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己糖激酶2驱动的周细胞糖酵解激活其收缩能力,导致肿瘤血管异常

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发表时间:2021-10-22 09:34作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

肿瘤周细胞-内皮细胞相互作用缺陷导致血管混乱、组织不良和功能失调.然而,这背后的潜在机制却没有得到充分的研究。在此,我们开发了一种结合磁珠和流式细胞术细胞分类的方法,从非小细胞肺癌(NSCLC)和肝细胞癌(HCC)患者的肿瘤和正常邻近组织中分离周细胞。与正常组织相比,肿瘤周细胞表现出血管支持功能缺陷。结合蛋白质组学和代谢通量分析,发现肿瘤周细胞中己糖激酶2(HK2)驱动的糖酵解水平升高,从而上调其ROCK2-MLC2介导的收缩能力,导致血管支持功能受损。临床上,血管中HK2阳性周细胞比例高,与NSCLC和HCC患者整体生存率差有关。使用一种HK2抑制剂可诱导周细胞-MLC 2驱动的肿瘤血管重塑,从而增强药物的释放和抑制肿瘤的生长。总之,这些数据提示,糖酵解在肿瘤周细胞调节他们的血管支持作用。

导言

周细胞在稳定血管壁、控制血管扩张、调节血管灌注等方面具有重要的调节作用。1,2,3。与其他宿主细胞不同,周细胞表达特定的表面标记/受体,如血小板衍生生长因子受体β和CD 146(又称黑色素瘤细胞粘附分子),并对特定的生长因子(包括PDGF、转化生长因子和血管生成素)产生反应。2,4。在血管生成过程中,内皮细胞分泌PDGF,通过激活pdfrβ信号将周细胞吸收到新形成的血管中。1,5。与pdfrβ不同,CD 146最初被认为是血管生成过程中的内皮细胞标记物。6,它在周细胞中也有高表达,对调节周细胞-内皮细胞在血脑屏障发育过程中的相互作用具有重要意义。4。因此,这两种表面蛋白常被用作周细胞鉴定的阳性标记。

正如肿瘤内皮细胞与正常组织中静止的内皮细胞不同,与正常组织中的周细胞相比,肿瘤来源的周细胞似乎是异常的或功能失调的。7,8。目前尚不清楚癌细胞是否指导周细胞命运的改变以促进肿瘤生长。事实上,在许多癌症中观察到有缺陷的周细胞-内皮细胞相互作用,其特征是血管完整性受损。9,10。例如,肿瘤血管周细胞的丢失或脱落在某些癌症中经常被发现,并被认为能促进肿瘤的转移。11,12。另一方面,周细胞被证明可以保护内皮细胞不受抗血管生成药物(即贝伐单抗)的影响,因此在几种动物模型中,联合应用pdfrβ酪氨酸激酶抑制剂(即消除pdfrβ阳性周细胞)和血管内皮生长因子抑制比单独抗血管内皮生长因子治疗更有效地阻断肿瘤血管生成。13,14。然而,联合治疗在肾癌患者的临床试验中并没有提供任何治疗效果,甚至在肾癌患者中表现出附加毒性。14,15。因此,临床前探讨周细胞-内皮细胞相互作用的分子机制是临床尚未满足的需要。由于缺乏研究人周细胞生物学的细胞模型,导致肿瘤周细胞行为异常的确切原因尚不清楚。以前的研究表明,代谢途径的调节决定了内皮细胞的细胞状态和命运决定。16。例如,抑制内皮细胞中的糖酵解激活剂PFKFB 3可以提高周细胞覆盖率和血管功能,从而提高化疗药物在临床前动物模型中的传递和疗效。17。然而,代谢重组在人类周细胞生物学中的作用仍然很大程度上是未知的。

在本研究中,我们建立了周细胞己糖激酶2(HK2)驱动的糖酵解在重建肿瘤血管中的作用。通过对非小细胞肺癌(NSCLC)和肝癌(HCC)患者的正常癌旁组织(NPC)和非小细胞肺癌(NSCLC)和肝癌(HCC)患者的癌周细胞的分离和培养,发现TPC与鼻咽癌相比具有异常的血管支持功能。结合蛋白质组学和代谢通量分析发现,与NPC相比,TPC中HK2驱动的糖酵解作用增加,这是通过激活ROCK2-MLC2介导的收缩而抑制其血管支持作用的。重要的是,HK2/ROCK 2的缺失恢复了TPC的血管支持功能,而HK2抑制剂则能诱导MLC 2驱动的肿瘤血管重塑,从而增强化疗的传递和抑制肿瘤生长的效果。周细胞-HK2的表达在这一过程中的作用被进一步证明,与与肿瘤细胞共注射和转染TPC的小鼠相比,化疗降低了与肿瘤细胞共注射和HK2缺失的tpc小鼠的肿瘤生长。

总之,我们的工作建立了一个研究周细胞生物学的细胞模型,并发现周细胞-HK2驱动的糖酵解通过激活ROCK2-MLC2介导的收缩作用而诱导肿瘤血管异常。

结果

微球活化血管细胞分选富集法的建立

尽管之前的研究已经成功地从小鼠脑组织中分离出周细胞。18,19目前还没有一种有效的分离和培养成对正常邻近组织和肿瘤的人周细胞的方法。由于肺和肝组织都含有丰富的血管细胞,因此在本研究中选择它们作为分离人周细胞的来源(补充图)。1)。由于抗人CD 146抗体与fITC和抗fITC磁性微球结合,我们建议使用CD 146。+-FITC-微珠活化细胞分选(MACS)法,先从组织标本中富集血管细胞,然后用阳性和阴性选择标记,通过荧光活化细胞分选(FACS)分离周细胞群体(附图)。1)。为了实现我们的周细胞纯化方法,我们首先检测了CD 146在正常的癌旁组织和非小细胞肺癌(NSCLC)和肝癌(HCC)患者的血管内皮细胞和周细胞中是否有表达。基于CD 34和α-sma/pdfrβ分别被认为是血管内皮细胞和周细胞标记物。7,20在本研究中,他们被用来定义CD 146染色。我们对这些标记物分别与正常的癌旁组织和非小细胞肺癌患者的肿瘤分别进行了三重免疫荧光染色,结果表明,CD 146在正常癌旁组织和癌旁组织中的CD 34阳性(+Ve)血管内皮细胞和αSMA/PDGFRβ+Ve膜细胞中均有表达,而在正常的癌旁组织和来自非小细胞肺癌和肝癌患者的肿瘤中CD 146和α-SMA的阳性率分别为65-72%(见图)。1A-f和补充图。2A,b)。CD 146和α-SMA双阳性血管在正常邻近组织和肿瘤中的比例无显着性差异(图二)。1C,f)。此外,我们还发现α-SMA在CD 34阳性血管周围的PDGFRβ+周细胞中也有表达(补充图)。2C,d),这与以前的发现是一致的。1。因此,我们的结果表明CD 146+-FITC-微珠活化细胞分选法可以丰富NSCLC和HCC患者组织标本中血管细胞的数量。

