Fbxl 2以不依赖EGF的方式与多聚泛素和蛋白酶体介导的EGFR结合并促进其降解。 EGFR蛋白在EGF刺激下可通过c-cbl介导的溶酶体途径迅速失稳。 7 ,8 。由于EGFR蛋白水平在肿瘤发生中至关重要，我们认为EGFR蛋白的稳定性应该在多个水平上受到严格控制。因此，我们研究了蛋白酶体介导的EGFR蛋白降解对EGF诱导或不诱导的影响.如附图所示。 1A ，EGF诱导的EGFR降解被蛋白酶体抑制剂(MG 132)或溶酶体抑制剂(氯喹，clq)在nSCLC H 1299(野生型EGFR)或h 1975(EGFR)中阻断。 L858R/T790M )细胞。相反，在没有EGF诱导的情况下，EGFR蛋白的降解主要是通过蛋白酶体途径进行的，说明蛋白酶体介导的降解在调节EGFR蛋白稳定性中起着至关重要的作用。因此，我们的目的是利用一个针对E3泛素连接酶的慢病毒shRNA文库，筛选针对EGFR的E3泛素连接酶。
在筛选出的22个F-box蛋白家族候选基因中，Fbxl 2基因明显沉默，野生型EGFR、EGFR 19 del或EGFR的蛋白表达上调。 L858R/T790M 在H 1299，PC-9或H 1975细胞，分别(补充图.) 1B，c 还有无花果。 1A )。TRAF 3，已知的Fbxl 2底物 26 ，进行并行分析。相反，Fbxl 2的异位表达导致EGFR蛋白表达下调(附图)。 1D )。相比之下，包括Fbxl 2在内的E3泛素连接酶活性中Fbxl 2突变体的表达有缺陷。 ΔF (删除F-box结构域)或Fbxl 2 4A (F盒结构域的四点突变) 27 ，没有这样做(附图)。 3E 和补充图。 4B )。提示Fbxl 2可抑制EGFR的表达，EGFR的表达依赖于其E3泛素连接酶的活性。
图1：Fbxl 2以不依赖EGF的方式作用于多聚泛素和蛋白酶体介导的降解。 a 对稳定表达不同shRNAs的H 1299、PC-9或H 1975细胞进行Westernblot分析，结果表明，H 1299、PC-9和H 1975细胞对Fbxl 2(shFBXL2-#1或shFBXL2-#2)或GFP(ShCtrl)均有不同表达。 b PC-9细胞在无血清培养基中稳定表达HA-Fbxl 2，培养12h，加入或不加100 ng/mL EGF作用10 min。细胞裂解物进行westernblot分析。 c , d H1975细胞在无血清(10%)或血清存在下稳定表达Ha-Fbxl 2，在50μg/mL环己酰亚胺(CHX)作用下培养12h。细胞裂解物进行westernblot分析。进行了三个独立的实验。量化EGFR蛋白水平，并以均值±SD表示蛋白质半衰期图。 e 将稳定表达HA-Fbxl 2的H 292或H 1975细胞用MG 132处理6h后，进行Westernblot分析。 f 将Fbxl 2与EGFR表达质粒共转染HEK 293 T细胞。隔夜培养细胞，用20 MMG 132处理4h，免疫沉淀(IP)-Western分析。 g 将稳定表达FLAG-EGFR的H 1299细胞用MG 132处理4h，收获后进行IP-Western分析。 h 用MG 132处理H 1975细胞4h，用特异性抗体Fbxl 2或正常兔IgG免疫沉淀内源性Fbxl 2蛋白，然后免疫印迹。 i 将稳定表达HA-Fbxl 2的H 1299细胞用MG 132处理4h，收获后进行IP-Western分析。 j 用指示表达质粒转染HEK 293 T细胞。隔夜培养细胞，用MG 132处理4h，然后进行IP-Western分析. k HEK 293 T细胞共转染Fd-EGFR、Fbxl 2和HA-泛素野生型(Lys 48)或只表达Lys 63的质粒。隔夜培养细胞，用MG 132处理4h，然后进行IP-Western分析. l 体外泛素化反应混合物采用免疫印迹法，免疫印迹法检测血清和HA抗体。实验被独立地重复了三次，得到了相似的结果。 a , b , e –l )。源数据作为源数据文件提供。
然后我们研究了表皮生长因子(EGF)在Fbxl 2介导的EGFR降解中是否需要刺激。如图所示。 1B Fbxl 2在PC-9细胞中，在EGF存在或不存在的情况下，均能有效降解EGFR。在H 1299和H 1975细胞中也观察到类似的作用(附图)。 1E )。此外，fbxl 2显著缩短了EGFR的半衰期。 L858R/T790M 蛋白质，不管是否有血清(如图所示)。 1C，d )。因此，Fbxl 2介导的EGFR蛋白降解与EGF刺激无关。
