LMD TME的scRNA-Seq 我们做了纵向高通量的scRNA-Seq(如图所示)。 1A 治疗前13例，治疗后低输入脑脊液24例，共19例纳入NCT 02886585和NCT 02939300，多时间点采集9例。在过滤低质量的细胞后，我们从现有的临床试验样本中保留了34,742个单细胞(补充图)。 1 )，我们利用主成分分析(PCA)的降维方法对其进行了进一步的分类和可视化。 14 以及一致流形逼近和投影(UMAP；方法) 14 ,15 。我们的分析揭示了17个不同的聚类，我们通过差异基因表达(补充数据)进行了鉴定。 2 )作为适应性免疫细胞(包括T细胞、免疫球蛋白表达B细胞)、天然免疫细胞(包括树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞)和非免疫细胞(如图所示)。 1B，c )。非免疫细胞簇( n =11)表现出较强的患者特异性代表，而免疫集群( n =5)按表型而非病人分组(附图)。 2 )，与以前通过scrna-seq对人类肿瘤的观测结果一致。 16 ,17
图1：ICI治疗前后纵向取样脑脊液标本中的scRNA/cfDNA管道的研制。 a 本研究中对患者进行纵向取样的示意图。 b 在每项研究中对患者进行纵向抽样，包括试验的主要终点(虚线)，以及已知的病人死亡日期。 c UMAP的单细胞转录从所有捕获的CSF细胞在这两个试验，颜色由病人，与细胞类型的来源。
通过非监督聚类对非免疫簇进行初步识别后，通过推断每个细胞的拷贝数变异(Cnv)曲线，并与基于dna的分析结果相匹配，确定了nct 02886585样本的恶性状态。 17 ,18 ,19 。从脑脊液中提取无细胞DNA(CfDNA)，通过全外显子测序(WES)获得CNV图谱。利用这些数据，我们证实了患者特异性的非免疫簇共享他们的时间点匹配的cfdna对应物(方法，补充图)推断的cnv谱(如前所述)。 3B )。Seq-well捕获的肿瘤细胞的比例，以获得可用的时间点(见补充数据) 1 对于所有可用的细胞学报告)都有显著的相关性(kendall‘sт相关性=0.62， p 皮尔森相关系数=0.89， p =1.8×10 −5 用脑脊液中的细胞旋蛋白检测肿瘤细胞比例(补充图)。 3C )。此外，我们还从试验NCT 02886585的患者P 010、P 043、P 046和P 073获得了来自810个细胞的PBL衍生scRNA数据(补充图)。 4 ).
静脉注射ICI后脑脊液中CD8+T细胞的变化 我们发现，在免疫检查点抑制剂处理的样本中，CD8+T细胞(NCT 02886585)和增殖性T细胞(两个试验)相对于未治疗的样本更为丰富。我们首先对T/NK集群进行了非监督分析(见图)。 2A，b )，并根据基因表达相似性对scrna-seq数据进行高水平分析时，计算了CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞(可与T细胞共分离)的比例。 20 )在我们的数据集中的每个样本中(补充数据) 3 -4 )。NCT 02886585治疗后脑脊液中CD8+T细胞比例明显高于治疗前可评价标本(Cohen‘s)。 d =0.87，双边Wilcoxon秩和 p =0.03， N =24例，治疗前11例，NCT 02886585后13例，见方法，而NCT 02939300治疗后脑脊液中CD8+T细胞比例与治疗前比较无显着性差异(图二)。 2C )。对T细胞的非监督分析还发现，与增殖相关的基因表达增加，其中包括 MKI 67 , BIRC 5 ，和 TOP2A ，除其他外 16 ,18 ,21 。在接受全身治疗的患者的外周血中，ICI给药后增殖增加。 19 ,22 ,23 ,24 。我们计算每个样本的CD8+T细胞增殖率。与可评价样本相比，ICIS处理的样本中CD8+T细胞的增殖率明显高于未处理的样本(Cohen‘s d =0.62，0.60；双边Wilcoxon秩和 p =0.02， N =21，19，9预处理，12后NCT 02886585，10后NCT 02939300； 二维空间 ，见方法。在补充图中对患者纵向匹配样本的伴随分析。 5 )。这些数据表明，治疗后脑脊液中T细胞的丰度和增殖率增加。