图1:用CD 146纯化非小细胞肺癌和肝癌患者癌旁正常组织和肿瘤的周细胞+--FITC-MACS富集法。
figure1

af本文对非小细胞肺癌和肝癌患者的正常邻近组织和肿瘤进行了典型的CD 34(白色)、CD 146(绿色)和α-SMA(红色)三重免疫染色。条形图代表CD 146和α-SMA-双阳性(+Ve)血管在每组中的百分比(n=10名非小细胞肺癌/肝癌患者)。统计检验是双面的。gj具有代表性的流式细胞术(FACS)图显示非小细胞肺癌患者(+)和不伴(−)CD 146的正常邻近组织和肿瘤周细胞纯化的门控策略+-FITC-微珠细胞分离富集(MACS)法。排除碎片、双丝(TOF)和死亡细胞(FVD),然后是CD 45。CD 31CD 146+PDGFRβ+取周细胞。百分比指的是前一个父门中单元格的比例。k, l条形图显示了MACS富集结合FACS方案分离的周细胞和内皮细胞的相对折叠变化,与单纯FACS分离的相比,差异有显着性(P<0.05)。统计检验是双面的。周细胞百分比指R1门中的细胞群。NSCLC非小细胞肺癌、肝细胞癌、FSC前向散射、SSC侧散射、TOF时间、FVD固定活性染料、EC内皮细胞、PC周细胞、NEC正常邻近组织来源内皮细胞、TEC肿瘤源性内皮细胞、NPC正常邻近组织来源周细胞、TPC肿瘤衍生周细胞。FACS图/条形图代表三个单独的病人数据。给出了平均值±SEM。c, f, k, l学生的t测试一下。标尺a, b, d, e代表50μm,a, b, d, e(放大图片)代表25μm。

为了从正常的癌旁组织和肿瘤中分离周细胞,首先从机械切割和酶切组织中去除死亡细胞和碎片。用FITC结合CD 146抗体标记单细胞悬液,然后用抗FITC磁性微球富集。随后用内皮细胞(CD 31)、免疫细胞(CD 45)和周细胞标记物(PDGFRβ)标记富集的血管细胞。然后用FACS(补充图)收集标记细胞。1)。FACS图显示了内皮细胞(EC)和周细胞(PC)与正常癌旁组织(NEC和NPC)和来自NSCLC和HCC的肿瘤组织(TEC和TPC)分离的门控策略。1g-j和补充图。2e-h)。重要的是,我们的MACS富集法成功地提高了从非小细胞肺癌和肝癌患者的配对正常组织和肿瘤中分离人周细胞的效率,与单纯FACS法相比几乎提高了7-13倍(如图1所示)。1K、L)。与单纯的FACS方法相比,我们的方案增加了成功分离足够多的周细胞进行后续培养、鉴定和功能研究的机会(补充图)。1)。总的说来,该方法使我们能够在培养中获得高重复性的纯周细胞,这主要是由于MacS富集法和温度/时间控制的培养方法,以及优化的胶原酶和DNase I的加入量。

非小细胞肺癌和肝癌癌旁正常组织及肿瘤分离周细胞的特征

为证实分离的癌周细胞的纯度,我们对分离的癌周细胞进行了流式细胞术和免疫染色实验,结果表明:非小细胞肺癌和肝癌患者的癌周细胞表达PDGFRβ和CD 146,以及新发现的周细胞标志desmin和CD 13,但未表达内皮细胞标记CD 31和CD 34、免疫细胞标记CD 45或成纤维细胞标记FAP(成纤维细胞相关蛋白)(Fig)。2A,b和补充图。3A,b)。进一步的RT-PCR分析证实,这些周细胞表达的内皮细胞标记物水平相对较低或无法检测到。CD 31CD 34,免疫细胞标记物CD 45,平滑肌细胞标记物CNN 1MYOCD,以及周细胞/成纤维细胞标记物ACTA 2、成纤维细胞标记物FAPPDGFRA(血小板源性生长因子α)分别与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、外周血单个核细胞(PBMC)和人成纤维细胞(图)进行比较。2C和补充图。3C)。相反,非小细胞肺癌/肝癌衍生鼻咽癌和tpc都强烈表达周细胞标记物。PDGFRbCD 146分别与成纤维细胞和HUVEC比较。2C和补充图。3C)。此外,在第3和第12代,NPC与TPC或TPC之间的周细胞标记表达水平均无显着性差异(图5)。2A-C和补充图。3A-E),表明我们的培养方法可以在传代过程中保持离体细胞的周细胞同一性。

图2:正常邻近组织来源的周细胞和肿瘤来源的周细胞的特征。
figure2

a应用流式细胞仪对正常癌旁组织及非小细胞肺癌患者的肿瘤细胞进行流式细胞分析,结果表明,制备的周细胞纯度较高。周细胞标记PDGFRβ、CD 146、CD 13表达良好,内皮细胞CD 31、CD 34及免疫细胞标记CD 45未检出或低表达。b鼻咽癌、TPC、HUVEC和成纤维细胞内皮细胞、成纤维细胞、周细胞标记表达的免疫荧光染色分析n=3个独立样本)。cNpc、tpc、HUVEC、成纤维细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、平滑肌细胞(SMC)中内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、周细胞标志表达的RT-PCR分析CD 31, CD 34, CD 45, CNN 1, MYOCD,和ACTA 2表达式分析:n=4个独立NPC和TPC样本n=3个独立的SMC、PBMC和HUVEC样本;FAP, PDGFRA, PDGFRb,和CD 146表达式分析:n=每个细胞类型的3个独立样本)。dNSCLC/HCC患者鼻咽癌和TPC的倍增时间(英文)n=3项独立实验)。eβ-半乳糖苷酶染色法显示非小细胞肺癌/肝癌不同代的衰老细胞百分比。n=3项独立实验)。统计检验是双面的。f, g伤口愈合实验显示NSCLC/HCC源性NPC和TPC的迁移能力无明显差异(P>0.05)。n=3项独立实验)。统计检验是双面的。给出了平均值±SEM。c单向变异。d双向变异。eg学生的t测试一下。标尺b代表50μm,eg100μm.