接下来我们研究Fbxl 2是否是EGFR的真正E3泛素连接酶。如图所示。 1 E和补充图1F，g，Fbxl 2介导的EGFR蛋白水平的降低被蛋白酶体抑制剂MG 132有效地逆转，而不被溶酶体抑制剂氯喹所逆转。此外，fbxl 2与野生型EGFR、EGFR相互作用。 L 858R ，或EGFR T790M 蛋白质和Fbxl 2与EGFR、Skp 1和Cullin 1形成稳定的复合物(图1)。 1F−I )，建议SCF Fbxl 2 复合物是EGFR蛋白降解的主要原因。此外，Fbxl 2的沉默导致EGFR蛋白的多聚泛素链减少，而Fbxl 2的异位表达促进了Lys 48-连锁，而不是Lys 63连接的EGFR蛋白多聚泛素链(图1)。 1J，k )。免疫修饰Fbxl 2，而不免疫Fbxl 2 ΔF ，促进EGFR的体外泛素化。 1L )。因此，Fbxl 2结合并促进EGFR的多聚泛素，导致蛋白酶体介导的EGFR降解。
Fbxl 2在膜上靶向，并与EGFR激酶结构域结合，促进EGFR蛋白降解。 接下来，我们将Fbxl 2结合域映射到EGFR上。如图所示。 2A，b ，Fbxl 2(AA 269-401)的9−13亮氨酸丰富重复序列(LRR)与EGFR结合.此外，EGFR的激酶结构域(AA 688-957)是必需的，足以与Fbxl 2相互作用。 2C，d )。重要的是，纯化的Fbxl2-Skp 1蛋白复合物能够在体外直接结合EGFR的激酶结构域，生物层干涉法证明了这一点。 2E 和补充图。 2A
图2：Fbxl 2与EGFR的激酶结构域相互作用，其膜靶向功能对EGFR蛋白的失稳至关重要。 a 本研究中使用的Fbxl 2缺失突变体的示意图表示。 b HEK 293 T细胞共转染Flat-EGFR和HA-Fbxl 2表达质粒。培养一夜后，用MG 132处理细胞4h，收获后进行IP-Western分析。 c 本研究构建了EGFR缺失突变体的示意图表达。 d HEK 293 T细胞共转染Fbxl 2和指示的表达Fbxl 2的Fbxl 2质粒。培养一夜后，用MG 132处理细胞4h，收获后进行IP-Western分析。 e 用生物层干涉法(BLI)检测重组Fbxl 2/Skp 1蛋白与EGFR激酶部分的结合亲和力。这个 K D 所显示的值。 f 用HA-Fbxl 2共转染HEK293T细胞，并检测其表达质粒。隔夜培养细胞，用MG 132处理4h，然后进行IP-Western分析. g , h HEK293T细胞共转染野生型标志-EGFR或标志-EGFR E931A 在HA-Fbxl 2或载体对照的作用下36h，用50g/mL的环己酮(CHX)处理细胞，每隔一段时间。细胞裂解物进行westernblot分析。对EGFR蛋白水平进行量化，并给出一份代表蛋白质半衰期的图表. i 稳定表达HA-Fbxl 2或Ha-Fbxl 2的H 292或H 1975细胞 C420S 进行Westernblot分析。 j 稳定表达HA-Fbxl 2，HA-Fbxl 2的H 1299或H 1975细胞 C420S 在收获前用MG 132处理4h，进行IP-Western分析。 k 稳定表达HA-Fbxl 2或Ha-Fbxl 2的H 1299或H 1975细胞 C420S 采用细胞质(Cyto)和质膜(PM)分馏，Westernblot分析。 l 稳定表达Fg-Fbxl 2或Fbxl2的H 1299细胞 C420S MG 132在免疫组化染色前用MG 132处理6h，免疫组化染色标记红旗(Red)和内源性EGFR(Green)，DAPI染色。标度棒=25m，实验分别重复三次，结果相似。 b , d , f , g ，和 i −l )。源数据作为源数据文件提供。
然后我们解剖了EGFR激酶结构域中潜在的Fbxl 2结合位点。我们采用ZDOCK 3.0.2( Https://zdock.umassmed.edu/ )，一种常用的蛋白质−相互作用预测工具。如附图所示。 2B EGFR激酶结构域上存在7个潜在的氨基酸残基(Ser720、Lys 806、Asp807、Lys 875、Ser921、Glu922和Glu931)，它们可能通过氢键与Fbxl 2相互作用。然后我们检测了EGFR突变蛋白在这七个残基上的Fbxl 2结合能力。有趣的是，除了EGFR E931A 这不能结合Fbxl 2，其他与Fbxl 2结合的突变蛋白类似于野生型EGFR(补充图)。 2C )。值得注意的是，据报道EGFR E931G 在体外对包括erlotinib在内的EGFR-TKI耐药 29 。经检测，EGFR E931G 也无法绑定Fbxl 2(图2)。 2F )。事实上，fbxl 2与野生型egr形成鲜明对比，对egr的表达和稳定性几乎没有影响。 E931A 或EGFR E931G 蛋白质(附图) 二维空间 还有无花果。 2G，h )。这些结果表明，EGFR激酶结构域的Glu931与Fbxl 2的相互作用是不可缺少的。
