TET 2突变与正常和恶性造血中关键调控增强子的甲基化有关

表观遗传修饰体的突变TET 2常见于髓系恶性肿瘤和克隆造血的不确定电位(CHIP)和克隆性细胞减少(CCUS)。在这里，我们研究TET 2305例老年双胞胎、15例CCUS患者和18例健康对照者全血DNA甲基化和突变。我们发现TET 2突变与芯片中全血增强子位点以及CCUS中粒细胞和单个核细胞的DNA甲基化有关。这些高甲基化位点与白细胞功能、免疫应答、ETS相关和C/EBP相关转录因子相关。而大多数TET 2-相关的甲基化位点是在芯片和AML之间共享的，我们在造血干细胞中发现了一组AML特异性的高甲基化位点。总之，我们表明TET 2基因突变与芯片、CCUS和AML患者髓系分化相关的甲基化增强剂有关。

在骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)和淋巴瘤等血液病中，编码DNA甲基化调控因子的基因突变频繁。1,2,3,4。两个对DNA甲基化有相反影响的重复突变基因是10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET 2)和DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)，两者在髓系肿瘤和相关条件下都特别频繁地发生突变，克隆造血的不确定电位(CHIP)和克隆性细胞减少(CCUS)具有不确定的意义。芯片的特点是在其他血液学健康的个体中，携带已知髓系癌相关基因驱动突变的血细胞克隆繁殖，并与患血液病和心血管疾病的风险增加有关。5,6。后者被怀疑是由细胞(特别是单核细胞和巨噬细胞)的高炎症表型和芯片突变引起的，这些细胞具有较高的促炎细胞因子，如白细胞介素(IL)-1β和IL-6。7,8。此外，根据定义，芯片突变会增加自我更新的能力，以及TET 2已发现突变可使造血祖细胞向粒细胞分化方向倾斜。9。CCUS的特点是与芯片相同的突变，以及细胞减少和缺乏异常的骨髓特征，并与高风险发展为公开的髓系恶性肿瘤。芯片和CCUS突变导致细胞和临床水平表型改变的机制尚不清楚。TET 2和DNMT3A在调控DNA甲基化方面具有不同的功能，TET 2催化5-甲基胞嘧啶向5-羟甲基胞嘧啶的转化，这是dna脱甲基的第一步。10，DNMT3A催化胞嘧啶残基重新甲基化11。改变表型的一个可能的解释是在TET 2和DNMT3A给DNA甲基化体带来特定的改变，这反过来又导致对特定基因或基因集的调控改变。然而，当特定的DNA甲基化改变TET 2和DNMT3A在人类癌症、细胞株和小鼠基因失活模型中，突变已经被描述。4,9,12,13,14,15，这些基因的体细胞突变还没有在血液学健康的人类体内被研究过。

在这里，我们展示了TET 2突变与从普通人群中取样的一组老年双胞胎的全血DNA甲基化模式有关。这种甲基化模式也可在患者的粒细胞和单个核细胞中检测到。TET 2-变异的CCUS。与芯片和CCUS相比，AML中存在相同的甲基化模式，但同时也会发生额外的变化，表明TET 2可能参与调控AML中附加的甲基化位点。

我们分析了丹麦双子登记处305人的DNA甲基化数据，其中116人有一个或多个芯片突变，其中55个有一个或多个芯片突变。DNMT3A突变44例TET 2突变(附图)1–3和补充表1)。用Illumina 450 k阵列对甲基化谱进行了表征，427,112个CpG位点通过质量控制。没有一个人TET 2或DNMT3A在丹麦国家病人登记处，突变被诊断为髓系疾病。在没有芯片的VS个体之间，以及在没有芯片的个体之间，全球平均β甲基化水平没有差异。TET 2或DNMT3A基因突变与无芯片个体的比较(附图)。4)。我们分析了从dna甲基化水平推断的血细胞类型比例的差异，发现TET 2突变与更高比例的单核细胞(P，但在其他情况下，细胞比例在有无细胞比例的个体之间没有显着性差异。TET 2或DNMT3A突变(附图)5)。观察到的更高的单核细胞计数TET 2突变与小鼠实验数据一致。16以及人类的观测数据17.

