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限制蛋白质合成抑制CBP与氮胞苷RNA依赖机制的协同作用

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发表时间:2021-10-22 10:02作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

核苷酸类似物氮胞苷(AZA)是目前治疗高危骨髓增生异常综合征(MDS)的最佳选择。然而,只有一半的接受治疗的患者有反应,其中几乎所有的患者最终都会复发。迫切需要新的治疗方案来改善这些患者的临床管理。在此,我们进行了功能缺失的shRNA筛选,并确定组蛋白乙酰转移酶和转录共激活因子CREB结合蛋白(CBP)是AZA敏感性的主要调节因子。抑制CBP活性的化合物和与其密切相关的p 300协同作用降低MDS来源的AML细胞与AZA联合作用后的存活率。重要的是,这种作用是特定的RNA依赖功能的AZA,而不是观察到与相关的化合物十技他滨,这是只纳入DNA。CBP/P 300的抑制作用是通过全局下调蛋白合成来实现的。

导言

骨髓增生异常综合征(MDSS)是一种以发育不良和造血无效为特征的克隆性造血干细胞疾病,影响一个或多个髓系细胞系。1。MDS是骨髓系疾病的一部分,它是由无症状的克隆性造血演变而来,具有不确定的潜能,并在30-40%的病例中转化为继发性急性髓细胞白血病(SAML)。2。环境或治疗相关因素加速MDS的发展3,4。MDS是老年人最常见的血液病之一。5而SAML的预后特别差。6。Mdss的基因改变描述得很好,包括表观遗传调控和rna处理相关基因的突变。7,8.

目前,偶氮核苷(Aza)和地西他滨具有多种临床应用,例如,对于不符合异基因移植资格的高危mds患者来说,它们是可供选择的标准治疗方案。9。然而,这种反应只是部分的:40-50%的接受治疗的患者表现出血液学上的改善,完全的反应仅限于10-15%。9,10。此外,AZA还用于支持治疗一部分AML病例。11。氮核苷常被称为低甲基化剂和表观遗传药物,因为它们干扰DNA甲基化。12。除减少全球DNA甲基化外,氮核苷类化合物是影响多种细胞功能的通用核苷酸类似物。细胞摄取后,氮核苷被代谢转化为活性形式,并与新合成的dna和rna结合。13。阿扎和十氯他滨的不同之处在于,十氯他滨被完全整合到dna中,而80-90%的aza则成为rna的一部分。14。DNA的掺入导致dna和dna甲基转移酶(Dnmts)之间形成共价加合物,特别是dnmt 1。15有两个后果。首先,这些加合物以共济失调-毛细血管扩张症(Atm)/共济失调(ataxia telangiectasia,atr)和Rad3相关蛋白(rad3-relatedprotein,atr)依赖的方式引起dna损伤反应,如果修复不当,就会引起细胞毒性。16。其次,交联dnmts的抑制会导致dna低甲基化,从而诱导一组促进细胞分化的基因的表达。17。此外,低甲基化诱导的内源性逆转录病毒转录模拟病毒感染并激活天然免疫反应。18.

将AZA掺入RNA具有附加作用。类似于对Dnmts的抑制,AZA抑制转移RNA(TRNAs)和其他RNA中使胞嘧啶第5位甲基化的RNA甲基转移酶的子集。19,20。对于DNMT 2,Aza的灵敏度得到了最好的说明。21。因此,AZA而非十硝他滨对蛋白质合成有抑制作用。22这至少部分是由tRNAs介导的。23。Aza对信使RNA(MRNA)稳定性也有影响。在这种情况下,AZA的处理导致核糖核酸还原酶的下调,因为它破坏了编码酶复合物基本成分的mRNA的稳定性。24。因此,AZA减少了DNA合成所需的核糖核苷酸向脱氧核糖核酸的转换,这包括它自己转化为十氮他滨。24。此外,AZA还破坏了包含hnRNPK、DNMT 2和NSUN 3的复合物与聚合酶2在活性转录基因上的依赖于RNA的相互作用。25。综上所述,AZA的这些附加的rna依赖功能提供了部分解释,解释了为什么aza和decitabine在很大程度上导致了mrna水平的不重叠变化。22,26.