据记载，Fbxl 2可以通过C-端CAAX基序中的geranyl-geranylated cys 420靶向到膜上。 27 ,28 。然后我们询问Fbxl 2的膜靶向是否是其对EGFR表达影响的先决条件。如图所示。 2i，j ，与野生型fbxl 2、fbxl 2不同。 C420S ，一种在靶向膜方面存在缺陷的突变蛋白 27 ，不能结合和抑制EGFR蛋白在各种非小细胞肺癌细胞中的表达。此外，细胞分馏实验表明，质膜相关的fbxl 2，而不是胞浆fbxl 2。 C420S ，诱导细胞膜相关EGFR降解。 2K )。此外，免疫荧光和流式细胞仪分析表明，Fbxl 2与EGFR共定位，EGFR在质膜上的表达降低。 2L 和补充图。 2E )。有趣的是，EGFR和fbxl 2也共同定位于内质网(Erf)，这一点通过对ER跟踪器或葡萄糖调节蛋白78(Grp 78)的染色进一步证实，这是一个常用的err标记。 30 (无花果) 2L 和补充图。 2F )。与此一致的是，Fbxl 2，而不是Fbxl 2。 C420S ，显著降低血浆膜相关EGFR和ER相关EGFR(补充图)。 2G，h )。因此，Fbxl 2的膜靶向功能对EGFR蛋白在质膜和ER上的不稳定性是必不可少的。
Fbxl 2抑制EGFR过表达或EGFR L858R/T790M -促进非小细胞肺癌的生长，并与EGFR在非小细胞肺癌中的表达呈负相关。 我们的结果促使我们验证Fbxl 2和EGFR在NSCLC中的临床相关性。如图所示。 3A 对TCGA数据库的分析表明，Fbxl 2在NSCLC中的表达明显降低，即使在含有EGFR基因突变的癌组织中也是如此。此外，组织微阵列(TMA)分析显示，66.67%(50/75)的人肺鳞状细胞癌(LUSC)组织中Fbxl 2的表达水平低于癌旁组织(图1)。 3B )。同样，fbxl 2在rosa26-lsl-EGFR肺癌组织中的表达也降低了。 L858R/T790M 老鼠( n =8，附图。 3A )。我们进一步研究了Fbxl 2在人肺腺癌(LUAD)不同阶段的表达情况。如图所示。 3C TMA分析表明，Fbxl 2在肺腺癌发展过程中逐渐减少。此外，Fbxl 2与EGFR蛋白在肺腺癌和肺鳞状细胞癌中的表达呈负相关。 3D，e 和补充图。 3B )。在本研究中，Fbxl 2的低表达与EGFR的高表达呈负相关(补充图)。 3C )。此外，对Kaplan−Meier生存数据集的分析表明，Fbxl 2的低表达与总体生存率(OS)差有关。 3F
图3：fbxl 2抑制EGFR过表达或EGFR L858R/T790M -驱动的NSCLC生长与Fbxl 2和EGFR的表达呈负相关。 a 非小细胞肺癌组织中Fbxl 2 mRNA的表达 n =1022)或具有EGFR突变的非小细胞肺癌( n =225)和正常肺组织( n 用TCGA数据库(LUAD和LUSC)进行分析。 b 来自LUSC的组织微阵列幻灯片( n 对75对肿瘤及癌旁标本进行IHC分析。显示IHC染色的典型图像。 c 由LUAD衍生的组织微阵列幻灯片( n 进行IHC分析。显示IHC染色的典型图像。AOD染色。 d , e 采用IHC法检测LUSC组织中EGFR和Fbxl 2的表达，并进行Pearson相关分析。AOD染色。 f 根据患者肿瘤标本中Fbxl2mRNA水平，将肺癌患者总体生存(OS)的Kaplan、−、Meier图进行分层。H 292细胞对Fbxl 2稳定表达shRNAs的作用 g Westernblot分析， h MTS检测，或 i 菌落形成试验。进行了三个独立的实验。H 292稳定细胞 j Westernblot分析 k 异种移植物肿瘤生长测定( n =5/组)。给出肿瘤和生长曲线的照片。** p =0.0063，* p =0.00025。H 1975细胞对Fbxl 2稳定表达shRNAs的作用 l Westernblot分析， m MTS检测，或 n 菌落形成试验。进行了三个独立的实验。 o −r Rosa26-LSL-EGFR L858R/T790M 用小鼠观察Fbxl 2对EGFR的影响 T790M -介导的TKI抗性( n =4或6/组)。 o 显示了具有代表性的微CT图像和肺部照片。卡其色、绿色或紫红色分别代表心脏、肺或肿瘤. p 显示肺表面可见结节的数目。石蜡包埋肺 q H&E染色或 r IHC分析数据用AOD量化。数据表示为平均值±SD( a , c , h −i ，和 m , n )或表示±SEM( k , p ，和 r ). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; by two-tailed Student’s t -测试。源数据作为源数据文件提供。