TET 2突变与芯片中广泛存在的CpG甲基化有关

接下来我们研究了DNMT3A以表观基因组的方式进行突变和甲基化水平的比较DNMT3A对189名没有任何芯片突变的个体进行突变，同时调整年龄、性别、批处理效应、四个主成分以及从甲基化特征推断出的血细胞比例，并观察到P值(基因组膨胀系数，λ=1.12，图1。1A和补充数据1)。在对44人进行类似的分析时TET 2突变，我们发现基因组膨胀要大得多，表明TET 2突变可能影响大量位点的甲基化水平(λ=1.29，图1。1B和补充数据2)。火山的结果TET 2-具体分析表明CpG位点低P值几乎完全与TET 2突变状态(图1.1C)。我们将超甲基化位点定义为与TET 295%的CpG位点高度甲基化的显着性阈值突变(图1)。1D)。在…P < 1.4 × 10−5在2885个位点中，有2741个位点发生了甲基化，我们选择了这2741个位点进行进一步的研究。我们测试了2741个位点的甲基化水平是否与TET 2VAF发现其中2694个(98.3%)是这样(P < 1 × 10−16，补充图。6)。由于芯片和dna甲基化都被证明与吸烟有关，我们对累积烟草暴露和当前吸烟情况进行了敏感性分析，并观察到结果没有任何有意义的变化(所有2741个甲基化位点都与吸烟呈正相关。TET 2在这两项分析中，95%的突变仍然低于显着性阈值，并且是观察到的最高值。P校正后值为4.3×10−5、补充方法1和补充图。7)。曼哈顿的一幅图显示，2741个位点并不局限于一个或几个特定的位点，而是分布在整个基因组中(如图所示)。1E)。这个DNMT3A-具体分析发现160个CpG位点DNMT3A突变载体(附图)8和9)。再一次，我们没有发现吸烟的证据(补充图)。10)。总之，这些结果证明了芯片突变的存在TET 2与大量基因组位点CpG甲基化水平升高有关，而DNMT3A突变只会导致相对较少的位点发生可检测的变化。这种高甲基化表型最有可能与TET 2突变而不是由于细胞类型组成的变化，因为这是调整在模型中。

aQQ策划P差异甲基化分析中的值分布DNMT3A突变状态(55)DNMT3A-变异基因，而无芯片者189人)。b和A一样，但是比较44TET 2-无芯片突变个体至189人。c火山结果图TET 2-具体分析。水平虚线P=1.4×10−5。角落中的数字表示每个象限中用虚线分隔的CpG站点的数目。红点和蓝点分别代表高和低甲基化CpG位点，低于显着性阈值.d选择P在C.红线中使用的值截止值显示超甲基化位点的比例随着减少而增加P价值截止。水平虚线表示95%的站点是过甲基化的。垂直虚线表示选定P1.4×10−5. e曼哈顿地块显示2741个CpG站点TET 2突变相关的高甲基化以红色突出显示。P所有面板中的值和效应大小估计都是以双对为随机截距的线性混合效应回归。全P值是双面的，不能对多个比较进行调整.

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高甲基化位点的基因本体富集和染色质状态分析

基因本体富集分析表明，2741个高甲基化位点位于或接近参与多个生物学过程的基因，所有这些都与免疫反应和(尤其是髓系)白细胞功能有关。2A)。使用DNMT3A-具体分析。接下来，我们利用Roadmap表观基因组学的ChromHMM数据，将我们的发现与单核细胞的染色质状态进行了比较。18结果发现，在2741个高甲基化位点中，近三分之一(31%)位于活性增强区，而只有7%的非甲基化位点(P < 10−16, χ2测试图。2B)。同样，被标注为基因增强子的区域和活性转录区域在2741个CpG位点中高度富集，而其他区域如抑制的多梳状体和静止的染色质的表达量较低。此外，虽然32%的非甲基化CpG位点位于CpG岛，但在2741个超甲基化位点中，只有8%是这样的(P < 10−16, χ2相反，在低CpG密度的基因组区域(如图所示)，这些基因的表达量过高。2C)。这些观察结果与以前报道的TET 2在增强子(如髓系小鼠细胞)上的结合是一致的。19。此外，TET 2突变似乎不会影响癌症中CpG岛的甲基化状态。12，可能是由于TET 1和H3K4me3机制严格控制CpG岛甲基化所致。20.

