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PD-1阻断治疗中AML的单细胞T细胞景观和T细胞受体谱分析

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发表时间:2021-10-22 09:56作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

与同种异体干细胞移植通过T细胞活性治疗急性髓细胞白血病的疗效相比,T细胞表型和T细胞受体(TCR)储备可能是T细胞表型和T细胞受体(TCR)循环所致。本文通过对复发性/难治性急性髓系白血病患者治疗前后骨髓细胞的配对单细胞RNA分析和TCR谱分析,发现与疾病相关的T细胞亚群高度异质性,其丰度随PD-1阻断治疗而改变。TCR曲目扩大并主要从CD8中出现+对治疗有反应或病情稳定的患者的细胞,而TCR储备在治疗中收缩。-耐药的病人。弹道分析显示连续的CD8+T细胞表型,以颗粒酶B的差异表达和骨髓滞留记忆CD8为特征+T细胞亚群,其中具有表达颗粒酶K的茎样特性的群体在应答者中富集.另一方面,第7/7q染色体丢失是AML中Pd-1阻断耐药的一个肿瘤固有的基因组标记。总之,我们的研究揭示了适应性T细胞可塑性和基因组改变决定了对PD-1阻断急性髓系白血病的反应。

导言

尽管来源于免疫丰富的骨髓(BM)环境,AML细胞破坏正常的造血和逃避免疫监视。1,2。然而,白血病细胞对免疫介导的根除很敏感.具体来说,对于AML患者来说,alloSCT仍然是唯一的治疗选择,主要是通过移植T细胞对抗白血病效应来实现的。3。对于许多有共同性或缺乏匹配供体的AML患者来说,异基因造血干细胞移植并不是一个可行的选择。利用患者自身的免疫T细胞是增强AML治疗策略的一种有吸引力的选择。

免疫检查点抑制疗法改变了实体癌症患者的治疗结果。4,5,6,7。从同种异体SCT的疗效判断,AML是一种理想的免疫应答肿瘤。然而,CTLA 4-ipilimumab在alloSCT后的阻断作用8,并结合低甲基化剂氮胞苷和pd-1抑制剂nivolumab(以下称为icb基治疗)治疗R/R AML。9在病人身上表现出温和和可变的效果。这突出了在pd-1阻断治疗背景下破译AML T细胞前景的迫切需要,这与以前在实体癌症方面的工作类似。10,11,12,13.

单细胞RNA(ScRNA)分析是指导我们解释细胞多样性和T细胞状态的有力工具。1,11,12,13,14。应用scRNA对免疫检查点治疗后的实体肿瘤景观进行解剖,了解治疗反应的细胞机制。例如,黑色素瘤患者CD8+Tcf7+黑色素瘤细胞、CD8+T细胞功能紊乱和T细胞耗竭的积累与免疫治疗反应的改善有关15,16,17,18。然而,如果肿瘤内T细胞受体(TCR)库是内在的肿瘤反应,则T细胞功能是有效的。19。因此,与scRNA和scTCR的配对分析增加了一个正交维数来进一步描述T细胞的状态和对治疗的反应。在实体癌中,TCR谱图被用来检测肿瘤内T细胞反应,并作为免疫检查点治疗反应的生物标志。19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,并揭示了pd-1阻断后新克隆在皮肤癌中的扩展。28。虽然概括这些观察是由于病人人数少,分析的深度允许高分辨率解剖T细胞和他们的储备。在AML和其他恶性血液病患者中,在免疫检查点阻断治疗的背景下,TCR循环的动态变化还没有得到充分的研究。目前还没有证据表明,急性髓细胞白血病免疫治疗的反应程度确实与适应性T细胞储备有关。

在这里,我们发现在R/R AML中,对基于ICB的治疗的反应与CD8+T细胞克隆的扩展和新出现有关,而对这种治疗的抵抗则与收缩的T细胞阵挛型有关。此外,AML中的CD8+T细胞是连续的,GZMK的表达在CD8+T细胞的记忆子集中富集。我们的研究表明,第7/7q染色体缺失是抗ICB治疗的一个固有的AML生物标志物。这一分析的结果提供了AML T细胞景观的深刻特征,并可通过识别骨髓驻留的T细胞亚群和可被利用的肿瘤内在因素来外推解释对PD-1阻断治疗其他恶性血液病的T细胞动力学。