上述结果表明，fbxl 2是EGFR的关键负调节因子，因此，我们利用高表达野生型EGFR的H 292细胞研究了fbxl 2对细胞增殖和肿瘤生长的影响。 31 。如图所示。 3G−I 和补充图。 三维空间 Fbxl 2沉默后，EGFR表达上调，AKT/ERK蛋白磷酸化增加，细胞增殖增加。相反，野生型fbxl 2的异位表达，而不是fbxl 2的异位表达。 C420S ，Fbxl 2 ΔF ，或Fbxl 2 4A ，可明显降低EGFR蛋白水平，降低AKT/ERK蛋白磷酸化，抑制细胞增殖。 3J 和补充图。 3E )。此外，野生型fbxl 2，而不是fbxl 2。 C420S ，对H 292异种移植小鼠模型的肿瘤生长有明显的抑制作用。 3K )。这些结果表明，Fbxl 2能抑制EGFR过表达的NSCLC的生长。
EGFR的表达 L858R/T790M 在肺癌患者中经常发现突变蛋白，我们随后研究了Fbxl 2对EGFR生长的影响。 L858R/T790M -体外和体内驱动的非小细胞肺癌。如图所示。 3L−n 和补充图。 4A ，Fbxl 2的沉默显著上调了EGFR的表达 L858R/T790M 表达，激活EGFR下游通路，促进H 1975细胞增殖。相反，野生型fbxl 2的异位表达，而不是fbxl 2的异位表达。 ΔF 或Fbxl 2 4A 突变体，减少的EGFR L858R/T790M 蛋白表达及抑制EGFR下游通路，同时抑制H 1975细胞增殖和集落形成(附图)。 4B−d )。进一步证实Fbxl 2对EGFR生长的抑制作用 L858R/T790M -驱动非小细胞肺癌在体内，我们产生了cre-诱导rosa26-lsl-eGFR。 L858R/T790M 肺肿瘤小鼠模型(附图) 4E )。如图所示。 3o−Q ，Ade-CRE诱导的EGFR表达 L858R/T790M HA-Fbxl 2的慢病毒表达能有效地抑制肺癌的形成，如微CT扫描、肺肿瘤数目的测定、肿瘤切片的H&E染色等。此外，来自HA-Fbxl2表达小鼠的肺损伤显示EGFR和p-EGFR的表达显著降低(如图所示)。 3R 和补充图。 4F )。此外，Ki 67显著减少。 + 细胞对caspase-3的切割无显着性差异(P>0.05)。 + (CC3) + )凋亡细胞(补充图。 4F，g )，提示Fbxl 2主要通过抑制肿瘤细胞增殖而抑制肿瘤生长。这些结果表明，Fbxl 2可以抑制EGFR。 L858R/T790M -驱动肺肿瘤生长。
Fbxl 2通过下调EGFR表达抑制NSCLC生长 为了探讨EGFR下调是否与Fbxl 2诱导的NSCLC生长抑制有关，我们进行了挽救实验。如图所示。 4A−d 在细胞水平上，EGFR的同时沉默完全挽救了Fbxl 2基因敲除诱导的EGFR下游通路的激活和H 292或H 1975细胞增殖的增强。此外，EGFR的沉默明显地挽救了H 292异种移植小鼠模型中Fbxl2基因敲除诱导的肿瘤生长。 4E，f )，提示Fbxl 2沉默通过上调EGFR表达促进NSCLC细胞增殖和肿瘤生长。为了证实这一结论，我们进一步研究了EGFR异位表达的影响。 E931A 拯救Fbxl 2介导的抑制NSCLC生长的研究。我们的结果表明，虽然EGFR E931A 不能结合Fbxl 2，它保留野生型EGFR激酶活性(补充图)。 5A )。EGFR的异位表达 E931A Fbxl 2的异位表达抑制细胞增殖和肿瘤生长(图2)。 4G−l )。这些结果表明，Fbxl 2通过下调EGFR的表达而抑制细胞增殖和NSCLC的生长。为了保持这一细胞系，我们研究了Fbxl 2对A 549和H 1299细胞生长的影响，这两种细胞都含有一个突变型RAS，这是EGFR信号转导的关键下游效应。如附图所示。 5B，c Fbxl 2能有效抑制EGFR的表达，但对A 549或H 1299细胞的ERK活化或增殖无明显影响，提示EGFR信号通路参与了Fbxl 2对NSCLC生长的影响。
图4：Fbxl 2通过下调EGFR表达抑制NSCLC生长。 稳定表达shFBXL2或shEGFR的H 292或H 1975细胞 a Westernblot分析， b MTS检测，或 c , d 菌落形成试验。进行了三个独立的实验。数据以均值±SD表示。 e , f H 292细胞稳定表达shFBXL2或shEGFR，或两者均接受异种移植瘤生长试验。 n =5/组)。接种后第21天处死小鼠，对肿瘤进行解剖和拍照。以肿瘤生长曲线和肿瘤重量为手段±SEM。H 292或H 1975细胞稳定表达Ha-Fbxl2或Fag-EGFR E931A ，或者两者都受到 g Westernblot分析， h MTS检测，或 i , j 菌落形成试验。进行了三个独立的实验。数据以均值±SD表示。 k , l H 292细胞稳定表达HA-Fbxl 2或Fag-EGFR E931A ，或两者均接受异种移植肿瘤生长试验( n =5/组)。接种后第19天处死小鼠，对肿瘤进行解剖和拍照。以肿瘤生长曲线和肿瘤重量为手段±SEM。* p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; all by two-tailed Student’s t -测试。源数据作为源数据文件提供。