其次,我们检测了它们的细胞形态、增殖、加倍时间、传代数、衰老、活力和迁移能力。相差显微镜分析显示,NPC和TPC细胞均具有组织切片中所见的周细胞形态特征,具有细胞核突出、细胞质含量小、突起较长的细胞体(图5)。2B和补充图。3B)。功能研究表明,NSCLC或HCC患者的NPC和TPC具有相似的倍增时间,可培养12代,在8~12代中可观察到逐渐衰老(图1)。2D,e),而在增殖方面没有显着性差异(补充图)。3F,g),细胞活力(附图)。3H),以及迁移(图1.2F,g)在NPC和TPC之间。为确定NPC和TPC在内皮细胞依赖性募集方面是否有差异,我们将NPC或TPC接种在跨孔的上腔室,而HUVEC细胞被放置在下腔室,说明NPC和TPC对HUVEC依赖的招募反应没有明显差异(补充图)。3I)。总之,我们的工作开发了一个细胞模型来研究NPC和TPC之间的功能差异。

肿瘤来源的周细胞有缺陷的血管支持作用。

周细胞通过调节内皮细胞的特性,在稳定血管壁方面具有重要的调节作用。1,9。为了确定NPC和TPC在内皮细胞增殖和迁移中的作用,我们将HUVEC细胞置于NSCLC或HCC患者的NPC/TPC的条件培养液中,说明NPC或TPC的条件培养基均能促进HUVEC的增殖。3A在伤口愈合实验中,两者均未显示出对HUVEC迁移的影响(见图)。3B)。为了研究NPC和TPC在血管形成中的作用,我们用荧光标记的NPC和TPC,以及成纤维细胞和平滑肌细胞(SMC),将HUVEC与基质上的任何一种细胞共同培养成纤维细胞和平滑肌细胞(SMC)。在共培养后,我们评估了它们对总管长、分支点和数量的影响(图)。3C-f和补充图。4A-d)。虽然NPC、TPC、成纤维细胞和平滑肌细胞加入HUVECs后沿管状排列,但它们对管长和分支有不同的影响。值得注意的是,与单纯与NPC、成纤维细胞或HUVEC联合培养的HUVEC相比,与单纯培养的HUVEC相比,与TPC共同培养的HUVEC减少了总管长、分支点和分支数,而正常成纤维细胞对所有这些均无影响(图1)。3C-f和补充图。4A-d)。与NPC、TPC或正常成纤维细胞不同的是,SMCs在排列后将管状细胞分开,并在24小时内导致管状网络迅速消退(如图所示)。3C-f和补充图。4A-d).

图3:肿瘤周细胞在体外和体内表现出缺陷的血管支持功能.

aCCK 8增殖试验显示,与未处理的HUVEC相比,NSCLC/HCC来源的NPC或TPC条件培养液对HUVEC的增殖有明显的促进作用。n=5次实验重复)。b非小细胞肺癌/肝癌源性NPC或TPC条件培养液暴露HUVEC后的创面愈合分析。每组均提供有代表性的伤口愈合实验图片(n=3项独立实验)。cHUVEC单独培养或与CFSE(绿色荧光染料)标记的NSCLC衍生的NPC/-TPC、成纤维细胞或平滑肌细胞(SMC)共同培养。df条形图显示每组的相对总管长、分支点和数目(n=3项独立实验)。g分别用CD 34、PDGFR、β或IV型胶原抗体免疫组化染色后,给出各组基质插头序列切片的代表图像。hk小提琴图显示每一组的血管总数、管腔直径、Ⅳ型胶原水平和覆盖率(n=每组3只)。结果为±SEM。a双向变异。b, df, hk单向变异。标尺b表示100μm,c200μm,g50μm.

为评价NPC和TPC在体内的血管支持作用,我们将NPC/TPC/成纤维细胞/SMC包埋于HUVEC的基质纤维蛋白基质中,并将其植入裸鼠皮下进行体内基质塞塞试验。基质凝胶塞试验表明,与单纯HUVEC移植相比,联合移植HUVEC和NSCLC/HCC-NPC和-TPC显著增加了血管数量(图1)。3G,h)。进一步的组织学检查显示,HUVEC与NPC共移植,但不支持TPC,支持功能血管(含红细胞)的形成,基底膜标记Ⅳ型胶原表达增强(如图所示)。3G-jTPC与HUVEC共移植时,可见较小、不规则的血管,可见IV型胶原染色减少。3G-j)。以往的研究表明,基底膜标志Ⅳ型胶原的表达与血管的完整性和灌注有关。1,7。正如预期的那样,平滑肌细胞和成纤维细胞对肿瘤血管形成和IV型胶原表达的影响非常有限。3G,h,j与TPC和NPC相比,SMC的管腔直径最大。3G,我)。最后,无论是NPC,TPC,成纤维细胞,或SMC都没有显示不同的管覆盖(图)。3K).

由于周细胞参与调节毛细血管扩张和收缩1,14因此,我们用卡巴胆碱对NPC和TPC进行了时间推移显微镜研究,从而评估了它们的收缩性能。治疗后,NSCLC/HCC源性TPC明显收缩,其表面积变化达30%,而NSCLC/HCC源性NPC的表面积变化不大(补充图)。4E,f)。相反,治疗后HUVEC/成纤维细胞的表面积无明显变化(补充图)。4E,f)。这些结果表明鼻咽癌和TPC在体外和体内的功能差异,提示TPC对BV的支持作用不如NPC,这可能与其增加的收缩表型有关。

结合蛋白质组学和代谢通量分析发现tpc中HK2驱动的糖酵解升高。

代谢重排决定细胞的增殖、迁移和收缩性。21。事实上,内皮细胞经过PFKFB 3依赖的糖酵解开关,以满足其在血管生成过程中迁移和增殖的高能量需求。然而,代谢状态在确定周细胞BV支持功能中的作用尚不清楚。另外,目前还不清楚NPC和TPC是否表达不同的糖酵解基因。因此,我们对NSCLC或HCC患者的NPC和TPC进行了RT-PCR分析,比较了它们的糖酵解基因通路的表达情况,表明NPC和TPC在糖酵解相关基因的表达上有明显的差异(图一)。4A,b)。在非小细胞肺癌和肝癌中,糖基化基因己糖激酶2的表达HK2)与NPC相比,TPC中表达明显上调(图1)。4A,b)。尽管先前的研究表明,抑制人胎盘周细胞中的PFKFB 3抑制其细胞迁移和增殖能力。17,我们没有观察到PFKFB 3NPC与TPC之间的表达(图1.4A,b)。此外,蛋白质组学分析表明,与NPC相比,TPC中HK2的表达明显增加,而PFKFB 3及其他糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白的表达却明显增加。4C)。Westernblot分析证实,与NPC相比,NSCLC/HCC源性TPC中HK2蛋白表达上调(图1)。4D)。在此基础上,我们采用葡萄糖摄取法、乳酸法、Seahors法和代谢通量分析法检测了NPC和TPC的糖酵解能力。如出一辙,NPC和TPC对葡萄糖的摄取无明显差异,而乳酸的产生则明显高于NPC(见图)。4E,f)。进一步的海马分析表明,与NPC相比,TPC细胞外酸化率(ECAR)升高,氧耗率(OCR)降低。4G,h和补充图。5A,b),这意味着TPC依赖于糖酵解来产生能量。为了获得放松管制的tpc代谢的机制基础,我们进行了13C标记代谢通量分析13C6葡萄糖用于估计NSCLC或HCC患者的TPC和NPC的代谢通量。代谢跟踪结果表明,TPC中糖酵解代谢物M3乳酸的相对丰度高于NPC,而直接从U-中提取的三羧酸(TCA)循环代谢产物的相对丰度无显着性差异(P>0.05)。13C6在NPC和TPC之间观察到葡萄糖,如M2柠檬酸、M2酮戊二酸、M2琥珀酸、M2富马酸和M2苹果酸。4I和补充图。5C).