结果

患者群体及特点

我们在NCT 02397720上对22例(治疗前8例和治疗后14例)骨髓抽吸物进行了配对scRNA和scTCR分析。1A)。临床和人口特征显示在补充图。1A和补充表1。简单地说,在接受基于ICB的治疗之前,8例患者中有7例使用了低甲基化药物。在ICB基础治疗中,3/8(PT1-3)有效,3/8(PT4-6)为无反应者(NR),2/8(2/8)患者病情稳定(SD)。1A)。8例患者中有6例在以icb为基础的治疗开始前至少有1例细胞遗传学异常,其中3/3例(无反应者)携带染色体7/7q(chr 7/7q)缺失(补充表)。1)。每个病人至少有一个时间点的靶向DNA测序(总共评估了17/22)显示了ASXL1(4/8例)TET 2(3/8例)SRSF 2(3/8名病人)及FLT 3(2/8例)(附图)。1B).

图1:AML和健康骨髓的研究设计和单细胞评估。
figure1

A临床设计总结了年龄,每个ELN的反应类型,反应时间,治疗频率和分析的每个病人的细胞数。B典型基因表达标记物用于定义健康骨髓(BM)和肿瘤微环境(TME)细胞亚群。C基于UMAP的健康BM细胞成分与每种细胞类型频率的分析。D代表联合患者骨髓样本(以PT1为代表,治疗后时间点C)与健康BM供体细胞显示明显聚集的肿瘤细胞与CD 34的一致表达,经流式细胞术和免疫组织化学确认,如有(补充图3A-D)。E与单核细胞相比,具有代表性的恶性细胞拷贝数变异显示一致的细胞遗传学特征,进一步证实了AML细胞的特性。FScRNA检测细胞数与流式细胞仪检测细胞数与组织病理学之间的关系。GAML细胞的UMAP聚类HTME组件的UMAP聚类。I不同时间点AML患者TME成分的分布(A为治疗前,B和C为治疗后样本).公共关系部分反应,完全回应,NR没有回应,SD稳定的疾病,HSC造血干细胞GMP粒细胞-单核祖细胞,疾控中心传统的树突状细胞PDC浆细胞样树突状细胞不Conv T非常规T,NK自然杀手。

健康和AML BMS中的聚类定义

为了指导AML bms中的聚类注释,我们从2名健康BM供者的13,633个细胞中构建了一个BM细胞参考序列,并利用典型的免疫基因标记。29,30,31,32,33,如前所述28,34,35,36(无花果)1B)。UMAP与弹道分析37,38,39显示起源于造血干/祖细胞的分化谱(图)。1C和补充图。2A),与以前的报告一致29,40。为了进一步完善我们的分析,我们将健康bm细胞映射到一个独立的参考数据集,该数据集包含30672个健康BM细胞。41细胞注释的符合率为91%(补充图)。2B-E),确定准确的聚类定义。

为了将AML细胞与bm环境中的其他细胞成分区分开来,我们去除了那些双链细胞,它们具有较低的读取深度,或者像以前建议的那样具有较高的线粒体基因表达。29,36,42,43,然后应用规范标记来定义AML集群。利用DoubletFinder,进一步验证了我们对双联产品的质量控制措施。44。与我们的质量控制分析一致,双打评分分布没有显示出双重聚类,这表明在我们最初的质量控制分析中,双子细胞被适当地移除了(补充图)。2F,G)。我们使用多参数流式细胞术的表达模式和同一时间点的免疫组织化学标记,在可用的情况下,确定AML簇(补充图)。3A-D)。为了进一步完善我们的方法,我们计算了每个AML BM与健康供体BMS的结合,并演示了远离健康细胞的AML细胞的明显的群集形成(图一)。1D)。我们进一步验证了推测的AML细胞的非整倍体状态。推断CNV工具45来自scRNAseq和证明与临床细胞遗传学谱相一致(补充表)1)(图1.1E).

8例急性髓系白血病(AML)患者22例(22 R/R AML BM)共60,753个AML和52,641个肿瘤微环境(TME)细胞通过质量评估,纳入下游分析。用scRNAseq鉴定的AML细胞比例与临床流式细胞仪测定的BLAST比例密切相关(r=0.87,p=1.5×10−7)和组织病理学(r=0.73,p=0.0001)(图1。1F)。治疗前和治疗后AML细胞由患者聚集(如图所示)。1g而来自不同患者的TME组分聚集在一起,并具有不同的分布(图1)。1H,I)。AML和TME细胞的聚类模式与其他肿瘤相似,表现为肿瘤间的异质性。28,29,35,46,47.