CREB结合蛋白(Cbp)及其副标题p 300是一种高度保守的转录共激活因子,参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程。27,28。Cbp和p 300具有高度的同源性,它们的功能很大程度上是冗余的。29。其调节特性可归结为三大功能。首先,它们将序列特异性dna结合蛋白连接到基础转录机制上.第二,它们是大量转录因子的转录协同激活因子.最后,它们是具有赖氨酸乙酰转移酶活性的酶,乙酰化组蛋白和非组蛋白。在造血过程中,cbp和p 300通过与GATA 1等关键转录因子的相互作用,促进细胞的分化和干细胞的维持。30、MYB31和AML-132。在急性髓细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(MLL)中,MLL易位是常见的cbp易位,导致MLL功能的增加。33。同样,moz-cbp和moz-p 300易位也能促进AML的发生。34。此外,许多癌基因与cbp和p 300相互作用,使其成为恶性肿瘤转化的重要因素。27。CBP和p 300在血液癌症中的解除管制促进了抑制剂的发展。35其中之一,CCS 1477,已经进入临床发展,这是第一次在血液系统癌症中进行人体试验(NCT 04068597)。

在此,我们报告了染色质调节剂的基因功能缺失筛选的结果,从而确定CBP是以AZA为基础的体外治疗的组合药物靶点。我们分析了AZA与药物CBP/p 300抑制剂之间的协同作用,并将其与AZA的RNA依赖功能联系起来。此外,我们还证明了CBP/p 300抑制剂对蛋白质合成的干扰作用。

结果

改进的基因丧失功能筛选器可以识别影响细胞对AZA的固有反应的染色质调节因子。

需要提高以AZA为基础的治疗的反应率和持续时间,这促使我们寻找潜在的组合药物靶点。AsAZA是一种染色质修饰剂。11研究了抑制染色质调节剂对体外处理反应的影响。我们选择了一种RNA干扰介导的基因敲除方法,这种方法比在临床上使用药物所能达到的抑制水平更相似。作为一种细胞模型,我们选择了mds衍生sam l细胞株skk-1,该细胞系在我们的实验室中已经得到了很好的鉴定。36。SKK-1细胞已从MDS衍生的SAML和剪接因子港突变患者中分离出来。U2AF1和染色质调节剂BCOR37。为了以最全面的方式测试染色质调节因子,我们构建了一个针对912个人类染色质调控基因的慢病毒文库,每个基因有8个独立的短发夹RNA(ShRNAs)(补充数据)。1还有无花果。1A)。ShRNAs被嵌入到优化的微RNA主干中,使目标基因在单拷贝整合后被有效地敲除。38,39。为了确保shRNA的高效表达和防止转基因抑制,我们进一步优化了前面描述的慢病毒pRRL-sffv-gfp-mar-pgk-puro(Sgep)主干。38通过插入一个无处不在的染色质开口元件(UCOE,图1)。1B)。UCOE起源于CBX 3启动子和具有抗沉默特性。40。我们通过确认靶向必需基因的shRNAs的细胞毒性作用,测试了被称为cSGEP的修饰载体的功能(补充图)。S1a)。具体来说,我们已经针对转录辅激活子BRD 4,造血转录因子MYB和RNA聚合酶2 RPA 3的核心亚单位,这是已知的必要的AML细胞株。

图1:影响AZA敏感性的染色质调节剂是通过优化的功能缺失shRNA筛选来识别的.
figure1

aHEPI 9库的组成。b人类插图HNRPA2B1-CBX3位点包括普遍存在的染色质开放元件(UCOE)和含有UCOE的cSGEP主干载体、脾聚焦形成病毒(SFFV)启动子、绿色荧光蛋白(GFP)标记基因、shRNA整合位点、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和普罗霉素(Puro)抗性基因。c编码染色质调节剂的shRNA筛选靶向基因的原理图工作流程。d在3个生物复制体中,启动AZA处理后,在不同时间点测定SKK-1细胞的活细胞百分率(每2天培养0.25μm,共2周)。e与富集基因相对应的火山图(“基因抑制AZA存在下的生存”)或耗尽(“AZA存在下生存所需的基因”)shRNAs。选定的基因被命名为。FC,折叠找零。CREBBP,P=0.0001;NAA 15,P=0.0001;HMGA 2,P=0.0032;CBX 3,P=0.0061;EP 300,P=0.7405。f在一定浓度的AZA处理4天后,检测稳定表达cSGEP、shNAA 15-1或shNAA 15-2的SKK-1细胞的百分率。g, h将稳定表达cSGEP、shCBP-1或shCBP-2的SKK-1细胞用所指示浓度的AZA和活细胞百分比处理4天。g)或评估gfp阳性细胞的百分比(h). fh数据表示四个独立实验的平均±扫描电镜。采用双向方差分析方法进行统计学分析。***p-价值<0.0001。源数据作为源数据文件和补充数据提供13.