Grp 94与Fbxl 2竞争EGFR结合和抑制Grp 94增强Fbxl 2介导的对TKI耐药NSCLC生长的抑制作用 由于Fbxl 2在内质网上也与EGFR共存，我们推测内质网可能参与了Fbxl 2介导的EGFR蛋白稳定性调控。因此，我们调查了hsp 90家族的ER成员Grp 94是否与蛋白质稳态密切相关。 32 ，在调节EGFR蛋白稳定性中起着重要作用。如图所示。 5A 在PC-9或H 1975细胞中，Grp 94明显下调EGFR的表达。Grp 94能结合EGFR的JX结构域，但不能结合Fbxl 2(图1)。 5B 和补充图。 6A )。值得注意的是，Grp 94以剂量依赖性的方式干扰Fbxl 2与EGFR的结合。相反，Fbxl 2以剂量依赖性的方式干扰Grp 94与EGFR的结合。 5C )。这些结果提示Fbxl 2和Grp 94相互竞争以获得EGFR结合。一直以来，EGFR E931A ，一个无法与Fbxl 2相互作用的突变体，结合更多Grp 94，而EGFR ∆JX ，一个突变体在与Grp 94的相互作用中存在缺陷，与Fbxl 2结合较多。 5D，e )。此外，无论是沉默Grp 94，还是被小分子抑制剂ganetespib抑制Grp 94，都显著增强了Fbxl 2与EGFR之间的相互作用。 T790M ，导致Fbxl 2介导的EGFR降解加速。 L858R/T790M 蛋白质(图1. 5F−j )。此外，TCGA数据库的临床分析显示Fbxl 2在肺腺癌(LUAD)或肺鳞状细胞癌(LUSC)中低表达，Grp 94高表达(附图)。 6B，c
图5：Grp 94与Fbxl 2竞争EGFR结合，抑制Grp 94促进Fbxl 2介导的EGFR降解，抑制TKI抵抗的肺癌生长。 a 对稳定表达shGrp 94的PC-9或H 1975细胞进行westernblot分析。 b , c 用指示表达质粒共转染HEK293T细胞36h，然后用MG 132处理4h，再进行IP-Western分析。 d , e 将HA-Fbxl 2、Myc-Grp 94共转染HEK293T细胞36h，用MG 132处理细胞4h，经IP-Western分析后，检测HA-Fbxl2、Myc-Grp 94在HEK293T细胞中的表达情况。FLAG-EGFR共转染HEK293T细胞 T790M 、ha-Fbxl 2和shCtrl或shGrp 94在夜间表达质粒( f )；或将FLAG-EGFR共转染HEK293T细胞。 T790M HA-Fbxl 2在一夜之间表达，然后用或不加加尼替比(8 NM)处理12h( g )。细胞经MG 132处理4h后，进行IP-Western分析。将EGFR与Fbxl 2结合的亲和力量化为均值±SD。 i H 1975细胞稳定表达HA-Fbxl 2或shGrp 94，或两者同时表达，经westernblot分析。 j H1975细胞稳定表达Ha-Fbxl 2，在Westernblot分析前，分别用或不加甘露司比(8NM)处理24h。稳定表达shFBXL2或shGrp 94的pc-9细胞 k Westernblot分析 l −n 异种移植物肿瘤生长测定( n =5/组)。给出肿瘤的照片、生长曲线和肿瘤重量。 o , p H 1975细胞稳定表达HA-Fbxl 2或shGrp 94，或同时表达Ha-Fbxl 2或shGrp 94，均接受异种移植瘤生长试验( n =5/组)。给出肿瘤的照片、生长曲线和肿瘤重量。 q , r H 1975细胞(5×10) 5 稳定表达HA-Fbxl 2或载体的人接受异种移植瘤生长试验( n =5/组)。小鼠用erlotinib或ganetespib治疗。给出了典型的生物发光成像、生长曲线和肿瘤重量。实验被独立地重复了三次，得到了相似的结果。 a −g 和 i −k )。数据显示为平均值±扫描电镜( m , n , p ，和 r ). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; all by two-tailed Student’s t -测试。源数据作为源数据文件提供。
接下来我们研究了Grp 94对细胞增殖和NSCLC肿瘤生长的影响是否依赖于Fbxl 2。如附图所示。 6d 沉默Grp 94对H 1975细胞EGFR表达和增殖均有抑制作用，EGFR的异位表达很好地挽救了H 1975细胞的增殖。 T790M 。同时沉默Fbxl 2还能很好地挽救Grp 94基因敲除诱导的PC-9异种移植小鼠模型中EGFR的抑制和肿瘤生长，提示Grp 94通过Fbxl 2影响EGFR的表达和肿瘤的生长。 5K−n )。相反，GRP 94的异位表达明显恢复了EGFR和PC-9异种移植瘤的生长，而异位表达Fbxl 2(补充图2)对两者均有抑制作用。 6E−h )。此外，Grp 94的异位表达或Fbxl 2的沉默也能很好地挽救甘尼替布对EGFR和细胞增殖的抑制作用(附图)。 6i，j )，表明灵芝对EGFR表达和细胞增殖的抑制作用依赖于Grp 94和Fbxl 2。