图2：脑脊液中的t细胞在ICI后干扰素诱导、细胞毒性和耗竭基因的表达上表现出很强的差异。 a , b UMAP计算了所有T/NK细胞( n =16,954)，由队列( a )和规范单元格类型( b )通过迭代子聚类(见方法)识别。 c CD8+T细胞在治疗前、治疗后第1组和治疗后第2组中的百分比；仅考虑超过20个T细胞的样本。 d CD8+T细胞循环在治疗前、治疗后第1组和治疗后第2组中的比例；仅考虑10例CD8+T细胞以上的样本。 e 治疗前、治疗后早期(治疗后<30天)和治疗后晚期(治疗后30天≥)CD8+T细胞的效应基因表达 N =6133个CD8+T细胞。 f 治疗前、治疗后早期(治疗后<30天)和治疗后晚期(治疗后30d)CD8+T细胞均有干扰素-γ反应. g 肿瘤细胞与CD8+T细胞IFN-γ反应中位数。在c-d数据中，中线为中间线，下铰链和上铰链对应于第一和第三四分位数，上晶须从铰链延伸到最大值不超过1.5×IQR(其中IQR为中间四分位数范围)，下晶须从铰链延伸到铰链的最小值，最多为1.5×IQR。在……里面 c –f ，指示p-值是双面的，由Wilcoxon秩和检验计算，在图g中， p -肯德尔-头关联的值是双面的(见方法).
ICI处理的CD8+T细胞相对于未处理的细胞，表现出较高水平的效应功能和干扰素-γ信号相关基因水平，这些基因表达水平较高，更具有幼稚性。主成分分析表明，前两个主成分分别是治疗后早期(治疗后<30天)和治疗前样品(补充图)。 6 )。这些主成分的负载是由与干扰素-γ信号相关的基因以及CD8+T细胞的效应/幼稚表型驱动的。 25 ,26 ,27 。事实上，我们检测到与效应样功能和干扰素-γ信号相关的基因显著增加(如图所示)。 2E，f 补充数据中的基因列表 5 CD8+T细胞中CD8+T细胞与NCT 02886585(Cohen‘s)的治疗前比较(<30天) d =0.91和0.65， p < 0.001 for both IFN-γ and effector/naïve signatures respectively) and NCT02939300 (Cohen’s d =0.75和1.07， p < 0.001 for both IFN-γ and effector/naïve signatures, N =6133个CD8+T细胞)。此外，我们还发现，T细胞中IFN-γ信号的平均水平与肿瘤细胞的平均IFN-γ反应密切相关(肯德尔的τ相关系数=0.6 7，P<0.0 1，P<0.0 1)。 p =0.003，图1。 2G )，表明同一脑脊液样本中不同细胞类型的炎症反应是一致的。
纵向scrna-seq显示ici给药后的瞬时γ反应和抗原呈递特征。 干扰素-γ反应(图. 3A-c )和抗原表达(补充图。 7A-c )ICI给药后即刻出现短暂的上调，在多个细胞类型的患者中都能观察到。我们发现两种签名的模块评分暂时升高，最大出现在早期时间点(给药后<30天)； p 淋巴区、固有区和肿瘤区IFN-γ反应分别为0.00405、0.00262、0.0774； p 淋巴区、先天区和肿瘤区的抗原表达分别为0.00406、0.00871、0.0938；双侧Wilcoxon秩和检验，并在以后的时间点(首次给药后30天≥)显著减少； p 淋巴区、固有区和肿瘤区IFN-γ反应分别为0.03212、0.16491、0.08648； p 淋巴区、先天区和肿瘤区的抗原表达分别为0.022271、0.049141、0.032125； N =12预处理， N =治疗后7 0至30天， N =6 36+天后治疗淋巴组织， N =12预处理， N =治疗后8至30天， N =7 36+天后治疗先天， N =11预处理和 N =治疗后7 0至30天， N =6 36+天后治疗肿瘤，见方法)。综上所述，这些结果表明，无论是脑脊液内对静脉注射ici的急性炎症反应，还是ici激活的免疫细胞对此室的浸润，这都有可能解释静脉注射ici对nCT 02886585和nct 02939300抗lmd的临床疗效。 12 ,13 ,28