a2741个超甲基化位点基因本体术语的丰富。P使用基于区域的二项分布测试导出的值在很大程度上没有经过多次比较的调整。b单核细胞染色质在高甲基化和非过甲基化位点的状态。c甲基化和非甲基化位点的CPG岛关系。

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总之，我们发现TET 2相关的CpG过甲基化在有芯片的个体的癌前状态已经被发现，并且这些CpG位点主要发生在增强子区域。

复制TET 2CCUS患者突变相关DNA甲基化特征的研究

调查是否TET 2突变对CCUS中DNA甲基化的影响相似，我们对5例CCUS患者外周血粒细胞进行了DNA甲基化分析。TET 2-变异克隆(VAF：33%、45%、47%、50%和50%)和8名健康对照(补充表)2)，这一次使用较大的Illumina 850 k史诗阵列，它对增强子区域和非CpG岛有更好的覆盖范围。使用我们的定义TET 2突变相关的CpG高甲基化位点，我们发现12,096个CpG位点是明显的过甲基化(图1)。3A和补充数据3)。在2741个在芯片中过甲基化的cpG位点中，2460个在质量控制后可在ccus数据中进行评估，其中2427个(99%)与TET 2CCUS突变(P < 10−16, χ2测试)。同样，CCUS中93%的高度甲基化位点与TET 2芯片突变(P < 10−16, χ2测试图。3B)。对12,096个高甲基化位点进行基因本体富集分析，发现许多与髓系白细胞功能相关的生物过程作为芯片分析(图一)。3C)。此外，低CpG密度的促进剂和区域的比例与芯片上的分析结果非常相似(图1)。3D，e).

a火山图CCUS结果。红色点表示芯片中2741个高甲基化位点的CpG位点(如图所示)。1C)。边距显示2741个站点的分布与EPIC数组的其余部分。角上的数字表示每个象限中用虚线分隔的点(两种颜色)的数目。P在Limma中使用线性模型导出的值和影响大小估计。P值是双面的，不能对多个比较进行调整.b芯片结果火山图(与1C相同)，黄色点表示CCUS颗粒细胞(面板右上象限)中12,096个明显过甲基化位点的CpG位点。a)。只显示芯片和CCUS中分析的位置。P在Limma中使用线性模型导出的值和影响大小估计。P值是双面的，不能对多个比较进行调整.cCCUS中12,096个超甲基化位点基因本体术语的丰富P使用基于区域的二项分布测试得出的值在很大程度上是不经调整的，不适用于多个比较。d单核细胞染色质状态为高甲基化和非甲基化位点。e甲基化和非甲基化位点的CPG岛关系。

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为了研究观察到的甲基化是否存在于粒细胞以外的其他系中，我们分析了20例CCUS患者的T细胞缺失、骨髓来源的单个核细胞(Mnc)的dna，其中10例有a。TET 2变异(中位数VAF：40%[四分位数范围38-41%]，补充表3)。在芯片中高度甲基化的位点中，99.6%的位点与TET 2CCUS多核细胞突变(P < 10−16, χ2测试，补充图。11A和补充数据4)。相应地，96.3%的CCUS粒细胞高度甲基化位点与TET 2CCUS多核细胞突变(P < 10−16, χ2测试，补充图。11B)。基因本体富集分析、染色质状态分析和CpG岛关系分析结果与粒细胞DNA分析结果相似。11C-E).

转录起始点甲基化在癌症中起着重要的调控作用。21。为此，我们确定了芯片和CCUS中TSS位点的甲基化区域。两个芯片和两个CCUS数据集之间只有一个超甲基化的TSS位点重叠(补充方法)。2)，并且本网站没有已知或怀疑在癌症中的作用(补充表)。4).

