKR 1)或附着力(塞莱)(图1.7C)。淋巴管ECs作为标准标记物被富集。LYVE 1和趋化因子配体CCL 21(无花果)7D未成熟的ECs具有较高的Notch信号和靶基因表达水平。日航1, HES 1, Id1, ID2, ID3),以及与屏障完整性相关的基因(英格, PLVAP, HSPG 2, APLNR),它可能类似于茎样细胞(如图所示)。7E).

图7:PTCs内皮细胞的特征。
figure7

aT-SNE投影显示五种不同的ECs亚型。动脉标记基因的表达水平b)、静脉(c)、淋巴(d),不成熟(e)和TIP ECs(f). g热图显示TF在五个EC亚型中的活动,由风景区和AUCell评分。hSANKEY图显示正常EC(NEC)和肿瘤EC(TEC)对动脉、静脉、淋巴、未成熟和尖端亚型的分配。i泡图显示细胞因子、趋化因子和生长因子在尖端ECs与其他细胞类型之间的L-R配对,由CellPhoneDB推断。源数据在源数据文件中提供。

值得注意的是,作为新生血管生成的关键表型,TIP ECs表达了与细胞迁移有关的基因的特征。Nrp 1, ENPP 2)、附着力(THY 1)和船只形成(Flt 1,也称为VEGFR 1; KDR,也称为VEGFR 2; Nrp 1,也称为VEGF165R)(图1.7F),促进它们在船舶出芽过程中的导航作用。与这些特征相一致的是,风景分析发现了尖端细胞中的几个上调的TF调节因子,据报道这些调节因子与内皮细胞的迁移和发芽有关,例如ZEB 1, HOXB 5统计家庭(STAT 1, STAT 2)35,36,37(无花果)7g),进一步证实了PTCs中尖端表型的促血管生成特性。此外,在细胞来源方面,几乎所有的尖端、动脉和未成熟的ECs都位于原发或转移性肿瘤标本中,而只有淋巴管ECs在正常甲状腺组织中富集(图1)。7H)。这些观察表明,血管发生是PTCs的重要标志,提示EC表型可能是抗血管生成治疗(AAT),特别是抗血管内皮生长因子受体(VEGFR)抗体的一个很有前途的靶点。

为了分析PTCs中TIP细胞的复杂活性,我们随后利用CellPhoneDB研究了这种表型的分子通讯网络。在此分析中,我们观察到ECs与免疫细胞之间广泛的相互作用。例如,我们发现淋巴管通过不典型的趋化因子受体2与免疫细胞相互作用。ACKR 2),已被报道用于调节趋化因子的有效性(补充图1)。10)38。同时,我们发现静脉、未成熟和动脉ECs通过细胞间粘附分子1与免疫细胞相互作用。ICAM 1)在其表面,而ICAM 1TIP细胞和淋巴管ECs的表达明显降低(附图)。11)。特别是,我们发现TIP ECs和免疫细胞之间的交叉主要是通过关键的血管生成VEGF-VEGFR信号来实现的(如图所示)。7I;补充图。12)。综上所述,这些结果支持了在多细胞肿瘤生态系统中存在广泛的血管免疫串扰。39。因此,这些观察提高了AAT单独或联合ICB治疗甲状腺癌的潜力。

讨论

癌症不是一种静止的疾病,但随着单细胞测序技术的成熟和广泛应用,研究癌细胞及其周围基质细胞的进化模式成为可能。40,41。然而,到目前为止,对甲状腺癌的相关研究尚不多见。本研究对临床病程不同的PTC患者的癌旁肿瘤、局限性/晚期肿瘤、初治/复发LNS和RAIR远处转移进行了scRNA-seq分析。总的来说,我们的单细胞数据大大提高了我们对ptc异质性的理解,并为预后分层和量身定做治疗增加了维度(图一)。8).