对于功能缺失的筛选,SKK-1细胞感染cSGEP shRNA文库时,病毒滴度较低,有利于单拷贝整合(图1)。1C),选择普罗霉素,半数细胞用部分致死剂量的AZA处理2周,我们先前用稀释系列法测定了这一剂量(补充图)。S1b)。细胞处理导致4天后活细胞百分比迅速下降,随后恢复,表明细胞克隆的扩张具有生长和生存的优势(图一)。1D)。为了鉴定影响细胞对AZA反应的基因,我们比较了对照组和处理细胞中所有shRNA克隆的丰度,并对处理结束时从细胞群体中纯化的基因组DNA中的转基因进行了大规模平行测序。为了确定相关基因,我们只考虑了8个shRNAs中至少有5个显示出相同趋势的基因,并计算了它们的平均倍数变化(补充数据)。3)。使用这种方法,我们可以识别451个基因,其shRNAs显著减少,252个基因,其shRNAs被丰富(图)。1E)。细胞中shRNAs的减少表明对相应基因的敲除是不耐受性的,在AZA作用下,这些基因产物是生存所必需的。最受欢迎的是CREBBP编码转录辅助激活子CBP。相反,与AZA敏感性增强相关的基因是通过其shRNAs的富集而呈现的,因为它们的敲除降低了细胞在AZA存在下的敏感性,从而提高了细胞的存活。这包括编码N-α-乙酰转移酶NAA 15,它是NAA复合物的一个组成部分,与核糖体和共翻译的乙酰化蛋白结合。41.

耗竭的发夹是我们特别感兴趣的,因为它们表明了潜在的组合药物靶点。因此,我们选择了cbp的顶级缺失Hit编码进行进一步的分析,并包含了顶级富集基因。NAA 15作为控制。为了验证shRNA筛选的结果,我们构建了具有稳定的CBP或NAA 15单基因敲除的多克隆SKK-1细胞株,选择了每个基因两个独立的shRNAs(补充图)。S1c,d)。我们评估了4天后,不同浓度的AZA处理这些细胞的活力,其范围在先前计算的半数最大抑制浓度(IC 50)附近(补充图)。S2A)。根据shRNA筛选的结果,我们观察到NAA 15缺陷细胞的活力明显增加,反映出对药物的敏感性降低(图一)。1F)。在AZA存在下,CBP缺陷细胞系表现出相反的行为,细胞存活率下降(图1)。1g)。当监测感染细胞和非感染细胞在共同生长的活细胞中所占的百分比时,CBP基因敲除后细胞的敏感性增加也是可见的。在这种竞争的生长条件下,CBP敲除细胞在AZA存在下的耗竭速度比对照细胞更快(见图)。)。因此,我们观察到AZA(补充图)处理的CBP基因敲除细胞凋亡增加。1E).

综合起来,利用染色质调节因子的基因丧失功能筛选,可以识别出影响SKK-1细胞对AZA敏感性的几个基因。具体来说,我们认为组蛋白乙酰化酶CBP是一种潜在的联合治疗药物靶点。

CBP/P 300抑制对AZA的敏感性

为了进一步验证CBP对AZA敏感性的影响,我们利用CBP/P 300小化合物抑制剂的有效性。C646是第一个被开发的cbp和p 300抑制剂,它的功能是通过与辅基乙酰辅酶a竞争来与酶的kat结构域结合。42。我们首先测定了C 646在SKK-1细胞中的IC 50(补充图)。S2A)。为评估C 646与AZA的组合效应,将细胞单独或与C 646联合处理,浓度接近其IC 50或略低于其IC 50。与CBP基因敲除的效果相似,我们可以观察到与单独治疗相比,C 646与AZA联合作用后细胞活力显著降低(图1)。2A)。用周-塔拉莱法计算组合指数(CI)43表明两种化合物之间有协同作用(如图所示)。2A)。这也反映在凋亡细胞数量的大量增加时,两种药物联合治疗(补充图)。S3A)。C 646处理还进一步增加了CBP耗竭细胞的反应,提示抑制P 300或残余CBP有助于观察到的效应(附图)。S3b).