总之，我们发现TET 2芯片和CCUS中与突变相关的CpG高甲基化。在全血、外周血粒细胞和骨髓来源的多核细胞中都能清楚地检测到甲基化现象.同时观察到CCUS粒细胞样本中变异的克隆在每5例患者中至少占血细胞的90%，这些结果进一步支持了我们的结论：TET 2突变与观察到的恶性前状态的甲基化有关。

TET 2-相关的超甲基化与特定转录因子基序共定位

由于已知tet 2的活性发生在不同细胞背景下不同转录因子结合位点附近，我们接下来对增强子区域进行了基序富集分析。TET 2芯片和CCUS中突变相关的高甲基化。我们定义了位于单核细胞增强子中每个CpG位点中心的200个bp区域，并分别根据芯片和粒细胞数据中的过甲基化程度对它们进行了排序。在分析的678种独特转录因子中，46种在芯片中显著富集，75种在CCUS(补充数据)中富集。5)。其中，28枚同时在芯片和CCUS中富集(P < 1 × 10−16, χ2测试)。最值得注意的是，ETS转录因子家族的大量成员，包括elF 2、ETS 1和主造血调节因子SPI 1，在芯片和CCUS中都有很强的富集(图1)。4)。在25个ETS转录因子基序中，21个(84%)在芯片(P < 1 × 10−16，Fisher‘s确切试验)和23(92%)富集在CCUS(Fisher’s确切试验)中P < 1 × 10−16)。此外，十分之七(70%)C/EBP相关转录因子在芯片中富集(Fisher‘s精确检验)。P=0.03和9/10(90%)在CCUS中富集(Fisher‘s精确检验)P=1×10−8).

超甲基化区域被定义为位于增强子区域的CpG位点周围200 bp的侧翼区域。浓缩(E)值，由菲舍尔精确测试法导出，用于分析母模富集。E值调整P由HOCOMOCO v11完整数据集测试的转录因子结合基序数目的校正值(N=769)。

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总之，我们发现ETS和C/EBP转录因子结合基序在或附近都有很强的富集。TET 2突变相关的CpG甲基化在芯片和CCUS中均存在，提示TET 2的活性与关键转录因子的合成直接相关，对细胞的识别和造血分化有指导作用。

TET 2AML突变与造血干细胞特异性增强剂甲基化水平升高有关。

调查是否TET 2突变相关的甲基化在AML和芯片与ccus之间是一致的，我们分析了90例AML患者的可用序列和450 k甲基化阵列分析数据，这些数据来自于癌症基因组图谱(Tcga)LAML队列，其中4人有TET 2突变。在…P < 0.01, 2000 sites were hypermethylated, constituting 72% of all sites below this significance cutoff (P=8.2×10−12, χ2测试)。

在芯片中发生过甲基化的2741个位点中，有2310个位于tcga数据集中，其中1895个(82%)与TET 2突变(P < 1 × 10−16, χ2测试图。5A)。同样，78%在CCUS粒细胞中过度甲基化的位点也在AML中发生过甲基化(P < 1 × 10−16, χ2测试图。5B)。在急性髓细胞白血病2000例高甲基化位点中，只有54%与TET 2芯片突变(P=0.81，χ2测试，补充图。12)。与此形成对照的是，在AML中的2000多甲基化位点中，72%的位点也与AML呈正相关。TET 2CCUS粒细胞突变(P < 1 × 10−16, χ2测试图。5C)。这些结果表明，虽然芯片中观察到的甲基化在AML中也能检测到，但在AML中也有许多额外的位点被过甲基化，而这些位点在芯片中也没有过甲基化。在反洗钱中被过甲基化的站点在CCUS中也更有可能被过甲基化，这表明尽管TET 2芯片和CCUS中的相关甲基化是高度相似的，CCUS也显示出与AML中观察到的更相似的额外的甲基化特征。