图4:结合蛋白质组学和代谢通量分析显示,与NPC相比,TPC中HK2驱动的糖酵解升高。

a代谢网络显示糖酵解所涉及的代谢反应(基于京都基因百科全书和基因组途径,KEGG),以及主要代谢产物和22个选定的糖酵解基因。NSCLC/HCC源性NPC和TPC 22例糖酵解基因表达的热图分析n=3名个别病人)。b表显示鼻咽癌和TPC之间22例糖酵解基因表达的平均折叠变化和统计分析。c蛋白质组学分析表明,与鼻咽癌相比,己糖激酶2(HK2)在非小细胞肺癌(NSCLC)源性TPC中表达明显上调.这个x-火山地块的轴线显示原木2每种鉴定的蛋白质的折叠变化y-Axis表示−日志10P-价值观。红色点代表显著的上调蛋白,绿色点代表显著的下调蛋白(p < 0.05, fold change more than 2 (log2=1)。水平点线表示原始P-数值=0.05。折迭变化小于2的圆点(原木)2=1)和/或P-数值<0.05显示为灰色。统计检验是双面的。dNSCLC/HCC源性NPC和TPC中HK2表达的Westernblotting分析。使用HSC 70作为装载控制(n=3项独立实验)。e用葡萄糖摄取细胞分析试剂盒测定非小细胞肺癌源鼻咽癌和非小细胞肺癌细胞的葡萄糖摄取。n=3次实验重复)。统计检验是双面的。f用糖酵解细胞分析试剂盒测定非小细胞肺癌衍生鼻咽癌和-tpc的乳酸产量。n=5次实验重复)。统计检验是双面的。g, h用海马通量分析仪测定了非小细胞肺癌源性鼻咽癌和-TPC细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)。n=5项独立实验)。点线表示葡萄糖、寡霉素(Oligo)、2-脱氧-2-脱氧的时间和周期。D-葡萄糖(2-DG)、羰基氰化物-对三氟甲基苯肼(FCCP)、鱼藤酮(ROT)或抗霉素(Ant)。i示意图表示NSCLC衍生的TPC细胞内通量相对于NPC,使用U-13C6葡萄糖示踪剂开圆表示12C和填充的黑圈13C原子。条形图表示NPC和TPC之间代谢物的相对丰度。n=3次实验重复)。与NPC相比,红色箭头表示TPC中通量的增加。黑色箭头表示NPC和TPC之间的通量没有明显变化。统计检验是双面的。jCD 34(洋红色)、HK2(绿色)和α-SMA(红色)在正常的癌旁组织和肿瘤中的代表性图像。条形图表示每组每组HK2/α-SMA双阳性血管的百分比(n=10例非小细胞肺癌患者。统计检验是双面的。kKaplan-Meier生存研究表明,周细胞-HK2+Ve血管百分比高的非小细胞肺癌患者总体生存率低(n=77例非小细胞肺癌患者。统计检验是双面的。结果为±SEM。b, c, ej学生的t测试一下。k木级(曼特尔-考克斯)试验。标尺j表示50μm。

为了证明我们观察的临床意义,我们对来自非小细胞肺癌和肝癌患者的正常邻近组织和肿瘤进行了免疫荧光研究,结果表明,与正常的癌旁组织相比,癌周细胞-HK2阳性血管的比例明显升高(如图所示)。4J和补充图。5D)。接下来,我们对我们自己的非小细胞肺癌和肝癌患者进行了PDGFRβ、CD 34和α-SMA的三重免疫染色,表明在非小细胞肺癌和肝癌患者中,周细胞-HK2阳性血管的比例较高(即当肿瘤血管的平均数目超过肿瘤血管的周细胞-HK2阳性血管数时)与非小细胞肺癌和肝癌患者的整体生存率较差有关(图一)。4K和补充图。5E)。与NPC相比,我们的发现建立了tpc的主要代谢重新规划,明显地是通过上调HK2驱动的糖酵解在tpc。

周细胞-HK2驱动的糖酵解通过ROCK2-MLC2介导的收缩抑制周细胞的血管支持功能

其次,检测糖酵解开关在TPC中的功能相关性。用安慰剂或HK2抑制剂预处理TPC 15 min后,与HUVEC细胞共培养15 min。在非小细胞肺癌(NSCLC)和肝癌(HCC)中,与安慰剂预处理的TPC相比,HK2抑制剂预处理后HUVEC的总管长、分支点和数量都明显增加(如图1所示)。5A-d)。为了验证其在体内的作用,我们用安慰剂或HK2抑制剂3-溴匹丙酮酸(3-BP)预处理后将HUVEC植入基质纤维蛋白基质中,然后将其植入裸鼠体内,在收获前给予安慰剂或HK2抑制剂治疗。值得注意的是,HK2抑制剂对TPC促进血管形成的能力没有影响,但与安慰剂预处理的TPC联合移植相比,可提高HUVEC的血管直径和IV型胶原的表达(如图1所示)。5e-h)。两组接种率无显着性差异(图二)。5I)。重要的是,与安慰剂组相比,单独应用HK2抑制剂并不影响HUVEC移植后血管密度、血管直径和IV型胶原的表达。5e-h)。进一步的代谢研究表明,与安慰剂治疗的TPC相比,HK2抑制剂预处理对TPC的葡萄糖摄取没有影响(补充图)。6A),同时显著抑制TPC中乳酸的产生(补充图)。6B)。此外,与安慰剂预处理的tpc相比,与安慰剂预处理的tpc相比,HK2抑制剂预处理显著减少了卡巴胆碱诱导的tpc细胞收缩(补充图)。6C)。这些结果表明,TPC中HK2的高表达是其细胞收缩功能和血管支持功能缺陷的原因之一,这是由糖酵解所决定的。