图2:抑制CBP/p 300可提高AML细胞对AZA的敏感性。
figure2

a, b占活SKK的百分比-1(a)或MOLM-13细胞(b)DAPI/MitoTracker染色检测,以所示浓度的AZA与C 646或0.075%DMSO联合作用4d后作为车辆对照。c不同浓度AZA与CBP/p 300抑制剂A-485、ICBP-112和CCS 1477、BET溴域抑制剂JQ-1、bcl-2抑制剂ABT-199或0.03%DMSO联合作用4天后,MOLM-13细胞活细胞百分比为对照。d以指示浓度的AZA与C 646或DMSO(0.075%)联合作用4天后,F-36P或MDS-L细胞的活细胞百分比为对照。e用Annexin V染色法检测3例AML患者在不同浓度AZA作用3d后,用500 NM CCS 1477或8 MAS-485或0.08%DMSO作为载体对照的白血病细胞凋亡百分率。ad结合指数(CI)的计算采用周-塔拉莱法。43。++增效作用(CI:0.3~0.85),±加性效应(CI:0.9~1.1)。数据表示四个独立实验的平均±扫描电镜。采用双向方差分析方法进行统计学分析。*p-数值<0.05;*p-价值<0.0001。源数据作为源数据文件提供。

我们接下来评估了CBP/P 300抑制对另一个细胞株AZA反应的影响。MOLM-13是另一株MDS衍生的SAML细胞系,但其驱动突变与SKK-1不同。36。其中包括一些在其他AML亚型中更为普遍的基因改变,如flt 3内部串联重复序列、MLL-af9融合以及CBL, KMT2ANF1基因。由于MOLM-13细胞在体外实验中使用较多,其特性与MDS和SAML患者的特点更接近,因此我们决定进一步关注这一细胞系。首先,我们在细胞活力测试中测定了AZA和C 646的IC 50(补充图)。S2B)。与SKK-1细胞的结果相似,我们观察到当C 646和AZA联合使用时,细胞活力有明显的协同下降。2B)。再一次,这也反映在与单独治疗相比,组合治疗引起的细胞凋亡增加(补充图)。S3c)。接下来,我们在MOLM-13细胞中联合检测了CBP/P 300抑制剂和AZA的联合作用。为此,我们选择了强效和高特异性的Kat结构域抑制剂A-485。44和cbp/p 300特异性溴结构域抑制剂icbp-112和ccs 1477。45,46。重要的是,CCS 1477是cbp/p 300的第一个抑制剂,首次在AML、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤(Nct 04068597)和去势耐药前列腺癌(NCT 03568656)的临床试验中测试。47。我们进一步包括了更通用的溴域和外生域(Bet)抑制剂jq-1,它抑制下游效应子brd 2和brd 4的溴结构域。48。作为基准和参考,我们使用bcl-2抑制剂abt-199(Venetoclax)。49,经美国食品和药物管理局(FDA)批准,与AZA或十氯他滨联合治疗75岁以上成人急性髓细胞白血病(Https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/fda-grants-regular-approval-venetoclax-combination-untreated-acute-myeloid-leukemia)。我们测定了这些化合物在MOLM-13细胞中的IC 50值(补充图)。S2C)。AZA与接近其IC 50的A-485、ICBP-112和CCS 1477的结合显示细胞活力明显降低,与AZA的协同作用显著降低(图1)。2C)。值得注意的是,AZA与CBP抑制剂的组合比与BET抑制剂JQ-1的组合更为有效,且与ABT-199的组合范围相似(见图)。2C)。我们进一步证实了与C 646共处理的另外两个SAML细胞系F36-P和MDS-L对AZA的反应增强。二维空间)。接下来,我们使用了从三个独立患者中分离出来的原发性AML细胞(补充数据中的患者特征)。2用A-485和临床相关抑制剂CCS 1477治疗。在所有三种情况下,联合治疗比AZA单次治疗更有效(如图所示)。2E).