a4例和86例AML患者表观基因组相关研究结果TET 2分别突变。红色点表示芯片中2741个高度甲基化位点的CpG位点(图1)。1C)。水平虚线P=0.01。边距显示2741个站点的分布与其他站点的分布情况。角上的数字表示每个象限中用虚线分隔的点(两种颜色)的数目。P在Limma中使用线性模型导出的值和影响大小估计。P值是双面的，不能对多个比较进行调整.b类似于a。橙色点表示CCUS粒细胞中12,096个明显过甲基化位点的CpG位点。只显示这两个集合之间的重叠点。P在Limma中使用线性模型导出的值和影响大小估计。P值是双面的，不能对多个比较进行调整.c火山图的CCUS粒细胞的结果(与图中相同)。3A)但随着2000年在AML中的高度甲基化位点的突出(紫色点)。P在Limma中使用线性模型导出的值和影响大小估计。P值是双面的，不能对多个比较进行调整.d造血干细胞(HSC)特异性AML中甲基化和非甲基化位点的比例(N=14,398)和单核细胞特异性促进剂(N=14 017)。e平均标度效应大小估计TET 2所有位于HSC-特异性CpG位点的突变(N=47,748)和单核细胞特异性促进剂(N=37 518)。误差栏表示95%的置信区间。见附图。13用于数据分发图。

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基因本体富集分析的2000多甲基化位点没有发现任何显着丰富的生物过程。此外，位于单核细胞增强子中的CpG位点在2 000个高甲基化位点中仅略有富集(9%vs 7%的非甲基化位点)，P=7×10−5, χ2测试图。5D)。由于单核细胞中的染色质状态可能不是AML细胞的一个很好的替代物，我们还计算了CD 34的路线图表基因组ChromHMM注释中位于增强子中的AML中高甲基化位点的比例。+造血干细胞(HSCs)，并发现增强子区有较高程度的富集(15%在HSCs中，8%在单核细胞中，P < 1 × 10−16, χ2测试)。然后我们比较了平均TET 2芯片、ccus和AML的突变相关甲基化差异在注释为单核细胞增强子的区域(单核细胞特异性增强子)和被注释为hsc增强子的区域(hsc特异性增强剂)的位点之间存在差异，并且发现只有单核细胞特异性增强子在芯片和ccus中被过度甲基化(这两个位点都是hsc增强子而不是单核细胞增强子)。P < 1 × 10−16、学生的t测试图。5E和补充图。13Hsc特异性增强剂在AML中的甲基化程度明显高于单核细胞特异性增强剂(P=5.7×10−10、学生的t测试)。基元富集分析TET 2高甲基化的HSC增强子区显示238种转录因子的过量表达。在芯片和CCUS中，ETS转录因子的表达量过高(84%的基序显著丰富，P=5.6×10−7, χ2测试)，但不包括C/EBP因素(P=0.18)。总之，这些结果表明TET 2AML的突变与芯片和CCUS中的许多甲基化变化有关，它们也与大量其他位点的甲基化有关，特别是在HSCs中与活性增强子有关的位点，而在成熟的单核细胞中则不然。同样，对于DNMT3A突变，芯片上观察到的少数甲基化变化在AML中也可能存在，但同时在芯片中没有检测到更多的变化。

DNMT3A突变与AML中广泛的低甲基化有关TET 2超甲基化

我们观察到DNMT3ATCGA AML组突变和CpG低甲基化，19,235个低甲基位点在P < 0.018 (Supplementary Fig. 14)。160个CpG位点DNMT3A-突变芯片DNMT3A在这两个数据集中的133个CpG位点中，有125个[94%]的AML突变状态，P=4.1×10−13, χ2测试)。AML中19,235个低甲基化位点也在增强子区富集(20%，而其余7%)，P < 1 × 10−16, χ2测试，补充图。15)。我们问是否和在多大程度上DNMT3A和TET 2影响同一CpG位点的甲基化状态。在芯片中，与DNMT3A在2741人中，突变率较低。TET 2-相关的甲基化CpG位点(48%，而其他位点为54%)，P=6×10−10, χ2测试补充图16)，但在反洗钱方面，2000年TET 2-相关的高甲基化位点在DNMT3A突变肿瘤中被富集以进行低甲基化(P < 1 × 10−16, χ2测试)。两种疾病均无AML患者。TET 2和DNMT3A突变意味着相互排斥。最后，DNMT3AAML的突变与强烈的低甲基化状态有关，包括少数几个低甲基化位点。DNMT3A-变异芯片AML，而不是芯片，显示了CpG位点之间的关联，这些位点在TET 2突变样本DNMT3A-变异样本。