图5:HK2的表达通过ROCK2-MLC2介导的收缩调节周细胞的血管支持功能。

a管形成试验HUVEC与CFSE标记的TPC混合培养,分别用安慰剂或HK2抑制剂(3-溴比丙酮酸,3-BP)治疗.每组24 h共培养后,给出具有代表性的免疫荧光/亮场融合图像。bd条形图显示每一组的相对总管长、分支点和数目(n=3项独立实验)。统计检验是双面的。e免疫CD 34、PDGFRβ或Ⅳ型胶原抗体免疫组化染色后基质栓系列切片的代表图像。fi基质塞塞试验显示,与安慰剂组相比,HK2抑制剂能明显增强TPC联合移植HUVEC血管的管腔直径和IV型胶原染色。小提琴图显示各组血管的相对数目、管腔直径、Ⅳ型胶原水平和覆盖率(n=每组3只)。jNSCLC/HCC-NPC和-TPC中ROCK 2和p-MLC 2表达的Westernblotting分析(n=3项独立实验)。k应用HK2抑制剂3-bp可降低非小细胞肺癌/肝癌组织中ROCK 2和p-MLC 2的表达(n=3项独立实验)。lo0.4μM岩抑制物(GSK 429286A)或安慰剂与CFSE标记的非小细胞肺癌/肝癌源性TPC共培养HUVEC的成管实验。条形图显示每一组的相对总管长、分支点和数目(n=3项独立实验)。统计检验是双面的。pA 549或HepG 2细胞条件培养液(CM)处理NSCLC/HCC鼻咽癌HK2、ROCK 2和p-MLC 2表达的Westernblotting分析(n=3项独立实验)。qtA 549或HepG 2细胞条件培养液(CM)与未处理CFSE标记的NSCLC/HCC源性NPC或NPC共培养HUVEC的管状形成实验。条形图显示每一组的相对总管长、分支点和数目(n=3项独立实验)。统计检验是双面的。结果为±SEM。bd, mo, rt学生的t测试一下。fi单向变异。标尺a, l, q表示200μm,e50μm.

与这些发现相一致的是,含有蛋白激酶(ROCK)信号通路的Rho相关线圈参与了周细胞形态和收缩性的调控。22,23,而这些过程需要的能源供应主要来自糖酵解。24。非肌肉肌球蛋白II是由两条重链和两条调节轻链组成的肌动蛋白结合蛋白,对细胞的收缩有重要作用。25。有趣的是,岩石可以直接磷酸化MLC 2,提高细胞收缩时肌球蛋白Ⅱ的活性。26。Westernblot分析表明,TPC中ROCK 2的表达和ROCK 2下游效应因子MLC 2(Myosin-light Chain 2)的磷酸化水平明显高于NPC(图1)。5J)。重要的是,使用HK2抑制剂可明显下调TPC中ROCK 2和p-MLC 2的表达(图1)。5K)。为了确定ROCK 2在调节TPC的BV支持功能中的作用,将HUVEC与NSCLC/HCC衍生的TPC联合培养,在基质中用安慰剂或岩石抑制剂GSK 429286 A进行体外成管实验,表明岩石抑制剂预处理可显著提高总管长、分支点和管数(如图1所示)。5L-o)。此外,岩石抑制剂预处理也禁止卡巴胆碱诱导的细胞收缩在tpc(补充图)。6C)。Westernblot分析表明,与安慰剂处理的TPC相比,岩石抑制剂对TPC中MLC 2的磷酸化有明显的抑制作用。6d)。临床上,ROCK 2在非小细胞肺癌/肝癌组织中的周细胞表达较正常癌旁组织明显上调(补充图)。6EROCK 2与癌周标记物的高表达分别与非小细胞肺癌和肝癌患者的生存不良有关(补充图)。6f,g).

由于人类岩石由两种异构体组成,即ROCK 1和ROCK 2。26我们进一步研究HK2是否通过ROCK 1或ROCK 2调节TPC的血管支持作用。首次稳定敲除HK2、ROCK 1或ROCK 2在NSCLC/HCC源性TPC中的表达,并在HK2缺失的TPC中高表达ROCK 2,RT-PCR和Western blot分析证实了这一点(补充图)。6h-k)。有趣的是,在NSCLC/HCC衍生的TPC中,HK2下调的ROCK 2,而不是ROCK 1的表达减少(补充图)。六小时)。进一步的管状形成实验表明,shRNA/岩石抑制剂HA-1077(即一种更强的ROCK 2抑制剂)稳定地击穿了周细胞-HK2的表达或减弱了周细胞-roCK 2的表达。27)与TPC共培养的HUVEC相比,转染TPC的HUVEC总管长、分支点和管数增加,而ROCK 1沉默对成管率无显著影响(补充图)。6L-s)。此外,在HK2缺失的TPC中,ROCK 2的过表达降低了与HK2缺失TPC共培养的HUVEC的总管长、分支点和观察到的数量(补充图)。6L-s)。以上结果表明,ROCK 2,而不是ROCK 1是HK2介导的周细胞血管支持功能的下游效应。

越来越多的证据表明肿瘤细胞可以分泌旁分泌因子来影响其周围基质细胞的代谢。28。为了确定鼻咽癌和TPC之间代谢状态的差异是否是由肿瘤细胞驱动的,我们将NPC置于NSCLC细胞株A 549或肝癌细胞株HepG 2的条件培养基中,然后用它们进行Westernblotting、葡萄糖摄取、乳酸浓度和管状形成的检测。值得注意的是,来自癌细胞的条件培养液(CM)对NSCLC/HCC来源的NPC的葡萄糖摄取没有影响(补充图)。6T与未处理的NPC相比,它增加了鼻咽癌组织中HK2、ROCK 2和p-MLC 2的表达,增加了乳酸的产生(图1)。五便士和补充图。6U)。当这些CM处理细胞与HUVEC共培养时,与未处理的NPC联合培养相比,其总管长、分支点和数量均明显减少(如图所示)。5q-t).