TCR治疗后阵挛型扩张的可变容量

TCR分析可以反映T细胞对检查点阻断治疗的反应。19,20,21,22,23,24,25,26,27,28。我们对8例急性髓系白血病患者在治疗前后的22例骨髓抽吸物中的26,095个T细胞进行了α和βscTCR分析,并从健康骨髓基质细胞中检测了4742个T细胞。在正常BMS中,只有7.2%(345/4742)的TCR克隆型在2个或更多的T细胞中存在,而在所有AML BMS中,只有51%的TCR克隆型存在。克隆型大小,以表达相同TCR序列的细胞数表示,在健康供体中为1~16,而在AML中为1~1200(图1)。2A),在AML骨髓中表现出较高的克隆性。

图2:不同患者和时间点的T细胞受体克隆型评估。
figure2

AT细胞阵挛型数与阵挛型大小的相关性散点图,即T细胞数目对该克隆型的贡献。B按病人分布的最丰富的克隆型。C辛普森的克隆性指数的个别病人在各自的时间点。D阵挛型散点图,治疗后和治疗前的变化E由反应小组。F按应答组划分的新的、扩展的和收缩的克隆型的数量。

在预处理时间点,AML患者T细胞频率发生了显著变化,形成了最丰富的克隆型。治疗后,4例患者(2例有反应,2例SD)出现最丰富的阵挛型扩张(图1)。2B)。相反,NR(3/3)患者有其最丰富的克隆型收缩(图)。2B)。如所料,健康的BM T细胞库几乎没有显性克隆。2B)。与治疗前(A时点)相比,3个应答者在治疗后克隆性(时间点B)持续增加(C时点),但PT3(应答者)的克隆性(时间点B)最初增加,随后在形态学AML进展之前克隆性(C)下降。3例NR和1例SD患者治疗后TCR克隆性相对降低,1例SD患者(Pt7)TCR克隆性持续增高(图5)。2C).

T细胞适应性强,TCR再灌注治疗反应性的能力是可变的。19。为了研究治疗后克隆型丰度是如何变化的,我们比较了每个克隆的频率,并确定了治疗后显著变化的克隆(Fisher‘s精确)p < 0.05) (Fig. 二维空间)。新克隆(未在预处理时检测到)占显著扩展的克隆型的43%(Fisher‘s的精确性)。p < 0.05) (Fig. 2D,E)。与临床反应的关系显示,不同类型的克隆型变化丰富。具体来说,大部分(77%)显着扩张克隆出现在应答者(77%)和SD患者(18%),而大多数(70%)显着收缩克隆出现在NR和SD患者(Fisher‘s确切无误)中。p < 0.05) (Fig. 2F)。这些发现表明TCR储备对治疗的反应能力是可变的,类似于在实体癌症中的表现。19.

AML患者T细胞亚群的异质性

接下来,我们描述了T细胞的景观,以勾勒出对克隆型有贡献的不同表型群。我们确定了5个(2个常规和3个非常规)48急性髓细胞白血病治疗前后22例骨髓中25,798个T细胞的T细胞表型(见图)。3A)。2种常规表型为CD4。+和CD8+预处理时分别占BM T细胞的53%和35%,治疗后分别占BM T细胞的30.9%和37.4%。治疗前BMS患者CD4:CD8比值为1.51,低于正常BMS患者(1.88),治疗后CD4:CD8比值进一步下降至0.82。3种非常规T细胞表型分别为γ-δ(γδ)细胞、粘膜相关不变T-细胞(MAIT)和所有其他T细胞(UnconvT),分别占治疗前T细胞的2.3%、2.1%和7%,而治疗后分别占T细胞的8.5%、14.4%和8.5%。因此,CD8的比例+,γδ和MAIT细胞增多,CD4细胞增多。+治疗后,所有患者的细胞数量都减少了(如图所示)。3A)。此外,5种T细胞表型在8例患者中的分布和治疗时间的不同都有明显的差异,显示了患者特异性T细胞的分布,但也注意到了一些类似的趋势(图一)。3B)。例如,在预处理时,CD4+在应答者(64.3%)和NR(42.48%)患者中,细胞是最常见的细胞类型,而CD8则是最常见的细胞类型。+细胞在SD患者中最常见(53.48%)(附图)。4A)。治疗后CD8+在应答者(30.28%)和SD患者(57.5%)中,细胞是最常见的细胞类型,而NR患者则持续升高CD4。+细胞(52.91%)(附图)。4A)。此外,γδ和MAIT细胞在治疗后反应增加(补充图)。4A),虽然这种影响主要是由PT1驱动的。这些发现揭示了患者之间和应答组之间的异质性T细胞表型,并揭示了治疗后纵向发生的动态变化。