总之,这些结果表明CBP和P 300抑制剂增加了AML细胞对AZA的反应。值得注意的是,与美国FDA批准的AZA和ABT-199的结合相比,这种组合在细胞系中达到了相似的协同作用。

SLAM-seq鉴定与蛋白质合成相关的cbp/p 300的直接靶基因

虽然AZA在过去几十年中得到了广泛的应用和研究,但CBP/p 300抑制剂直到最近才获得临床研究的兴趣,而抑制CBP/p 300的生物学效应还不完全清楚。为了进一步探讨CBP/P 300的抑制作用,了解AZA与C 646协同作用的机制,我们开始对CBP/p 300的直接靶基因进行鉴定。为此,我们在短期抑制cbp/p 300和用硫醇(SH)链式烷基化方法标记mrna代谢序列(slm-seq)后,对新合成的mrna进行了量化。50。具体来说,我们分析了用C 646处理或不经C 646处理的MOLM-13细胞在最后一个小时内与代谢标记相吻合的情况(图一)。3A)。我们从T>C转换定义的新合成的转录本中调用差异表达的基因,我们能够检测到处理后细胞中新生转录本的显著和广泛的抑制(图一)。3B(补充资料)4)。当分析所有的读取和绘制全局mRNA水平时,无法检测到这一点(见图)。3B(补充资料)4)。在对新合成的基因进行严格切割(Fdr)≤0.0 1、log2 FC≤−1/log2 FC≥1后,与二甲基亚砜(DMSO)对照相比,在C 646细胞中鉴定出2 2 2 0个上调基因和2 2 5 3个下调基因。下调基因的强过度表达与CBP/P 300作为转录辅助激活因子的作用相一致。通过对下调基因进行功能基因本体论分析,我们发现了对RNA生物合成和蛋白质合成有重要意义的基因的丰富。3C)。与蛋白质折叠、热休克蛋白、伴侣结合和蛋白稳定有关的基因本体在10倍小的上调基因中富集(图1)。三维空间)(补充数据5)。经C 646处理4h后,实时定量PCR(RT-qPCR)可以证实蛋白翻译相关基因的抑制和伴侣基因的上调。3E,f)。重要的是,使用另一种更特异的抑制剂A-485抑制CBP/P 300,证实了参与蛋白翻译的基因的下调(图一)。第三代)。对C 646反应的基因子集的抑制作用可以在SKK-1细胞中进一步证实(见图)。3H).

图3:SLAM-seq鉴定的CBP/p 300的直接靶基因。
figure3

aSLAM-seq新合成RNA代谢标记样品制备协议的原理图工作流程。MMC 646或DMSO处理MOLM-13细胞,1h后用4sU标记,2h后收集RNA并测序。b图显示总mRNA或新合成mRNA丰度的折叠变化(FC)与其标准化基线表达(RPM)有关。基因显著改变(FDR<0.01),分别以蓝色和红色突出。c顶级浓缩团,被下调或d使用david函数注释聚类确定的上调转录本68,69. e, fRt-qPCR方法筛选出的CBP/p 300靶基因在10 MC-646或0.1%DMSO作用4h的MOLM-13细胞中的相对表达。gRt-qPCR方法筛选出的CBP/p 300靶基因在1 mA-485或0.01%DMSO作用4h的MOLM-13细胞中的相对表达。hRt-qPCR方法筛选出的CBP/p 300靶基因在10 MC-646或0.1%DMSO作用4 h的SKK-1细胞中的相对表达。c, d用Fisher氏精确检验进行统计学分析。eh数据表示至少三个独立实验的平均±扫描电镜。由双面学生进行统计分析T-与未经处理的样本比较,*p-数值<0.05。源数据作为源数据文件和补充数据提供45.

综上所述,我们的结果表明,在MDS衍生的SAML细胞中,CBP/p 300促进了参与蛋白质合成和细胞同质平衡的基因的表达。

CBP/p 300对蛋白质合成的抑制作用

通过它在RNA中的掺入,AZA曾被证明能抑制蛋白质的合成。13。这使得我们怀疑CBP/P 300与AZA抑制细胞活力的协同作用是否是由于增强了AZA的RNA依赖功能,并将蛋白质合成限制在白血病细胞无法耐受的水平。为了验证这一耐人寻味的假设,我们分析了CBP/P 300抑制剂C 646与AZA类似物十他滨的结合。与AZA不同的是,它的类似物十他滨不与RNA结合,因此不影响蛋白质的合成。22。事实上,我们发现C 646和十氯他滨对MOLM-13和SKK-1细胞活力的联合作用既不是加性的,也不是协同的,甚至对SKK-1细胞具有强烈的拮抗作用(图一)。4A)。为了确保SKK-1和MOLM-13细胞株对去甲他滨的治疗有反应,我们测试了其对细胞系-1 DNA甲基化的抑制作用(补充图)。(中4)。