最近的研究表明,肿瘤源性透明质酸(HA)片段上调了糖酵解基因(包括HK2)的表达,从而调节单核细胞的促肿瘤功能,通过HA拮抗剂(pep-1)可以挽救这种功能。29。有趣的是,我们的流式细胞仪分析表明,NSCLC/HCC来源的NPC在其细胞表面表达HA受体CD 44(补充图)。6V)。接下来,我们在HA拮抗剂(Pep-1)或对照肽(CPEP)存在下,用A 549/HepG 2细胞条件培养液暴露NSCLC/HCC源性NPC,观察肿瘤细胞HA片段在调控周细胞代谢中的作用。结果表明,HA拮抗剂(Pep-1)阻断HA片段对鼻咽癌细胞株A 549/HepG 2细胞条件培养液中HK2和ROCK 2的上调有抑制作用,但对ROCK 1表达无明显影响(补充图)。6W)。为了确定ROCK 2作为HK2介导的糖酵解在TPC中的下游靶点,我们对NSCLC/HCC衍生的TPC进行了预处理,然后用岩石抑制剂进行乳酸浓度测定和海马测定。与安慰剂组相比,抑制ROCK对TPC中乳酸浓度、ECAR和OCR无明显影响(补充图)。7A-E岩石抑制剂处理对TPC中HK2的表达无影响(补充图)。7F,g)。总之,这些数据提示肿瘤旁分泌信号通过上调ROCK2-MLC2介导的收缩作用而诱导周细胞-HK2驱动的糖酵解失调周细胞的血管支持作用。

应用HK2抑制剂可增强血管功能、阿霉素输注和抗肿瘤作用,同时在不影响血管数量和覆盖范围的情况下减少缺氧。

先前来自其他实验室和我们自己的研究表明,肿瘤血管功能的改善可以增强化疗的传递,并对肿瘤的生长和进展起作用。16,30。然而,这些工作主要集中在靶向内皮细胞,而不是周细胞。我们接下来测试联合应用HK2抑制剂和化疗药物阿霉素是否能增强其对肺和肝脏肿瘤生长的作用。结果表明,与安慰剂组、阿霉素组相比,联合应用HK2抑制剂和阿霉素可显著抑制皮下肺(LLC,A 549)或肝细胞(即小鼠肝癌细胞系HEPA1-6)的生长(图一)。6A-d和补充图。8A-h)。值得注意的是,与安慰剂组相比,单独使用HK2抑制剂或阿霉素治疗对肿瘤生长的影响有限。6A-d和补充图。8A-h)。肺肿瘤血管分析显示,任何治疗方法,包括3-BP,与其他治疗组相比,对总血管数和周细胞覆盖率均无显著影响(图二)。6e-g和补充图。8I-k可明显增强肿瘤血管直径、基底膜胶原Ⅳ染色和血管灌注。6h-j和补充图。8L,m)。此外,静脉注射Hoechst染料的小鼠在单独使用HK2抑制剂和与安慰剂或单一阿霉素治疗的小鼠相比,瘤内Hoechst染色水平相对于血管数目显著增加(如图1所示)。6K)。LLC/A 549荷瘤小鼠在治疗过程中体重无显着性差异(附图)。8N,o)。重要的是,共免疫染色证实LLC肿瘤周细胞表达HK2(补充图).8PLLC/A 549肿瘤经HK2抑制剂治疗后,周细胞-p-MLC 2的表达明显低于安慰剂(补充图)。8Q)。这些结果表明,HK2抑制剂在体内具有明显的促血管功能作用,与阿霉素疗效的改善相一致。

图6:应用HK2抑制剂重建肿瘤血管,以增强血流、肿瘤灌注、阿霉素的传递以及对肿瘤生长的影响。

aC57/BL6小鼠皮下注射1×106LLC细胞用安慰剂、3-溴比妥酸(3-BP)、阿霉素(DOX)、3-BP和DOX联合治疗。n=每组5只)。给出各治疗组肿瘤的有代表性的大体图像。b肿瘤生长曲线显示,与安慰剂组、阿霉素组和3-BP组相比,3-BP和阿霉素共同作用可抑制LLC肿瘤的生长。c, dBART图显示各组肿瘤重量和体积。ei应用CD 34(绿色)和α-SMA/Ⅳ型胶原(红色)对LLC皮下肿瘤的中线进行双重免疫染色,进行血管定量、周细胞覆盖率、血管直径和Ⅳ型胶原强度分析。jLLC荷瘤小鼠静脉注射FITC-PECAM抗体(绿色)检测血管灌注情况。k条形图显示各治疗组血管周围肿瘤细胞与FITC-PECAM细胞摄取Hoechst染料的相对面积。lnFITC-PECAM抗体灌注LLC肿瘤的体外双光子显微成像。条形图显示各组血管直径和阿霉素的定量。统计检验是双面的。op多普勒超声检测活体小鼠皮下LLC肿瘤的相对血流(峰值增强,PE)和肿瘤灌注指数(Wash-in灌注指数,Wipi)。有代表性的超声图像。条形图,包括肿瘤核心在内的整个肿瘤的定量。结果为±SEM。b双向变异。c, d, fk, p单向变异。m, n学生的t测试一下。标尺a, o代表1厘米,e, j, k, l50μm,i,20μm.

自从以前的研究显示血管灌注/扩张与化疗药物的传递之间有很强的相关性。30,31接下来,我们试图检查血管灌注和扩张的增加是否足以改善阿霉素在我们的动物模型中的传递。体外双光子显像显示,与单纯阿霉素治疗组相比,治疗组LLC肿瘤血管灌注、血管直径、阿霉素输注量均增加。6L-n和补充电影1, 2),暗示HK2抑制剂可诱导MLC 2介导的肿瘤血管重构。进一步的共聚焦显微镜分析证实,与单用阿霉素相比,HK2抑制剂和阿霉素处理的小鼠瘤内阿霉素水平明显升高(补充图)。8R)。重要的是,对微泡灌注的多普勒超声分析显示,与安慰剂或阿霉素单独治疗组相比,HK2抑制剂可增强LLC肿瘤的血流和灌注(如图1所示)。6o,p)。值得注意的是,这些动态流量和灌注读数的增加是观察到整个肿瘤,包括肿瘤核心(图一)。6o,p)。肿瘤缺氧与癌症患者预后不良有关。30我们随后检测了缺氧指标葡萄糖转运蛋白(Glut 1)在所有治疗组中的表达,提示HK2抑制剂或HK2抑制剂与阿霉素联合治疗可显著减少肿瘤缺氧(补充图)。8S),提示血管功能的改善可减轻HK2抑制剂治疗小鼠的肿瘤缺氧。为进一步研究HK2抑制剂和阿霉素对体内肿瘤生长的协同抑制作用是否是由于直接抑制肿瘤细胞或通过调节TPC功能所致,我们用安慰剂、3-BP、阿霉素或3-BP联合体外处理LLC细胞,表明3-BP与阿霉素合用对LLC肿瘤细胞体外生长无协同抑制作用(补充图)。8t)。为了确定3-bp或/和阿霉素是否能影响肿瘤细胞介导的周细胞糖酵解改变,我们观察了3-BP或/和阿霉素预处理后的癌细胞条件培养液对周细胞-HK2和ROCK 2表达的影响。RT-PCR和westernblot分析表明,3-bp或/和DOX预处理的肿瘤细胞条件培养液仍能上调NSCLC/HCC鼻咽癌组织中HK2和ROCK 2的表达(补充图)。9A-E)。这些结果表明,3-BP和阿霉素对体内肿瘤生长的协同抑制作用是通过调节TPC的血管支持功能来实现的。