图3：静脉注射ICI后脑脊液中的急性免疫反应及其与生存的关系。 a –c 淋巴细胞在不同时间点样本中干扰素-γ反应的平均模块评分( a )、髓系( b )、肿瘤细胞( c )。一个病人的样本与虚线相连。标记的大小与样本中相关细胞的数量成正比，只考虑对应类型超过5个细胞的样本。与ICI给药相比，0天点为治疗前。 d 肿瘤细胞干扰素-γ反应的小提琴图(试验时间)，用于首次给药后<30天的样本。中音和上下四分位数在每个小提琴情节中用虚线表示。
给药后不久(<30天)恶性细胞内的干扰素-γ反应和抗原表达与试验时间有关。 为了观察先前描述的ICI反应是否对这个患者群体有预后价值，我们比较了干扰素-γ反应和抗原在细胞类型中的表现，并与试验时间进行了比较。共采集了6个样本，这些样本来自于我们知道死亡日期的初始ICI剂量<30天的个体。我们观察到，在恶性细胞中，超过初级终点的存活与干扰素-γ反应的平均模块评分有关。p =0.0526，单边Wilcoxon秩和检验 29 无花果。 三维空间 )。这种关系不适用于非恶性细胞(补充图)。 8 ).
炎性信号在脑脊液中比在血液中更明显。 在治疗后的时间点匹配样本中，我们观察到脑脊液中的炎症特征(抗原提呈和干扰素-γ反应)明显高于外周血淋巴细胞和髓系细胞( p -补充数据中的数值 6 )同时使用下采样程序(方法)来调整细胞质量的差异。此外，我们观察到治疗后即刻P 043细胞的抗原提呈和干扰素-γ反应明显增加，而PBL来源的先天免疫细胞和淋巴免疫细胞则未见此变化。 p -补充数据中提供的数值 6 )。此外，我们观察到m1样表型显著增加。 30 ,31 脑脊液衍生髓系细胞在P 043中随时间的变化( p -补充数据中的数值 6 )，我们观察到患者PBL衍生髓系细胞中相同的信号减少( p -补充数据中的数值 6 )。这表明，LMD患者的ICI后炎症在中枢神经系统中可能特别升高，体内不同的部位可能表达不同水平或阶段的整体免疫反应，值得在多个地点和时间点进行进一步研究，以充分描述患者对治疗的总体反应。补充数据中提供了PBL和CSF来源的淋巴组织和髓系细胞之间的差异表达排名(方法)。7 .
免疫原性较低的亚克隆的自适应选择与一例患者的瞬时反应相一致。 我们研究了特定患者P 043治疗反应背后的细胞行为，他们在治疗过程中表现出独特的临床、表型，并推断出CNV的动态变化。三周后，初步给药，P 043显示肿瘤负担下降，根据细胞学和塞克井(图)。 4A )。在最初的ICI给药后6周，从那时起，据报道的肿瘤细胞比例逐渐增加，直到病人结束研究，Seq井和细胞学都显示肿瘤负担增加(见图)。 4A )。在治疗后6周，伴随着LMD相关增强的患者脑部MRI的间隔增加。12周时，根据细胞学检查，恶性细胞学分数高于治疗前水平，MRI扫描显示12周时LMD进一步进展，再次表明LMD进展(图1)。 4A，b
图4：P 043的纵向scRNA和cfDNA表明，相对于较高免疫原性的亚克隆，应选择较低的免疫原性。 a 用Seq-well和细胞学的方法测定脑脊液中肿瘤的比例，用cfdna上的绝对运行推断肿瘤的纯度。 b MRI图像在0，6和12周相对于治疗；LMD-指示性增强显示为红色箭头。 c 无监督聚类推断的拷贝数剖面(左，见方法)和表达(右)揭示细胞间的异质性，可能可以解释存在亚克隆。 d 亚克隆的相对比例随时间的变化。深紫色和浅紫色分别表示后代和上升子克隆。 e 干扰素-γ在亚克隆中的表达(*) p =0.001，** p =0.01，Wilcoxon排序-sum检验，Cohen‘s d =1.4， N =52为后裔，19为上升，P 043-3；Cohen‘s d =1.4， N =14为后裔，31为上升，P 043-4)。深紫色和浅紫色分别表示后代和上升子克隆。