图4:CBP/P 300的抑制降低了蛋白质的合成,但与癸他滨没有协同作用。
figure4

a以所指示浓度的AZA和5 M-十氯他滨或DMSO(0.05%)作为载体对照,处理4天后,存活的MOLM-13或SKK-1细胞百分比。数据表示四个独立实验的平均±扫描电镜。采用双向方差分析方法进行统计学分析。联合指数(CI)计算显示拮抗作用(CI>1)。b检测新生蛋白质的原理图工作流程。MOLM-13细胞用10 MMC 646或0.1%DMSO处理,1.5 h后改为不含蛋氨酸(MET)的培养基,加入AHA代谢性标记2 h,4 h后收集细胞。新合成的蛋白质按照Clickit法进行亲和纯化。c对未处理和处理后的样品中新合成的蛋白质的数量进行了分析。未贴标签的样品作为阴性对照。d小提琴图显示所有检测到的蛋白质的平均肽谱匹配(PSM)。e饼图显示,大多数检测到的蛋白质受到PSM降低75%或更多的影响。fClickit富集法测定的新合成蛋白(≥75%)与SLAM-seq测定的新生蛋白(log2FC≤−1,fdr≤0.1)之间的重叠显著降低。g显着还原蛋白的本体分析(与未处理样本相比,≤减少75%)。用Fisher氏精确检验进行统计学分析。源数据作为源数据文件和补充数据提供67.

接下来,我们希望更好地了解CBP/P 300抑制对蛋白质合成的影响程度。类似于SLAM-seq的mRNA检测,我们使用代谢标记来鉴定和定量新合成的蛋白质的质谱(MS,图)。4B)。具体来说,我们选择了用C 646进行4小时的短期治疗,以避免诸如凋亡信号所产生的二次效应。如图所示。4C,我们观察到CBP/p 300抑制使检测到的新生蛋白总数从2807显著减少到638(平均复制数)(补充数据)。6)。在不加标记的背景对照中只检测到160个蛋白质,除少数在未处理样品中检测到的10倍或更高水平的蛋白质外,未进行进一步分析时被排除在外。此外,我们决定重点分析在所有DMSO对照样品中检测到的2423个蛋白质。CBP/P 300抑制后,每个蛋白的肽谱匹配数(PSMS)减少,表明检测到的蛋白质丰度降低(图1)。4D)。以75%以上的PSM作为截止点,表明2125个蛋白质,相当于DMSO样品中所有蛋白质的68%,受到CBP/P 300抑制作用的影响。4E)。当比较SLAM-SEQ(图)。3B在蛋白质组学研究中,我们发现CBP/p 300处理后,新合成的mRNA转录体与相应的新合成的蛋白质有29%和28%的蛋白质组学和SLAM-seq重合(图1)。4F)。这表明CBP/P 300对蛋白质合成的抑制作用不能完全归因于mRNA的减少,而在于蛋白质翻译机制的整体下调。对受影响蛋白质清单的进一步研究表明,翻译机制中的mRNAs编码成分的减少也反映在蛋白质水平上,这可以通过对受影响蛋白的基因本体分析来证实,表明参与mRNA加工和剪接的蛋白质丰富(图1)。4G和补充数据7).