预测TET 2芯片和CCUS的突变

我们的发现表明TET 2已处于恶性前状态的基因调控功能相关位点的突变状态和CpG高甲基化。接下来，我们询问甲基化状态在多大程度上可以预测TET 2突变状态。为此，我们开发了一个基于dna甲基化的预测模型。TET 2突变状态。这样的模型原则上可以用于识别载货人。TET 2只使用DNA甲基化信息的突变。我们首先使用一个弹性网络逻辑回归模型的左一出交叉验证来预测44。TET 2芯片队列中的突变。虽然这种方法准确地预测了44人中的11人TET 2变异病例对应的敏感度为25%，全部261人无TET 2突变分类正确，特异性为100%(补充表)5和补充图。17)。在……里面TET 2突变载体、预测概率与克隆大小呈正相关(P=2.3×10−6)。接下来，我们使用基于芯片队列中所有个体的相同模型来预测。TET 2两个CCUS队列中的突变，并准确地分类了所有8名健康对照者和10名没有CCUS的CCUS患者。TET 2突变(特异性100%)和15例中的9例，敏感性为60%(补充表)6和补充图。18).

总之，我们的结果表明，基于甲基化的模型可以用于预测。TET 2变异状态，即使有一个适度的队列大小。

体细胞引起的DNA甲基化变化TET 2癌症和小鼠模型中的突变已经被研究过，但是这些突变是否以及在多大程度上导致芯片和CCUS中DNA甲基化的变化还没有得到解决。本研究表明：TET 2芯片和CCUS的突变与DNA甲基化有关，同时具有全局性和非随机性，即特定于增强子元件、非CpG岛区以及参与髓系白细胞功能和免疫应答的基因。这与以前对其他生物体和疾病的研究是一致的。研究TET 2-突变的AML小鼠模型发现丢失TET 2白血病前细胞的功能导致增强子特异性的甲基化。13。其他的研究也在小鼠胚胎干细胞上发现了类似的结果。22人慢性粒细胞白血病细胞12。另一项研究将染色质免疫沉淀和大规模平行测序(chip-seq)应用于AML 1-Eto永生化的小鼠髓系细胞，以研究tet 2结合区域，并随后对丰富的基因本体论术语进行了研究，发现了几个与本研究相同或相似的术语，包括“白细胞活化”和“免疫系统过程”。19。这项研究还发现，在tet 2结合位点上，许多相同的基元被富集，就像我们在TET 2突变携带者。此外，罕见的生殖系病例TET 2突变与增强子甲基化增加有关，特别是在RUNX 1和SPI 1结合位点上。23。总之，目前的研究结果与以前的研究结果是一致的。TET 2模型生物和人类癌症的突变，以及人的生殖细胞系TET 2单倍体功能不全。然而，由于tet 2功能具有高度的上下文依赖性，我们的研究提供了进一步的见解，既了解了天然tet 2在正常人类造血中的作用，也揭示了tet 2对人类造血的影响。TET 2芯片，CCUS和AML的突变。DNA甲基化特征TET 2非恶性人类细胞的突变特别令人感兴趣，因为它们提供了关于tet 2如何通过特定调节元件的去甲基化来促进维持正常造血的洞察力。10。TET 2被招募到基因组区域的确切机制尚不清楚，因为TET 2本身并不具有任何已知的DNA结合域。相反，这种蛋白质很可能是通过与一系列不同的dna结合蛋白(如转录因子)相互作用而被吸收到dna中的，而参与这一过程的不同因子依赖于特定的细胞环境。有趣的是，我们发现在甲基化增强子元件中过度表达的转录因子中，也有许多是在上述关于髓系小鼠细胞的芯片seq研究中发现的。19，包括包含spi 1的与ets相关的转录因子家族，spi 1是造血分化的关键调节因子，在单核细胞和巨噬细胞的发育中尤为重要。24。相反，含有AGATAA的转录因子(如GATA 1、GATA 3和EVI 1)的基序高度富集于TET 2在我们的数据中，未发现小鼠白血病细胞中的结合位点被富集，表明在这两个物种和/或细胞环境中，TET 2在这些因素的合成中起着不同的作用。