图3:T细胞亚群的表征。

AT细胞亚群的UMAP。B治疗前后T细胞亚群的分布。C已鉴定T细胞亚群典型标记表达的热图。不同的UMAPDCD4+ECD8+有耗竭和细胞毒性评分的表型投射到UMAP上。FCD4衰竭评分的Man-Whitney试验+和CD8+治疗前不同反应组的T淋巴细胞。GCD4衰竭评分的Man-Whitney试验+和CD8+应答者治疗前后T淋巴细胞。H用GZMK表达观察TCGA组AML患者的总体生存情况。

T细胞的亚分类揭示了不同的细胞表型

应用多参数流式细胞术对33例患者(13例应答者和20例无反应者)在阿扎替丁/尼沃卢马(Nivolumab)临床试验中进行骨髓预处理,发现CD3显著升高。+ (p=0.027)和CD3+CD8+(p=0.044)应答者中的细胞(补充图。4A,B),与应答器中可能存在的适应性T细胞浸润相一致。然而,我们的临床流式细胞术小组排除了深入的T细胞表型,可以替代来源于scRNA分析。因此,我们根据典型基因的表达,从scRNA谱中进一步对T细胞进行分类(如图所示)。3C和补充图。4C)。CD4+细胞聚集成CD4+天真和CD4+包括FOXP 3在内的执行器子集+(T)雷格),T辅助1细胞(T)H1),TH17个细胞和CD4+细胞毒性(CTL)细胞,而一个簇没有明显的表达谱(CD4)诺斯)(图1.三维空间)。CD8+簇包括CD8+天真,CD8+STAT 1(浓缩为STAT 1并表达干扰素γ途径基因)、CD8+GZMK(浓缩为GZMK)和CD8+CTL(富集细胞毒性标记物)GZMB, GNLYPRF 1)(图1.3E)。当跨反应组检查时,CD8+GZMK占CD8的多数+3位应答者在治疗前细胞数量明显多于NR(反应者平均为53.2%,NR为18.8%)。p=0.03)(附图。4E、F)。然而,预处理CD8+CTL细胞在3个应答者中最少,低于3个无应答者(反应者平均13.9%,NR者59.9%)。p=0.06)(附图。4C,D)。CD8基因的差异表达+与非应答者相比,GZMK显着地上调了肿瘤坏死因子(TNF)α信号通路的137个基因(补充图)。4G和补充数据1),响应程序中的激活细胞状态是一致的。49,50。CD4的变化没有明显的模式。+在我们的单细胞分析中,各反应组治疗前后的亚群(补充图)。4H).

接下来,我们利用单细胞基因集变异分析(GSVA)对这些细胞状态相关的基因进行检测,以测量这些细胞的细胞毒性和衰竭程度。17,51,52。CD4衰竭评分+和CD8+细胞随着细胞毒性分数的增加而增加,而治疗前和治疗后细胞通过细胞表型聚集在一起(如图所示)。3D,E)。在预处理时,CD4的耗竭分数+和CD8+3名反应者的细胞数低于2名SD和3名NR患者(p < 0.0001) (Fig. 3F)。治疗后CD4衰竭评分+没有变化,而CD8则没有变化+3名反应人员显著增加(p < 0.001) (Fig. 第三代)。无反应者精疲力竭评分显著下降(p=0.0005)与较低的CD8相一致+治疗后CTL比例(附图)。5A)。这些数据表明CD8有更多的动态变化。+比CD4+急性髓细胞白血病(AML)患者尤其是急性髓细胞白血病(AML)患者在ICB基础治疗后的亚群,以CD8前处理差异最显著。+GZMK和CD8+CTL组件。

CD8中这些差异的解释+响应组之间的子集应通过小样本大小进行调整。然而,GZMK的鉴定为CD8。+在所有患者中发现的在应答者中富集的聚类标记物值得进一步研究。GZMK在AML细胞中缺失(附图)。5B),而其在TME中的表达在CD8亚群中表现出明显的差异。+细胞,在某些NK,CD4中的频率较低+和MAIT细胞(附图)。5C,D)。因此,我们研究了gzmk的表达是否与预后相关,并发现tcga队列中的AML患者。53GZMK较高(p表达改善了患者的整体生存率,提示GZMK升高可改善AML患者的预后(图一)。3H)。这些发现证实了CD8的进一步特征。+表达GZMK的细胞。