总之,我们的结果表明CBP/p 300抑制对蛋白质合成有显著的影响,这至少在一定程度上是由于转录下调了翻译机制中编码部分的目标基因。

CBP/p 300抑制降低AZA的活性蛋白翻译和增强RNA依赖功能

为了进一步探讨cbp/p 300抑制对蛋白质合成的影响,我们采用蔗糖梯度超速离心法测定细胞多体含量作为细胞转录体活性的读数,以反映细胞的蛋白质合成能力。51。如图所示。5A(补充数据)8CBP/p 300抑制剂C 646处理MOLM-13细胞较未处理细胞明显减少多核糖体数量,提示C 646对全球蛋白翻译有严重影响。为了进一步研究这一点,我们进行了流式细胞术分析,以全面监测蛋白质合成。我们能够证实CBP/P 300抑制5例健康供者骨髓中的造血干和祖细胞的蛋白质合成减少(供体详情见补充资料)。2)。如图所示。5B,C 646对这些原代细胞的作用导致蛋白质合成呈剂量依赖性的部分减少。在MOLM-13和SKK-1细胞中,三种CBP/p 300抑制剂治疗后对蛋白质合成的影响更为明显(图一)。5C)。在稳定耗尽CBP(补充图)的细胞中,较不明显的减少。S5)。此外,我们还证实了AZA对翻译的抑制作用。5C)。AZA与CBP/p 300抑制剂C 646、A-485或CCS 1477的结合,导致蛋白质合成进一步显著下降,在某些情况下接近于环己酮完全关闭的水平(CHX,图1)。5C)。与SAML细胞株相似,AML患者骨髓中分离的白血病细胞对CBP/P 300抑制剂的蛋白质合成水平表现出较强的敏感性,在AZA的存在下,CBP/P 300抑制剂的敏感性进一步提高。5D).

图5:CBP/P 300的抑制作用削弱了活性蛋白的翻译,而氮胞苷可进一步降低其活性。
figure5

a用10μm M C 646处理4 h,用蔗糖梯度超离心法分离多体裂解物,紫外吸收分光光度法(260 Nm)在梯度上测定核糖体RNA含量。多聚体丰度被归一化为基线吸光度。数据表示三个独立实验的平均±扫描电镜。由双面学生进行统计分析T-与未经处理的样本比较,*p-价值=0.0267。b健康供体CD 34+细胞经8h处理后荧光强度中位数,C 646浓度增加,蛋白质合成测定。数据表示五个独立实验的平均±扫描电镜。统计分析由未配对的双面进行。T-与未经处理的样本比较,**p-价值<0.001。cDMSO(0.1%)、C 646(10 M)、A-485(1M或2.5M)或CCS 1477(1M或2.5M)处理6 h的MOLM-13或SKK-1细胞在AZA(2或1 M)作用下的中位荧光强度,然后用Click-it™HPG Alexa-Fluor™594进行检测。用放线菌酰亚胺(CHX)作用1.5h细胞为阳性对照。d用DMSO(0.075%)、C 646(7.5M)、A-485(1M)或CCS 1477(0.25MAZA)处理3 h的白血病细胞中位荧光强度的典型图像。用放线菌酰亚胺(CHX)作用1.5h细胞为阳性对照。e机理模型表明CBP/P 300抑制与AZA的协同作用是由蛋白质合成减少引起的。c, d数据表示至少三个独立实验的平均±扫描电镜。由双面学生进行统计分析T-测试*p-数值<0.05。源数据作为源数据文件和补充数据提供8.

CBP/P 300抑制对蛋白质合成有明显的抑制作用。根据我们的数据,我们认为CBP/p 300抑制剂的这种作用机制解释了它们与AZA的RNA依赖效应的协同作用。5E).

讨论

在我们的研究中,我们通过对MDS衍生的SAML细胞系进行功能缺失筛选,研究了染色质调节剂对AZA细胞内禀反应的影响。使用这种不偏不倚的方法,我们确定了N-α-乙酰转移酶NAA 15和转录辅激活剂CBP分别是AZA抗性和敏感性的主要调节因子。NAA 15是一种N端α-氨基乙酰化酶,它作为nta复合物的一部分,通过乙酰化关键的凋亡介质来促进对凋亡刺激的敏感性。52。这可以解释在NAA 15敲除细胞中观察到的对AZA处理的抗性。相反,CBP对AZA敏感性的影响是出乎意料的,但CBP及其相关蛋白p 300对几个AML细胞的药物抑制作用证实了这一点。我们的方法仅限于细胞内禀反应,并将细胞存活作为评估药物反应的主要参数。重要的是要记住,我们的方法仅仅模拟了AZA在临床中的作用机制的一个方面。未来的研究需要评估CBP/p 300作为药物组合靶标在小鼠模型和共同培养实验中的有效性,以更好地反映MDS和SAML的复杂性。这一点特别重要,因为AZA临床疗效的一部分是通过病毒模拟激活干扰素反应,使疾病细胞对免疫系统可见。18。如果在临床前的研究中进一步证实,CBP/p 300的Biosafe抑制剂的可用性将保证它们与AZA的结合,将在评估目前高风险MDS治疗的改进的临床试验中进行测试。