另一种解释TET 2Izzo等人最近提出了突变驱动的细胞表型和分化改变。9世卫组织建议，扭曲的细胞分化所赋予的TET 2和DNMT3A突变是转录因子基序CpG密度及其对每个基因功能丧失引起的随机DNA甲基化或去甲基化的敏感性的直接结果。这个假设中的一个假设是，dna甲基化的变化是DNMT3A和TET 2突变是全球性和随机性的，这似乎与目前的研究结果相矛盾。TET 2突变相关的超甲基化是非随机的，并且与cpG低密度区共定位，例如SPI 1的CpG弱结合基序。有趣的是，Izzo等人。特别表明，由单细胞atac-seq决定的spi 1基序可达性不受TET 2或DNMT3A突变。因此，虽然很可能是TET 2细胞表型突变是转录因子基序CpG含量差异的结果，另一个机制是TET 2突变依赖的高甲基化，特别是增强子区域，这是由关键的转录调节因子选择性和上下文依赖的TET 2的招募。

利用TCGA数据表明TET 2AML的突变与芯片和CCUS中的许多相同位点的高甲基化有关，但在芯片和CCUS中不受影响的大量AML特异性位点也是如此，特别是在HSCs的增强子区域，而不是单核细胞中。这表明芯片中所观察到的甲基化现象可能是向恶性转化过程中的早期启动事件。AML新位点的附加甲基化可能是由于白血病细胞特有的修饰物的存在而引起的类似干细胞的转录调控。

我们在芯片分析中使用全血DNA甲基化有其局限性。虽然芯片的结果是根据估计的细胞型成分进行调整的，但我们不能排除从反褶积算法未检测到的细胞比例的变化中产生无法测量的混淆的可能性。然而，芯片上观察到的结果在CCUS粒细胞和MNCs中都被复制，强烈地表明这些甲基化模式与细胞谱系无关。观察到的低甲基化CPGS数量少得令人吃惊DNMT3A-变异芯片也可能是由于我们使用未分类的外周血。芯片突变很可能会产生世系特异性的后果，为了更好地理解芯片突变对人类的影响，今后需要对干细胞和不同造血谱系中芯片相关甲基化的变化进行研究。

我们试图建立一个预测模型TET 2突变，因为这样的模型可能有广泛的应用在表观遗传学研究。首先，它允许立即对TET 2许多现有的DNA甲基化数据集的突变来自不同的队列，并使流行病学调查之间的联系TET 2突变和一系列表型不需要定向测序。第二，它将允许研究人员调整TET 2在表观基因组范围内的相关研究中，突变是DNA甲基化与其他表型(如心血管疾病和年龄)之间潜在的混淆。虽然我们无法有力地预测TET 2单从dna甲基化水平来看芯片中的突变状态，可能是由于小队列的大小，非突变个体的dna甲基化水平很大程度上预测了基因的缺失。TET 2突变，强调非突变VS中dna甲基化水平的巨大差异。TET 2-这些老年人从普通人群中抽样调查的血细胞发生突变。

最后，由于TET 2在我们的研究中观察到的突变相关的甲基化特征被发现与TET 2在芯片中，我们认为这些位点的甲基化水平可以用来研究表观遗传治疗对TET 2功能的影响。对小鼠的研究表明，抗坏血酸缺乏可抑制TET 2功能，并提示添加抗坏血酸可抑制小鼠的TET 2功能。TET 2-变异芯片或血液学疾病可帮助最大限度地发挥剩余功能TET 2等位基因25,26，但这还没有在人类身上得到证实。我们建议甲基化水平在TET 2突变相关的高甲基化位点可用于未来的研究，以研究抗坏血酸和其他表观基因治疗如催眠药对TET 2功能的影响。