其次，我们研究了联合靶向Grp 94和Fbxl 2对异种移植肺肿瘤生长的影响。如图所示。 5o，p 沉默Grp 94可显著增强Fbxl 2介导的抑制H 1975异种移植瘤生长的作用。同样，灵芝也能显著增强Fbxl 2介导的抑制细胞增殖和H 1975异种移植瘤生长的作用。 5q，r 和补充图。 7A )，伴随着EGFR总蛋白和磷酸化EGFR蛋白水平的降低和Ki 67的降低。 + 细胞(附图) 7b−d )。此外，灵芝可显著增加凋亡细胞(CC3)。 + )(附图。 7D )。因此，灵芝对Grp 94的抑制通过抑制细胞增殖和促进凋亡细胞死亡而增强Fbxl 2对TKI耐药肺肿瘤生长的抑制作用。
Nebivolol是Fbxl 2的激活剂，在促进EGFR降解和抑制NSCLC生长方面起着重要作用。 考虑到Fbxl 2介导的EGFR的重要作用 T790M 在抑制耐TKI非小细胞肺癌的生长过程中，我们认为靶向Fbxl 2对TKI耐药的NSCLC的治疗是有益的。为了在临床前证明这一概念，我们的目的是鉴定Fbxl 2的激活剂。据报道，fbxl 2被E3泛素连接酶Fbxo 3靶向并降解，fbxo 3-apag结构域是fbxl 2相互作用所必需的。 26 ,33 。因此，我们筛选了小分子抑制剂的化学文库，这些抑制剂可以与Fbxo 3-apag结构域结合，干扰Fbxo 3−Fbxl 2的相互作用，从而使Fbxl 2蛋白稳定，从而促进Fbxo 3蛋白降解。在这方面，我们首先研究了Fbxo 3的抑制是否会导致EGFR表达的降低。事实上，Fbxo 3的沉默导致Fbxl 2蛋白水平增加，EGFR降低。 L858R/T790M H1975细胞中EGFR下游信号传导受到抑制，同时通过Fbxl 2的沉默，均能很好地挽救H1975细胞的EGFR下游信号(如图2所示)。 6A 和补充图。 8A
图6：Nebivolol上调Fbxl 2，促进EGFR降解，抑制肿瘤生长。 a H 1975稳定细胞进行Westernblot分析。 b Nebivolol的化学结构和nebivolol与Fbxo3-apag结构域的分子对接模型。 c LigPlot投影相互作用示意图 65 在Fbxo 3-apag结构域的指示残基与nebivolol之间。氢键或静电相互作用分别在绿色或蓝色的破折号线中突出显示。疏水作用被认为是短的辐射红线。转染所述表达质粒的HEK293T细胞不含. d )或与( e 10 mnebivolol处理36h，在IP-Western分析前用MG 132处理细胞。 f 在Westernblot分析之前，对H 1975细胞进行Nebivolol处理，并给予一定的剂量和时间间隔。 g 在Westernblot分析前，用10μm nebivolol处理PC-9稳定细胞48 h。 h 集成电路 50 在PC-9或H 1975细胞中，用nebivolol或BC-1215进行MTS检测。数据以均值±SD表示。 i , j 异种移植物肿瘤生长试验对PC-9稳定细胞的影响( n =5/组)。给出肿瘤的照片、生长曲线和肿瘤重量。 k −n 转基因小鼠(rosa26-LSL-EGFR) L858R/T790M )使用( n =5/组)。 k 显示有代表性的荧光图像和肺部照片。红色荧光显示EGFR高表达。典型的EGFR高表达肿瘤出现在折线上。 l 显示肺表面可见结节的数目。石蜡包埋肺 m H&E染色或 n IHC分析从杭州华安生物技术有限公司(杭州)定制了一种抗小鼠Fbxl 2的特异性多克隆抗体。 o H 1975细胞(5×10) 5 )接受异种移植肿瘤生长试验( n =5/组)。给出生长曲线和肿瘤重量。实验被独立地重复了三次，得到了相似的结果。 a 和 d −h )。数据显示为平均值±扫描电镜( j , n ，和 o ). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; by two-tailed Student’s t -测试。源数据作为源数据文件提供。