伪时间轨迹分析显示为CD8+连续体

有5个人颗粒酶基因。GZMA, GZMB, GZMH, GZMM,和GZMK)只有GZMA和GZMB的功能得到了很好的描述。54。为了研究颗粒酶的表达是否能反映细胞状态规划的一个独特的标志,我们进行了假时间轨迹分析,并揭示了一种CD8。+CD8连续体+GZMK细胞是CD8的中间细胞+天真和CD8+CTL细胞4A,B)。我们还观察到CD8的假颞轴中有明显的颗粒酶A、B和K的表达。+细胞。特别是,GZMA在非天真的CD8中普遍表达。+细胞,而GZMBGZMK表达谱在不同的伪时间轨迹中表达(见图)。4C-E)。特别是,GZMBGZMK在细胞毒性T细胞中的表达时间较晚,而GZMK在较早的假时表达最为明显(图一)。4C-E)。细胞毒基因的表达水平GNLY(将颗粒酶蛋白导入靶细胞以发挥效应作用)54)在GZMK中,CD8表达减弱。+细胞与CD8的比较+CTL细胞4F)。此外,两者之间也存在着负相关。GZMKGZMB, GNLY, PRF 1, GZMHPRF 1表达,以及细胞毒性评分(图)。4G)。有趣的是,共同刺激基因LTBCD 27,干细胞样T细胞转录因子Tcf710,28,51,55,以及T细胞记忆转录因子。埃梅斯11CD8高表达+GZMK细胞,但不包括CD8+CTL细胞4H)。为了进一步探讨GZMK在造血细胞中的表达,我们从人类蛋白质图谱中评估了3个不同的数据集。56。来自人类血细胞的3个独立数据集57,58,59,GZMK的最高表达是在记忆T细胞中,这为GZMK在记忆T细胞中的表达提供了一个独立的验证(补充图)。5E-G)。基于人类蛋白质图谱56扁桃体组织中GZMK在淋巴组织中的表达最高。因此,我们用记忆标记CD45RO和CD8来评估GZMK的表达,发现GZMK在记忆CD8细胞的子集中共同表达(补充图)。5H-K)。此外,最近的研究表明,GZMK可以区分不同的记忆T细胞亚群。60,61,62。这些发现,在伪时间轨迹分析的支持下,暗示了连续的CD8。+具有中间、独特的CD8的细胞+急性髓细胞白血病GZMK患者以高表达GZMK为特征,并携带有干细胞样和记忆性T细胞标记。

图4:CD8+T细胞的轨迹分析。

A, B基于单细胞3的CD8假时相分析+子集。CFGZMA、GZMB、GZMK和GNLY在CD8细胞中的表达+连续体。GCD8中GZMK与其他细胞毒性基因的Pearson相关性+细胞。HCD8差异表达基因的热图分析+T淋巴细胞亚群。IMAIT细胞的UMAP有衰竭和细胞毒性评分预测。JT细胞亚群在PT1中的分布。KMAIT亚组间差异表达基因的热图。

GZMK表达式描述PT1中的MAIT子集

MAIT细胞的无偏聚类显示出两种不同的表型:一种富集于较少疲劳,GZMK表达簇(MAITGZMK)和另一种富集于GNLY/GZMB细胞毒性基因(MAITCTL),类似于CD8+细胞(图1.4I)。值得注意的是,在我们的分析中,89.9%的MAIT细胞是由PT1(应答者)贡献的,他们有一个独特的临床过程(补充图)。6A)。简单地说,PT1对氮胞苷有难治性AML(9/2015-4/2016),对依纳西德尼布(04/2016-07/2016)进行抢救(04/2016-07/2016)。IDH 2-变异难治性AML。88岁时,他开始了第二次抢救方案,联合阿扎替丁/尼伏鲁马,在治疗开始后11个月达到部分疗效。他在以ICB为基础的治疗中持续了32个月的临床效益,直到他发展出ICB所致的肺炎,因此有必要进行转换治疗。由于这个病人对单一药物阿扎替丁没有反应,然后显示了对氮胞苷/尼伏鲁马的持久的部分反应,我们假设这种反应主要是由尼伏鲁马引起的。PT1治疗后,MAITGZMK的比例由11%下降到8.2%,5.5%,MAITCTL则由8.2%上升到22.2%至23.9%。4J)。结论与MAIT细胞有关,仅从1例患者中衍生出MAIT细胞,但此患者与MAIT细胞扩增相关的临床过程值得强调这些发现。