图8:本研究的示意图。
figure8

潜在预后和治疗意义的PTC生态系统的原理图剖析。

在以前对许多其他癌症的scRNA-seq研究中22,42,43,44,45对于恶性和正常细胞的识别主要依赖于对单个细胞的大规模拷贝数变异(Cnv)分析,前提是癌细胞在这些恶性肿瘤中普遍存在染色体变化。尽管如此,体细胞CNV的频率较低(27.2%)4排除了CNV分类在甲状腺癌中的应用。为了应对这一挑战,我们建立了一套结合组织来源、转录组相关性、TDS相关转录组特征和机器学习分类器的综合方法,以区分具有高分辨力的PTCs中的恶性甲状腺细胞和非恶性甲状腺细胞。这样,我们的研究为今后的scRNA-seq研究提供了一种确定甲状腺恶性细胞的参考手段。

本研究的主要发现之一是甲状腺癌前细胞的鉴定。越来越多的证据集中于乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肝癌癌旁正常组织(NAT)的异常转录谱。46,47,48,49。特别是,最近的泛癌分析也证实了NAT在不同类型的非肿瘤健康组织和肿瘤样本之间的中间状态。50。在这项研究中,我们发现了两种不同类型的组织学上正常的甲状腺上皮细胞。主要类型可能代表真正正常的甲状腺细胞,而其他人群则代表形态正常但介于正常细胞和癌细胞之间的癌前细胞。最重要的是,我们证实了癌前细胞的致癌特性,这些细胞独立地产生与第一原发病变不同组织学的癌细胞(如图所示)。三维空间)。癌前甲状腺细胞的存在可以用“场癌变”理论来解释,即肿瘤的基因改变以逐步累积的方式积累,伴随着可能在癌症形成前没有形态变化的致癌细胞的出现。51。虽然甲状腺癌前细胞的普遍性还需要在未来的研究中进一步验证,但这些观察和假设至少在某种程度上提供了一种机制上的洞察,在很小一部分PTCs中肿瘤发生的多中心开始。

如前所述,我们的研究重点是收集广泛的组织来源,帮助我们勾勒出甲状腺上皮细胞随着癌症进展的综合进化路径。我们的研究以单细胞分辨率定义了甲状腺细胞的三种表型(滤泡样、p-emt样和dediff样),并进一步勾勒出了两条从滤泡样到p-emt样或dediff样甲状腺细胞的不同路径,其中轨道上的甲状腺细胞位置与我们队列中每个病例的肿瘤特征和RAI反应非常吻合。同时,Knuf等人。发现PTC可通过MAPK依赖的EMT过程进一步发展为低分化甲状腺癌(PDTC).这一重要发现与本研究中p-emt/dediff样甲状腺细胞的发育有一定的一致性,因为状态2/3甲状腺细胞的kras信号被激活,进而激活了MAPK信号通路。52。与其他癌症相一致53几乎我们队列中的所有肿瘤都是由不同的甲状腺细胞表型组成,而不是单一的具有一致特征的克隆,这表明癌细胞的动态进化是普遍存在的,并且是PTCs肿瘤内异质性的主要原因。

在大容量级别,tcga研究代表了这一领域的一个里程碑,将ptc分为BRAF-类似或RAS-类分子亚型4。在此基础上,我们利用甲状腺上皮谱系独特的进化相关基因,对TCGA亚型算法进行了轻微的修改。更重要的是,我们发现大量的分子亚型和不同甲状腺细胞表型的丰度之间有很强的联系,这意味着不同甲状腺细胞的组成也形成了PTCs的肿瘤间异质性。在这些批量分类中,BRAF-类似-B亚群体值得今后关注。这种亚型由于其几乎纯的Ddiff样细胞组成,容易发生侵袭性和RAIR的临床过程,从而导致预后更差。然而,丰富的炎症(干扰素-γ,MHC-Ⅱ等)免疫抑制(pd-1)信号可能给晚期患者带来希望。BRAF-类似-B型患者,他们有可能成为ICB的潜在候选人。以前的一些研究报告说,在pd-1抑制剂的使用期间,ptc的部分甚至完全消退。3,54,55表明至少有一部分患者将真正受益于ICB。