通过虚拟筛选由2,373份FDA批准的药物组成的DrugBank数据库 34 ，对能够与Fbxo 3-apag结构域结合的小化合物进行了评分(附图)。 8B )。获得了三种顶级药物，nebivolol、flibanserin和raltegrar(附图)。 8C 还有无花果。 6B )。值得注意的是，nebivolol，一种用于治疗高血压或心力衰竭患者的β-阻滞剂。 35 ，被确定为最佳命中的证据，如初步生物试验(补充图)。 8D )。对接结果表明，Nebivolol可以在apag区域形成哑铃状腔。空腔中心有5个氨基酸残基(I 331、E 341、T 367、T 368和F 369)。T 367和T 368与Nebivolol形成氢键，而E 341与Nebivolol的正电荷胺非常接近，说明它们之间存在着很强的电荷−电荷静电相互作用。预测了Nebivolol两翼的杂环基团与疏水相互作用在形状互补腔中的分布(图1)。 6B，c )。与此模型相一致的是，Fbxo 3蛋白与内源性Fbxl 2的结合亲和力明显降低。 6d )。综上所述，这些结果表明，Nebivolol是一个潜在的小分子，可以破坏Fbxo 3−Fbxl 2的相互作用。
然后，我们研究了尼比洛尔是否能干扰Fbxo 3−Fbxl 2的相互作用，并抑制EGFR的表达。如图所示。 6E ，Nebivolol能干扰Fbxl 2与Fbxo 3的结合。此外，nebivolol在PC-9或H 1975细胞中明显上调了Fbxl 2的表达，并以时间和剂量依赖性的方式下调了EGFR的表达(如图1所示)。 6f 和补充图。 8E )。值得注意的是，nebivolol既不能增加Fbxl 2的表达，也不能在Fbxo 3沉默后降低EGFR蛋白水平(补充图3)。 8F )。另外，nebivolol在Fbxl 2沉默后不能抑制EGFR的表达(图1)。 6g Nbivolol对EGFR表达的影响是Fbxo 3/Fbxl 2-依赖性的。与此相一致的是，nebivolol诱导的EGFR减少被MG 132所挽救，但没有被氯喹所挽救，其方式类似于异位表达的Fbxl 2(补充图2)。 8g )。这些结果表明，nebivolol可以破坏Fbxo 3−Fbxl 2的相互作用，导致Fbxl 2的上调，促进Fbxl 2的降解。
此外，nebivolol以剂量依赖性的方式对NSCLC细胞的活性有很强的抑制作用(图1)。 六小时 )。Bc-1215，一种已知的fbxo 3−fbxl 2相互作用抑制剂 26 ，并行使用。值得注意的是，nebivolol对携带野生型ras的pc-9细胞的增殖有明显的抑制作用，但对具有K-ras的A 549细胞的抑制作用不大。 G12S (补充图。 8H 表明EGFR信号转导通路主要参与nebivolol对NSCLC细胞增殖的抑制作用。此外，nebivolol对PC-9异种移植小鼠模型中的细胞增殖和肿瘤生长有明显的抑制作用，但在Fbxl 2(补充图2)沉默后未见明显的抑制作用。 8I 还有无花果。 6i，j )。这些结果表明，nebivolol对Fbxl 2的上调作用与其抑制生长有关。
接下来，我们用EGFR来评估尼比伏洛尔的治疗潜力。 L858R/T790M -驱动型NSCLC小鼠模型。如图所示。 6k−m ，nebivolol强烈抑制EGFR的表达，并抑制EGFR的表达。 L858R/T790M -肺部肿瘤的形成，表现为肺癌数量和肿瘤大小的显著减少。此外，ihc对nebivolol处理的小鼠肺损伤的分析显示，fbxl 2的表达明显上调，EGFR和cyclind3的表达显著降低，而cyclind3是fbxl 2的已知底物。 25 ，与未治疗的小鼠进行比较(图1)。 6N 和补充图。 9a，b )。值得注意的是，nebivolol治疗导致Ki 67大幅度下降。 + 细胞，对caspase-3的切割无明显影响。 + (CC3) + )凋亡细胞(补充图。 9B )。此外，甘露司比对Grp 94的抑制显著增强了nebivolol介导的两种EGFR的降低作用。 L858R/T790M 肿瘤生长的表达和抑制。 6O 和补充图。 9C−h )。同时，这些结果也证明了nebivolol是一种Fbxl 2激活剂，能抑制耐TKI的肿瘤生长，而甘露司比能增强肿瘤的生长。
活化Fbxl 2克服非小细胞肺癌对Osimertinib的耐药性 耐EGFR-TKIs是非小细胞肺癌治疗的主要障碍，目前还没有批准的新一代耐奥西美提尼非小细胞肺癌的TKI。因此，我们研究了Fbxl 2对非小细胞肺癌Osimertinib耐药的影响。为此，我们首先研究了Fbxl 2对耐Osimertinib的EGFR突变蛋白表达的影响。如附图所示。 10A ，Fbxl 2明显抑制EGFR L792H、G796D、C797S和L718Q突变蛋白的表达，这些蛋白均介导了对Osimertinib的抗性。 14 ,15 ,36 ,37 。此外，fbxl 2还显著抑制了EGFR e709k、l798i和l844v的表达，这些基因均来自非小细胞肺癌患者对wz 4002和co 1686的耐药，这是临床前研究中潜在的第三代tkis。 38 ,39 (补充图。 10A )。特别是，fbxl 2抑制了EGFR的表达，缩短了其半衰期。 T790M/C797S 蛋白质，使所有现有的EGFR-TKIs都具有抵抗力。 40 (无花果) 7A−c )。此外，Fbxl 2能够与EGFR结合。 C797S 或EGFR T790M/C797S 蛋白质(附图) 10b )。这些结果表明，Fbxl 2可抑制对Osimertinib抗性的EGFR突变蛋白的表达。