类似于CD8+GZMK细胞、MAIT GZMK细胞分别富集CD 27、LTB、Tcf 7和Eomes。4K)。因此,GZMK的表达清楚地勾勒出CD8的亚群。+MAIT细胞提示一个独特的转录程序与GZMK的表达相关。因此,我们进行了基因表达谱分析,比较了每种CD8的GZMK和CTL亚型。+和MAIT细胞。CD8中33个重叠基因的途径富集+MAITGZMK与CTL的标记显示出对参与白细胞分化、钙信号和细胞因子产生的途径的高度富集(补充图)。6B)。重要的是,钙信号调节T细胞的分化和激活,是实现T细胞功能特异性所必需的,并调节细胞因子的分泌和细胞毒途径。63.

TCR克隆型的表型特征

建立在TCR分析的基础上,揭示了患者之间可变的克隆型变化(图一)。2E-G),我们利用配对的sctcr和scrna来整合克隆型分析和T细胞表型状态,然后推断出表型活动。64。在T细胞中,细胞毒性亚型具有较高的克隆优势。5A)。接下来,我们评估了治疗后不同T细胞亚型对克隆型池的贡献。CD8+GZMK和CD8+CTL对新克隆的贡献最大,而MAITCTL的扩增克隆和CD8的比例最高。+CTL有最高比例的收缩克隆(图)。5B)。这表明CD8+AML中的细胞确实可以被激活以引起治疗后的克隆型改变。

图5:T细胞克隆型分析。

ATCR克隆型频率按细胞类型的分布。B按细胞类型分列的新的、扩展的和收缩的克隆型的数目。CT细胞比例从顶部,最丰富的3个克隆型。D治疗前后不同细胞类型重叠阵挛型的热图。E热图,观察到的表型转变匹配的克隆在治疗前后的时间点。

接下来,我们评估了每个患者在治疗前和治疗后T细胞表型对前3位最丰富的克隆型的贡献,类似于pd-1阻断后皮肤癌的先前研究。28。3种最丰富的克隆型主要由相同或相似表型的细胞类型所致(见图)。5C)。例如,CD8+GZMK和CD8+CTL对PT2、PT4、Pt7和PT8的无性系贡献最大。5C)。PT1的MAITGZMK和MAITCTL在治疗前共有2种最丰富的克隆型。治疗后,最丰富的阵挛型在3/3的应答者中扩大,但在NR中缩小,而在SD患者中无变化(图1)。5C)。类似于pd-1治疗后的基底细胞癌和鳞状细胞癌。28Pd-1阻断后,优势克隆型无表型不稳定性。

T细胞谱系间的共有克隆型

接下来,我们通过调查与其他T细胞谱系共享的T细胞谱系(主细胞类型)中的Clonotype的比例(次级细胞类型)来探索谱系转换。我们观察到CD8之间的重叠。+亚型,包括CD8+GZMK和CD8+CTL,治疗前后(图一)。5D)。此外,CD8之间的重叠+亚型在治疗后增加,提示CD8在不同活化状态之间的转换。+Pd-1阻断剂可促进细胞生长(如图所示)。5D)。具体来说,与终末效应细胞CD8重叠。+Ctl在pd-1阻断后显著升高,包括CD8。+GZMK,建议向CD8过渡+CTL状态。然而,CD4的重叠现象较少。+治疗前后细胞表型,表明CD4之间的转换有限。+细胞状态。

为了评估克隆型的稳定性,我们评估了治疗前后每个T细胞表型的共有克隆型比例(如图所示)。5E)。MAIT,CD8+GZMK和CD8+CTL细胞表现出相对的克隆型稳定性,而CD4则表现出相对的稳定性。+细胞在处理后保留的克隆较少(如图所示)。5E)。此外,30%的预处理CD8+Gzmk克隆型与治疗后CD8共有。+CTL。这些发现表明,在ICB治疗后扩展的密切相关的T细胞系之间存在着共同的克隆型,因此,早期的抗原启动伴随着表型上的差异。