为证实周细胞-HK2对肿瘤血管的调节作用及后续给药,我们将A 549/MHCC-LM9细胞(即人肝癌细胞株)与稳定的HK2缺失的TPC、稳定的ROCK 2过表达或以10:1比例转染的TPC混合注入裸鼠体内,然后用安慰剂或阿霉素治疗荷瘤小鼠。特别是与A 549/MHCC-LM9细胞和HK2缺失细胞共注射A 549/MHCC-LM9细胞和转染TPC(补充图)的小鼠相比,阿霉素对小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用。10A-h当A 549/MHCC-LM9细胞与ROCK 2高表达HK2缺失周细胞共注射时,A 549/MHCC-LM9细胞和HK2耗竭细胞共注射可降低阿霉素对小鼠肿瘤生长的增强作用(补充图)。10A-h)。各组间血管总数、周细胞覆盖率无显着性差异(补充图)。10i-k)。有趣的是,A 549细胞和HK2缺失TPC共注射小鼠的肿瘤血管直径、基底膜Ⅳ型胶原染色、血管灌注和肿瘤内Hoechst均较A 549细胞共注射和转染TPC的小鼠增加,而与A 549细胞和ROCK 2高表达的HK2过度表达的小鼠相比,观察到的血管功能降低(补充图)。10L-o)。此外,与A 549细胞和HK2缺失TPC共注射的小鼠肿瘤相比,A 549细胞和HK2缺失的TPC共注射后,周细胞-p-MLC 2的表达降低,而在A 549细胞与高表达HK2缺失TPC的肿瘤中,其表达增加(补充图)。10便士)。重要的是,体外双光子显像显示,A 549细胞和HK2缺失TPC共注射小鼠的肿瘤血管灌注、血管直径和阿霉素输注量均较A 549细胞共注射和转染TPC小鼠增加,而A549细胞和ROCK 2高表达缺失TPC小鼠的血管灌注、血管直径和阿霉素释放量明显减少(补充图)。10Q和补充电影35)。多普勒超声微泡灌注分析显示,与对照组相比,TPC中HK2的耗竭增加了A 549肿瘤的血流量和灌注量(补充图)。10R而ROCK 2在HK2缺乏的TPC中的过表达则降低了肿瘤的血流量和灌注(补充图)。10R)。这些结果表明,周细胞-HK2驱动的ROCK2-MLC 2介导的收缩性在肿瘤血管重构和药物传递中起着重要作用。

总之,我们的研究结果表明,使用HK2抑制剂或用shRNA耗尽周细胞-HK2可以增加血流和灌注,增加肿瘤内药物的释放和抑制肿瘤的生长,同时减少肿瘤缺氧而不影响血管密度和周细胞覆盖率(见图)。7)。这些结果表明,靶向癌周细胞-HK2的表达/活性是一种有效的治疗癌症的策略。

图7:示意图表示周细胞-HK2驱动的糖酵解通过ROCK2-MLC2介导的收缩调节肿瘤血管异常的作用。

TPC上调HK2驱动的糖酵解,诱导ROCK2-MLC2介导的收缩,反过来对其血管支持作用产生负向调节。在不影响血管密度和周细胞覆盖率的前提下,应用HK2抑制剂3-BP诱导肿瘤血管重塑,增加血流、肿瘤灌注、血管直径、化疗药物输注量和抗肿瘤生长效果。

讨论

我们的方法成功地从非小细胞肺癌或肝癌患者的正常邻近组织和肿瘤中纯化了一群周细胞。与NPC相比,TPC中HK2驱动的糖酵解水平升高,其血管支持功能异常是通过激活ROCK2-MLC2介导的收缩功能而实现的。ShRNA或抑制剂对HK2/ROCK 2的耗竭降低了TPC的收缩力,使其重建血管,而联合应用HK2/ROCK 2和阿霉素则增强了化疗药物对肺癌和肝癌动物模型肿瘤生长的抑制作用。这是一个意想不到的结果,需要重新考虑我们目前针对周细胞的癌症治疗策略。

周细胞,又称收缩细胞,主要通过其收缩特性,在调节血管生成、血管直径、血流、血管灌注和完整性等方面发挥重要作用。1,7,10,32。血管壁周细胞-内皮细胞的相互作用是调节血管形成、收缩、舒张和稳定的基本过程。9,14,而两种细胞间相互作用的缺陷导致了人类的病理状况,包括痴呆综合征和肿瘤血管生成。1,12。事实上,基因敲除pdgfb或pdfrβ都会导致血管功能障碍和围产期死亡。5。由于缺乏有效的人周细胞分离方案,大多数体外周细胞研究都是通过牛/鼠视网膜周细胞或小鼠脑周细胞进行的。4,18,33。虽然周细胞有可能分化成其他类型的细胞34在以往的研究中,视网膜周细胞既未被fcs分离,也未完全以周细胞标记的表达为特征,或在附加周细胞生长因子的培养基中培养。32,35。此外,对于周细胞在体内的间充质干细胞特性仍有争议。36。与这些研究相反,我们发展了一种从游离组织中富集血管细胞的MACS方法,然后将这些细胞进行流式细胞术(FACS)以纯化周细胞,然后将这些细胞培养在市面上供人周细胞使用的培养基中。通过一系列定性实验,证实了NSCLC和HCC分离细胞的周细胞同源性,而NPC与TPC的基本功能无明显差异。此外,我们的培养方法可以在传代过程中保持分离细胞的周细胞同一性。

接下来,我们试图探索它们在体外和体内调节血管的作用。以前,Mcllroy等人。37结果表明,与无血清或内皮细胞条件培养液相比,用牛视网膜周细胞条件培养液照射永生化HUVEC可抑制其迁移,同时抑制HUVEC的成管能力。另一方面,Kumar等人。38发现间充质成血管细胞衍生周细胞在体外和体内均能促进血管的形成和稳定性。这些研究之间的差异可能是由于在管状形成试验中使用的周细胞来源/种类不同所致。然而,我们的数据表明,与NPC相比,TPC对总管长、分支点和数量有更强的抑制作用,而与TPC联合移植的HUVEC在体内形成了较小且不规则的血管,基底膜结构较差。此外,我们的细胞收缩试验表明,与NPC、成纤维细胞或HUVEC相比,NSCLC/HCC衍生的TPC具有更强的卡巴胆碱诱导的细胞收缩。总之,我们的研究表明,与NPC相比,TPC具有缺陷的血管支持功能。