基质细胞的异质性在PTCs中几乎没有表现出来。尽管有大量的文献支持caff的促肿瘤作用,但它们现在被认为是一个异质的实体,在癌症中扮演着非常复杂的角色。56。在目前的研究中,这两种CAF表型的组成随着整体分类的恶性程度的增加而增加,这表明这两种表型,或者至少有相当一部分,可能是有利于肿瘤的。人们普遍认为,CAFs对化疗和酪氨酸激酶抑制剂等抗癌药物具有抗药性。33。然而,它们是否介导了PTC对RAI(尤其是肌钙纤维)或免疫治疗(特别是iCAFs)的耐药性,还不清楚,需要通过更多的重点研究来阐明。

在ECs的相关发现中,尖端表型可能是值得关注的焦点。抗VEGFR治疗由于其在血管生成中的重要作用和血管内皮生长因子的优先上调,在一定程度上指的是抗顶尖细胞治疗。57。例如,被批准治疗RAIR分化型甲状腺癌的首个多激酶抑制剂(包括VEGFR)索拉非尼的疗效已被证明与肝癌中的尖端EC标记物CXCR 4密切相关。58。此外,本研究还推测TIP ECs与免疫成分(包括免疫细胞和iCAFs)有广泛的相互作用。根据我们在ptc中的发现,抑制VEGFR可以重建肿瘤的免疫微环境。59建立抗VEGFR联合ICB治疗晚期甲状腺癌的理论基础。60,61.

据估计,甲状腺癌发病率大幅上升的近50%是由甲状腺乳头状微癌(Ptmc)造成的。62,63,即最大PTC病灶直径为1cm或以下。然而,无论是单细胞或大体积转录组(如tcga),PTMC由于可用于测序的组织体积有限,特别是那些小于5mm的肿瘤,不可避免地会被低估,这将在一定程度上削弱我们的结论。在未来,随着微取样测序技术的进步,需要进一步的研究来更好地分析这个实体中发病率迅速增长的肿瘤生态系统。

我们承认我们的研究有几个局限性。首先,我们研究的样本数量和细胞数量有限,需要进一步扩大研究范围,以更好地阐明PTC的肿瘤进展和多样性。特别是,在我们的研究中发现的癌前细胞主要由一名患者决定,这种状态的甲状腺细胞应在进一步的研究中得到证实。第二,目前的scRNA-seq必须在采样后的短时间内进行,因为这项技术需要有活细胞的新鲜样品。在完全纠正批处理效应的同时,充分保留肿瘤间异质性所引起的真正生物学特性,仍然是一个挑战。虽然我们采用了MNN算法对批处理效果进行校正,但在我们的研究中仍可能存在批处理效应。第三,本研究仅考察了大样本的突变状态,缺乏对不同甲状腺细胞簇的遗传注释。未来的研究结合多模式单细胞测序数据,可以同时勾勒出不同细胞簇的DNA突变谱、表观遗传修饰和单细胞分辨转录组。最后,本研究利用一系列生物信息工具对PTC的TME进行了研究,但缺乏对这些发现的功能验证,如不同类型甲状腺细胞对碘的吸收和保留,以及TDS相关基因在PTC肿瘤发生中的作用等。在进一步的体内和体外实验,以验证这些发现在未来。

总之,我们的研究阐明了PTC生态系统的一个全面的景观,它暗示了潜在的预后和治疗意义。我们的工作不仅为PTC异质性的生物学基础增加了维度,而且还为这种恶性肿瘤提供了基准数据集。我们预计,我们的数据将作为一个宝贵的资源,促进未来的研究,以进一步开发生物标志物或治疗目标的PTC患者。


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