Chr 7/7q丢失与对ICB治疗的抵抗有关。

T细胞景观调节pd-1阻断的反应,而肿瘤基因组的改变影响实体癌症免疫治疗的反应。65,66,67,68,69,70。然而,AML细胞具有较低的肿瘤突变负担。71,但巨大的基因组改变和SCNA会影响治疗和结果。53,72。因此,我们申请推断CNV工具45推断AML细胞的大规模SCNAs,并与BM抽样前后的临床细胞遗传学数据相一致(补充表)1)。在预处理时,3/3 NR患者(PT4,PT5和PT6)推断了大部分恶性细胞中Chr 7/7q的丢失。6A)。有趣的是,PT3(有CR的应答者)在临床和形态学复发之前,出现了chr7q缺失(在15/20细胞核型中证实)。6B,C与TCR克隆优势丧失有关。2C).

图6:反应与细胞遗传学的相关性。

A推断每名患者在预处理时代表的300个细胞的拷贝数变化(时间点A)。B推断出PT3(应答者)三个时点(A、B和C)的拷贝数变化。C鱼类PT3突变进化图。D一种用于阿扎替丁/尼沃卢马和阿扎替丁反应者相关分析的双面皮尔逊卡方E基于chr7/7q缺失的以氮胞苷为基础的治疗。FT的CIBERSORTx分析的双边试验Mann-Whitney雷格TCGA中细胞成分的chr7/7q状态(n=19对于del7/7q和n=152,在chr7/7q中没有删除)。中心线代表主铰链和下铰链,上铰链对应于第一和第三四分位数。

为了验证chr7/7q丢失与ICB治疗耐药的相关性,我们评估了57例以氮胞苷和尼沃鲁马方案治疗的具有可评价的预处理细胞遗传学谱的R/R AML患者。有趣的是,只有10.5%(2/19)的chr7/7q缺失患者对治疗有反应,而未缺失的患者只有36.8%(14/38)有反应。p=0.03)(图1。6d)。为了使氮杂替丁与尼伏鲁马效应脱钩,我们对一个独立的R/R AML队列进行了类似的分析(n=99)在无ICB治疗的基础上进行以氮胞苷为基础的临床试验。有趣的是,35%(5/14)的R/R AML患者出现Chr7/7q缺失,而未缺失的患者仅为17.6%(15/85)。p=0.11)(图1。6E)。这些数据表明,Chr 7/7q丢失与联合使用尼伏马布/氮杂替丁有关,但对无ICB的氮杂替丁治疗无效。

我们接下来的目的是描述潜在的调控失调的分子过程和与chr7/7q耐ICB治疗相关的生物学途径。MTORC 1信号、糖酵解和干扰素γ(IFNγ)标记通路在chr7q上的差异表达基因在缺失患者和完整的chr 7/7q(补充数据)中高度富集。2和补充图。7A)。此外,干扰素γ途径基因,即干扰素相关的发育调节剂(IFRD 1)和组蛋白赖氨酸甲基转移酶KMT2CKMT2E在我们的分析中被明显地下调了。我们的scRNA谱中也检测到的所有chr7q基因的基因集富集分析也显示了干扰素γ途径的显著富集。q < 0.0005). Since IFNγ signaling shapes the immune BM microenvironment73并在chr 7/7q区富集T细胞,通过CIBERSORTx估计T细胞在TCGA AML队列中的绝对浸润与chr 7/7q丢失的相关性。74。T型雷格细胞显著(p7/7q缺失的急性髓系白血病患者(0.005)较高(n=19)与完整的chr 7/7q(n=152)(图1。6f)。值得注意的是,CD8+Chr7/7q缺失组T细胞绝对浸润率较高(附图)。7b)然而,CIBERSORTx反褶积不允许进一步描述CD8的表型。+子集。此外,伴有chr7/7q缺失的TCGA AML患者的生存率明显低于无chr7/7q改变的患者(p=0.015)(附图。7C)。因此,Chr 7/7q丢失似乎与一个富含T的免疫抑制环境有关或促进了这种环境。雷格免疫细胞会导致不良结果。

讨论

将AML细胞从复杂的、免疫丰富的微环境中分离出来,可以揭示AML环境中的T细胞表型。1。评估TCR储备可以推断T细胞对治疗的反应性。19,64。对T细胞亚群和TCR储备的配对分析更准确地评估了pd-1阻断治疗后T细胞的功能特性。19,20,21,22,23,24,25,26,27,28。在本研究中,我们利用配对scRNA和scTCR谱分析AML BMS治疗前后的动态变化,了解T细胞及其储备。