虽然在内皮细胞中,特定代谢方案对细胞状态/功能的调节作用已经得到了广泛的研究,但代谢状态在周细胞功能调控中的作用尚不清楚。转录谱分析显示,与NPC相比,NSCLC/HCC源性TPC中糖酵解基因己糖激酶2的表达持续增加。由于HK2在葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的糖酵解途径的第一步中起着关键作用。39结果表明,与NPC相比,TPC中乳酸的生成增加,海马的ECAR升高,OCR降低。重要的是,代谢通量分析表明,与NPC相比,TPC中乳酸的相对丰度有所增加,而TCA循环代谢产物的相对丰度却没有增加。这些结果得到临床观察的支持,即肿瘤组织中HK2的周细胞表达上调,而周细胞-HK2阳性血管的比例较高的NSCLC和HCC患者的整体存活率较低。接下来我们将探讨周细胞-HK2在调节其血管支持功能中的作用。我们的结果表明,与安慰剂预处理的TPC联合培养的HUVEC相比,HK2抑制剂预处理后HUVEC的总管长、分支点和管状细胞数均增加,而在体内与HK2抑制剂共移植TPC能增强血管直径和IV型胶原的表达。此外,与安慰剂预处理的tpc相比,HK2抑制剂预处理减少了卡巴胆碱诱导的tpc细胞收缩.与安慰剂组相比,HK2抑制剂对HUVEC自身的成管能力及皮下LLC和A 549肿瘤的血管数目均无明显影响,提示其在周细胞血管支持功能中具有特殊作用。此外,我们的结果突出了周细胞收缩在调节血管功能方面的潜在作用。事实上,以往的研究表明,RhoA-Rock(rho相关蛋白激酶)信号通路在调节视网膜周细胞收缩性方面具有重要作用。22,23,Kutcher等人。表明周细胞收缩性决定内皮细胞周期的进展和萌发。22。他等人。40已经报道了以α-sma为目标+周细胞收缩力可使自发性胰腺癌小鼠模型的肿瘤血管恢复正常。在本研究中,我们观察到ROCK 2在TPC中的表达及其下游效应MLC 2磷酸化水平与NPC相比有上调作用。HK2抑制剂可降低TPC中ROCK 2和p-MLC 2的表达。此外,与安慰剂预处理的tpc相比,岩石抑制剂预处理还减少了碳水乙醇诱导的tpc细胞收缩。与转染置管的HUVEC相比,耗尽HK2或ROCK 2,而不消耗ROCK 1,可增加与TPC共培养的HUVEC的总管长、分支点和管段数,而ROCK 2在HK2缺失的TPC中的过表达则降低了观察到的增强效果。这些结果提示,周细胞-HK2驱动的糖酵解通过激活ROCK2-MLC2介导的收缩功能而导致血管功能障碍。

接下来,我们试图探讨HK2在TPC中表达的分子调控。由于以前的工作表明癌细胞可以通过旁分泌信号来影响周围基质细胞的代谢。28因此,我们用癌细胞的条件培养基照射鼻咽癌,表明与未处理的鼻咽癌相比,用癌细胞条件培养基处理的NPC表达上调了HK2和ROCK 2的表达。事实上,最近的研究表明,肿瘤源性HA片段可以激活单核细胞中包括HK2在内的糖酵解基因的表达。29。由于NSCLC/HCC来源的NPC在本研究中表达HA受体CD 44,因此我们研究了其在周细胞代谢重新编程中的作用,表明阻断HA片段可阻止鼻咽癌细胞在癌细胞条件培养液中上调HK2和ROCK 2的表达。总之,我们的结果表明,肿瘤旁分泌信号通过上调ROCK 2介导的途径,上调周细胞-HK2驱动的糖酵解,调节其血管支持作用。

癌细胞依靠糖酵解来满足能量需求,这就是所谓的沃堡效应。由于HK2是糖酵解的关键介质,其抑制剂3-溴比妥酸已作为单一的抗肿瘤药物被广泛地用于治疗临床前肿瘤模型。41,42。不幸的是,到目前为止,它已经为不同类型的癌症提供了适度的治疗效果。43。结果表明,单独应用HK2抑制剂3-溴丙酮酸对皮下肺或肝肿瘤的生长影响不大,而联合应用HK2抑制剂和阿霉素可明显抑制肿瘤的生长,诱导MLC 2驱动的血管重构,同时减少肿瘤缺氧,而不影响肿瘤血管密度和周细胞覆盖率。通过体外双光子显微镜和多普勒超声成像,证实了3-BP可诱导肿瘤血管重塑,增强血流、灌注和化疗。有趣的是,3-BP和阿霉素对LLC细胞体外生长无协同抑制作用,3-BP或/及阿霉素预处理的鼻咽癌细胞与未处理的NPC相比,仍能上调HK2和ROCK 2的表达。同时,化疗的效果已经被证明与肿瘤血管灌注和直径有关。31提示3-BP抑制剂与阿霉素对体内肿瘤生长的协同抑制作用依赖于调节周细胞的BV支持作用,而不是通过抑制肿瘤细胞。此外,联合注射实验进一步说明了周细胞-HK2在调节MLC-2驱动的肿瘤血管重构和药物传递中的作用,结果表明,周细胞-HK2表达的减少也增加了血管灌注和管腔直径,从而增加了化疗药物的释放和对肿瘤生长的效果,而在HK2耗尽的TPC中,ROCK 2的过表达降低了与HK2耗尽的TPC和癌细胞共注射的增强血管功能和药物释放以及对肿瘤生长的效果。此外,三重免疫染色实验表明,A 549和HK2缺失TPC共注射小鼠后,周细胞p-MLC 2的表达较A 549共注射转染TPC的A 549降低,而在A 549细胞与高表达HK2缺失TPC的肿瘤细胞共注射诱导的肿瘤中表达增强。这些结果表明,靶向周细胞-HK2-ROCK2-MLC 2介导的收缩功能改善了血管功能和药物的释放,并对肺癌和肝癌的生长有一定的抑制作用。

总之,我们的工作建立了一个研究人类周细胞生物学的细胞模型,表明周细胞-HK2驱动的糖酵解通过激活ROCK2-MLC2介导的收缩作用而诱导肿瘤血管异常。重要的是,我们的数据表明,使用有别于抗血管生成或靶向周细胞覆盖的策略,通过调节周细胞的代谢状态来重建肿瘤血管,以提高肿瘤治疗中的化疗疗效。


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