重要的是,我们在此表明,CBP/P 300的缓蚀作用对AZA具有特异性,不能与密切相关的药物十尼他滨联合使用。这两种药物的主要区别在于,80%-90%的aza被掺入rna,而剩下的10%-20%被dna吸收,而倍他滨则完全被dna吸收。14。以前的一些研究报告了对十氯他滨和AZA细胞反应的差异。22,26,53,这包括发现AZA,而不是十氯他滨,减少AML细胞的蛋白质合成。22。由于我们没有观察到CBP/P 300抑制作用与十硝基他滨的协同作用,我们的结果表明CBP/p 300的抑制作用与AZA的RNA依赖效应是协同的。AZA和十他滨均被批准用于治疗血液疾病,包括高危MDS.目前,没有生物标记物或病人分层来选择一种治疗方法而不是另一种治疗方法。虽然没有随机临床试验直接比较这两种药物在同一队列的病人,但有几项研究表明,病人对依西他滨和AZA的总体反应是非常相似的。9,54,55,56,57。然而,在考虑反应预测参数、与其他药物的组合或耐药机制时,部分不同的作用机制可能具有相关性。我们的研究指出,CBP抑制剂的有效使用主要是与AZA而不是十氯他滨联合使用。其他人最近发现,对AZA的抗性与rna依赖的染色质结构的改变、RNA聚合酶2与NSUN 1和Brd 4的相互作用增加以及与NSUN 3和DNMT 2相互作用的丧失有关。25。重要的是,这些变化被归因于AZA的RNA依赖功能,并使AZA耐药细胞容易受到Brd 4的抑制,而这种抑制并不是对地西他滨耐药细胞的预期。重新审视我们的筛选结果,NSUN 3和Brd 4的基因敲除也有相反的效果,尽管比cbp或NAA 15击倒观察到的效果要小得多(见补充数据)。3)。以支持郑氏的研究。25,我们发现NSUN 3的基因敲除增加了AZA的敏感性。

我们研究的一个意想不到的重要发现是CBP/P 300抑制影响蛋白质的合成。作为一种可能的解释,我们发现CBP/p 300正调控着多个编码翻译机制核心成分的基因,而CBP/p 300抑制则显著降低了全球蛋白质的合成。编码未折叠蛋白伴侣的基因在CBP/P 300抑制下被上调,这很可能是对蛋白翻译问题的应激反应。然而,基于CBP/P 300对蛋白质合成的快速而明显的抑制作用,我们不能排除另一种直接机制的可能性。结果表明,CBP/p 300的抑制作用增强了AZA的RNA依赖功能。AZA和CBP/P 300对蛋白质合成的抑制作用可能是观察到的协同效应的原因之一。在这里,我们主要使用的工具化合物C 646,这是第一个选择性抑制剂cbp/p 300正在开发。42。然而,它缺乏药效,其药代动力学特性不利于体内使用。44。为了克服这些问题,新的抑制剂CBP/P 300的特性得到了改善。A-485是一种类似于C 646的抑制剂,能抑制催化结构域。44。另一个有前途的CBP/p 300抑制剂是CellCentric有限公司的CCS 1477。46,58,与C 646和A-485相比,它们针对的是P 300和CBP的保守溴结构域。CCS 1477目前在AML、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤(NCT 04068597)和耐去势前列腺癌(NCT 03568656)的人类临床试验中被首次评估。结果表明,无论抑制方式如何,CBP/p 300抑制剂均与AZA协同作用,诱导蛋白质合成强烈下降。

CBP/P 300抑制对翻译的影响为组合治疗的合理设计开辟了一条途径。在未来的研究中,我们将测试CBP/p 300抑制剂与诸如eIF 2翻译因子抑制剂Salubrine等药物的潜在合成致命组合。此外,我们的数据表明,CBP或p 300缺陷细胞和单纯性细胞可能对AZA或直接限制蛋白质合成的处理特别敏感。这是相关的,因为p 300的丢失与疾病的进展有关。59.

总之,我们的研究对与血液学疾病相关的药物提供了重要的见解。CBP/p 300抑制协同增强细胞对AZA的固有反应,目前用于治疗高危MDS患者。这种协同作用是特定于AZA及其RNA依赖的功能,而不是观察到替代FDA批准的药物十氯他滨。CBP/p 300抑制剂已经进入临床试验,这里所确认的与蛋白质合成的联系为开发有效的药物组合和反应预测因子提供了信息。


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