图7：Fbxl 2的激活克服了非小细胞肺癌的Osimertinib耐药性。 a 用指示表达质粒共转染HEK293T细胞36h，Westernblot分析。数据是具有代表性的三种独立试验的免疫印迹。 b , c FLAG-EGFR共转染HEK293T细胞 T790M/C797S 在HA-Fbxl 2或载体对照存在下36h，用50 g/mL环己酮(CHX)处理，在Westernblot分析前有一个指定的时间间隔。对EGFR蛋白水平进行量化，并给出一份代表蛋白质半衰期的图表.Pc-9-旗帜-EGFR T790M/C797S 稳定表达HA-Fbxl 2或Ha-Fbxl 2的细胞 C420S 受 d Westernblot分析 e −g 异种移植物肿瘤生长测定( n =6/组)。给出肿瘤的照片、生长曲线和肿瘤重量。石蜡包埋肿瘤进行IHC分析。数据用AOD量化。数据为均值±扫描电镜。 h 稳定表达EGFR的PC-9细胞 T790M/C797S 用编码HA-Fbxl 2的慢病毒感染PC-9/AZDR。在MTS分析前，用一定剂量的Osimertinib处理细胞72h。从三个独立实验中得到的数据作为均值±SD。*** p < 0.001. i PC-9/AZDR细胞稳定表达shFBXL2，在5μM nebivolol不存在或存在下，给予一定剂量的Osimertinib处理48h，然后进行MTS检测。三个独立实验的数据作为均值±SD。 j , k PC-9/AZDR稳定细胞(2×10) 5 )接受异种移植肿瘤生长试验( n =5/组)。小鼠单独或联合给药。图像显示肿瘤及肿瘤生长曲线。数据为均值±扫描电镜。 l 一个工作模式。E3泛素连接酶Fbxl 2靶向EGFR和EGFR突变体进行蛋白酶体降解，从而抑制NSCLC的肿瘤生长和TKI耐药。Grp 94结合并保护EGFR免受Fbxl 2介导的降解。Fda批准的药物nebivolol可以破坏fbxo 3−fbxl 2的相互作用，稳定fbxl 2并降低EGFR，从而抑制非小细胞肺癌的生长和耐TKI。 p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; all by two-tailed Student’s t -测试。源数据作为源数据文件提供。
为了进一步研究fbxl 2激活对耐药非小细胞肺癌生长的影响，我们建立了稳定表达EGFR的pc-9细胞。 T790M/C797S (PC-9/AZDR)，抗Osimertinib(附图)。 10C )。如图所示。 7D 和补充图。 10d，e 、nebivolol治疗或异位表达Fbxl 2降低的EGFR T790M/C797S 蛋白质的表达，伴随着细胞增殖的抑制。此外，nebivolol诱导的细胞增殖抑制作用也被Grp 94特异性抑制剂(Grp 94-1，iGrp 94-1)显著增强。 41 )(附图。 10F )。此外，野生型fbxl 2，而不是fbxl 2。 C420S ，显著抑制pc-9/azdr异种移植瘤的生长，同时显著降低EGFR和Ki 67的表达。 + 细胞(图1. 7E−g 和补充图。 10g )。这些结果表明，激活Fbxl 2可有效抑制Osimertinib耐药NSCLC的生长。
在体外和体内研究了Fbxl 2和osimertinib对耐TKI非小细胞肺癌生长的影响。集成电路 50 结果表明，无论是异位Fbxl 2表达还是nebivolol均能显著降低对erlotinib、geifinib或osimertinib的抗性。 7H，i 和补充图。 11A，b )。另外，尼比洛尔和奥西美替尼联合应用可显著抑制pc-9/AZDR异种移植小鼠对Osimertinib耐药非小细胞肺癌的生长(图1)。 7J，k )，没有明显的肝损伤或体重改变(补充图。 11C )。值得注意的是，nebivolol不能降低fbxl 2沉默时对osimertinib的抗性(图1)。 7i−k )。与此一致，异位Fbxl 2的表达或nebivolol对EGFR的影响不大。 E931G 突变诱导的erlotinib或osimertinib抗性(附图)。 11d，e )。这些结果共同表明，尼比洛尔和奥西美替尼联合使用可以有效地克服EGFR。 T790M/C797S -诱导非小细胞肺癌Osimertinib在Fbxl 2依赖性中的耐药。