我们配对的scRNA和scTCR分析支持了一种适应性的T细胞库,主要由细胞毒性T细胞克隆型扩展,主要出现在ICB治疗后的应答者和SD患者。有1例患者(PT3)在复发前出现阵挛性收缩和Chr 7/7q丢失。有趣的是,某些克隆型在不同的T细胞表型之间存在着共同的差异.这表明,虽然克隆可能产生克隆型,但T细胞可能因微环境信号而在功能上发散。64。而且,CD8也有可能+GZMK细胞在功能分化为CD8+CTL的同时,GZMK表达缺失和GZMB的获取,这得到轨迹分析和TCR克隆型在治疗前后30%重叠的支持(见图)。5E)。值得注意的是,检查站的封锁确实会导致实体癌症的循环扩大。12,28,75。然而,在皮肤癌中,大多数扩展发生在招募的新克隆中。我们发现,在AML中,扩展和新的阵挛型,可能分别代表本地和招募的阵挛型,参与反应。与实体癌相比,其差异可能与骨髓作为T细胞成熟的主要部位有关,从而使Pd-1阻断浸润性T细胞的再生。

GZMB在介导细胞凋亡方面有很好的描述。76,77,78,79。然而,GZMK被认为是一种“孤儿”颗粒酶,一些研究认为它是一种细胞溶解标记,而另一些研究则认为它没有细胞毒性。35,54。我们的数据支持GZMK识别CD8+用于类茎和记忆特性的子集。GZMK细胞具有较低的细胞毒性基因表达。PRF 1/GNLY/GZMB)但这两种转录因子都有高表达Tcf7埃梅斯。Tcf 7-表达CD8+在用pd-1抑制剂治疗的黑色素瘤小鼠模型中,细胞通过树干样活动介导和维持免疫应答,并在淋巴细胞性脉络膜脑炎病毒感染后产生免疫应答。80,81,82。另外,CD8+Tcf7+T细胞定义了肿瘤患者的干细胞样T细胞,增强了自身的更新能力和多向性,并产生了分化程度更高的效应细胞CD8。+T细胞,进一步支持我们的连续模型55,83。Eomes使记忆CD8更丰富。+Bm小生境中的T细胞促进记忆细胞的形成,并在CD8中表达。+细胞与黑色素瘤免疫治疗反应的关系11,84,85。此外,损失埃梅斯导致记忆障碍的T细胞群体,其表达与长期记忆性T细胞有关。86。我们通过询问人类蛋白质图谱数据集进一步验证了我们的发现。57,58,59并证实GZMK在记忆T细胞中的表达最高。最近,GZMK在不同的记忆T细胞亚群中被证明是差异表达的,并且对记忆T细胞功能至关重要。60,61,62。总的来说,这些发现支持类似于实体癌症的T细胞记忆亚群可以影响血液恶性肿瘤对PD-1阻断治疗的反应。

我们的分析允许研究与抗药性或对检查点阻断治疗的反应相关的基因组标记。肿瘤突变负担和dna损伤反应基因的改变与改善固体癌症患者对检查点阻断治疗的反应有关。65,66,67,68,69,70。此外,SCNAs与实体癌免疫治疗应答降低有关。67,68,87。然而,AML有较低的突变负担。71但高细胞遗传学改变与SCNA53,72因此,研究其他可能影响免疫环境的基因组机制是有价值的。具有不良细胞遗传学的AML患者具有免疫抑制作用2。在这里,我们证明了chr 7/7q的丢失与对ICB治疗的抗药性有关。虽然其潜在机制尚未被完全了解,但这些发现是重要的,因为它们表明细胞遗传学分析是AML患者在治疗开始前常规病理评估的一部分,应该被评估为一个潜在的预测生物标记物,用于在反洗钱的基于ICB的治疗试验中进行患者选择。

目前,AML患者仅在复发/难治性临床试验中接受PD-1治疗.在了解T细胞生物学、亚群和TCR序列以应对在这一相关治疗背景下的治疗方面存在知识差距。我们的分析,虽然是在相对较少的病人身上进行的,但提供了对T细胞结构和适应性T细胞储备谱的深入观察,以响应治疗。这些数据为深入了解T细胞和AML细胞的分子动力学建立了一个框架,并有望推动制定最佳个性化组合方法,以提高这些患者的疗效和预后。


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