来自P 043的肿瘤细胞的无监督分析显示基因表达和推断拷贝数(rWME，见方法)的异质性，提示适应性选择导致获得性ICI耐药(见图)。 4C )。对于所有患者，我们评估了亚克隆性肿瘤异质性的可能性。 32 ,33 ,34 ,35 ,36 通过推断单细胞CNV谱 16 ,17 ,37 通过窗口平均表达式(WME，见方法)空间中的聚类。在15例可评价的患者中，我们发现14例患者的CNV异质性很小(补充图8)。例如，在P 029中，我们观察到基因表达空间的聚类(主要归因于循环状态)，但在推断的CNV空间中没有；在其他患者(P 014，P 050，P 061)中，推测的CNV变异有限，仅限于少数几个位点，或仅在一个时间点取样。在P 043中，我们检测到两个不同的拷贝数剖面簇的存在，这表明肿瘤亚克隆的存在(如图所示)。 4C 、方法)。此外，这两个亚克隆的部分丰度随着时间的推移而移动，其中一个克隆低丰度的预处理和单调增加的代价另一个(图)。 4D )。因此，我们假设，在P 043中，由于ICI的作用，一个少数亚克隆被适应性地选择了。
我们注意到，推测的cnv在簇间的高度差异区域对应于焦点基因组扩增，区分治疗前后cfDNA衍生的拷贝数剖面(补充图)。9 )。值得注意的是，CNV相关簇与基因表达源簇高度一致，表明P 043肿瘤细胞的遗传和表型异质性是一致的。 4C
我们在P 043测量的三个时间点绘制了每个簇的干扰素-γ反应评分图(见图)。 4E )。这些数据表明，在p 043-3处，后代克隆呈现出较高的IFN-γ应答基因。 p < 2 × 10−3 对于治疗后的时间点，双侧Wilcoxon秩和检验)--治疗后的时间点(如图所示)。 4E )。与此形成对照的是，在此过程中，方兴未艾的克隆始终表现出较低的干扰素-γ反应，最终在最后一个时间点起主导作用(P 043-4)。亚克隆间抗原表达的差异( p =0.01，P 043-3， p =0.0015，P 043-4； N =52为后裔，19为上升，P 043-3； N 在P 043-4中，后裔为14，上升为31)，详见附图。 第11d
为了支持亚克隆假说，而不依赖于推断的CNV谱或其非监督聚类，我们在每个时间点对单个细胞表达谱进行了监督比较，并与早期和晚期cfDNA衍生的wes拷贝率进行了比较(补充图)。 11C )。结果表明，P 043-4细胞的基因表达谱与从P 043-4获得的cfDNA的拷贝数谱更加一致，而P 043-2细胞的基因表达谱与P 043-2获得的cfDNA拷贝数谱更为一致。在治疗后的时间点，基因表达谱与后期cfDNA(P 043-4)拷贝数谱相关的细胞倾向于低表达干扰素-γ反应相关基因，而与早期cfDNA拷贝数谱(P 043-2)相关的基因表达谱相关的细胞(P 043-2)的IFN-γ反应相关基因表达水平较高(P043-3和−8.79-IFN-γ反应/相关差异分别为−15.9IFN-γ应答/相关差异)。
CfDNA衍生CNV时间点P 043-2(为后代亚克隆富集)和P 043-4(为优势亚克隆富集)之间存在较大的cfDNA-源CNV差异，这是亚克隆间免疫原性差异观察到的假设驱动因素。补充数据 8 其中在P 043-2和P 043-4处，cfDNA的拷贝率变化最大(分别最小)的最高基因，以及这些基因在上、后代亚克隆中的平均表达量； RAD 21 ，例如，据报道，它可以预测不良的预后。 38 ,39 ，在P 043~4处，在cfDNA中复制约5倍，在控制时间点(即P 043-3)时，在优势亚克隆中的高表达量约为3倍。
