甲型流感病毒感染无症状期的天然免疫应答肺炎链球菌定殖和非定殖小鼠

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发表时间：2021-10-19 09:50作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

季节性甲型流感病毒(IAV)感染可促进上呼吸道疾病的传播，如肺炎链球菌导致严重的危及生命的肺炎。在这里，我们旨在比较健康的定殖和非定殖小鼠在IAV攻击后，在感染初期无症状阶段的肺部天然免疫反应。对严重细菌性肺炎期间的反应进行了对比分析。分析肺细胞因子和天然免疫细胞印迹。无论其定殖状态如何，轻微的H1N1型IAV感染都是以两期疾病进展为特征的，导致动物完全康复。在病毒感染的无症状阶段，促炎症细胞因子的反应与肺炎球菌肺炎一样高。流式细胞仪分析显示早期炎症单核细胞流入肺部。中性粒细胞的大量流入仅限于细菌感染。除单核细胞外，大多数细胞表现为CCR 2和MHCII表达增高的活化表型。综上所述，我们发现对健康小鼠的IAV攻击不会自动导致严重的复合感染。然而，在感染的无症状阶段，无论感染类型如何，都会出现局部炎症反应。

导言

社区获得性肺炎(CAP)是医院外最常见的肺部感染之一.年发病率在欧洲和北美人口中为每千人五至十一例。1. 肺炎链球菌(肺炎球菌)仍然是引起CAP最常见的原因。2。在季节性流感爆发期间，甲型流感病毒(IAV)成为CAP的主要原因3。几项研究表明，IAV感染使宿主易于从上呼吸道到下呼吸道(URT，LRT)传播细菌。4,5,6。然而，大多数临床研究都将严重的混合感染与患有共患疾病的人、老年人、孕妇和1岁以下的儿童联系在一起。相比之下，大多数健康的人从如此严重的感染中恢复过来。7.

先天免疫系统在限制病毒传播以及对抗随后的肺部细菌感染方面具有至关重要的作用。3。在感染的早期阶段，住院的专业吞噬细胞和招募的中性粒细胞和单核细胞是第一反应者。肺泡(AMs)和间质巨噬细胞(IMS)位于肺内。8。AMs主要参与病原体的检测和白细胞的快速吸收。9。IMS含量较低，吞噬能力降低。一些研究表明，IAV感染会导致AMs的耗尽，导致肺炎球菌过度生长，严重的组织病理，以及致命的结果。10,11。然而，白介素-1信号传导可以防止AM耗竭，因此AMs与宿主对共感染的耐药性密切相关。12。相比之下，IMS的作用尚不明确。树突状细胞[DC；常规DC(CDCs)和类浆细胞DC(PDC)]对感染反应迅速。13通过生产I型干扰素(IFN)14,15。只有少数研究分析了DC在IAV和肺炎球菌混合感染中的作用.一项研究表明，iav感染导致肺cdc计数减少，从而使小鼠易患严重的混合感染。16，另一项研究显示iav攻击后肺dc水平升高，并具有潜在的保护作用。17.

中性粒细胞和单核细胞也被迅速吸收到感染部位。18,19。在高炎症环境下，采集的单核细胞可分化为DC/巨噬细胞或直接吞噬病原体。在IAV感染患者中发现促炎单核细胞持续增加。20。这两种细胞类型在肺炎球菌和IAV混合感染中的关键作用被提出.肺炎球菌携带与中性粒细胞的迅速流入和随后单核细胞的招募有关，而携带活弱IAV的定植个体的挑战则削弱了这些免疫应答。21.

这些老鼠的研究为研究细菌和病毒混合感染过程中的先天免疫反应提供了有价值的见解。然而，它们也有局限性。在大多数情况下，所选择的感染顺序，首先是IAV，然后是肺炎球菌，可能并不能反映出合并感染的自然顺序。此外，大多数研究集中在严重感染阶段的一种免疫细胞类型上。在这里，我们描述了天然免疫细胞在肺部对自然共感染的反应。我们发现肺炎球菌无症状地存在于小鼠的鼻咽腔中。在50%的病例中，IAV感染小鼠导致细菌被贩运到肺部。然而，动物在经历了两阶段的疾病后恢复正常。感染的早期无症状状态的特点是细胞因子水平升高，而不论感染类型如何。对天然免疫细胞组成的分析表明，病毒攻击后，受感染驱动的小鼠与非定殖小鼠之间没有差异。然而，在无症状阶段，炎症反应与重症细菌性肺炎一样高。

结果

职业吞噬细胞对肺炎球菌的细胞内杀伤作用不受IAV感染的影响

在肺部，居民和被招募的免疫细胞在随后的细菌暴露之前首先受到IAV的攻击。为了模仿这种感染顺序，专业的吞噬细胞在这个特定的顺序受到病原体的挑战。为了研究IAV感染是否影响专业吞噬细胞杀伤肺炎球菌的能力，对人原代单核细胞和巨噬细胞对H1N1的敏感性进行了分析。沙一a)。在此基础上，采用0.1的MOI进行复合感染实验。三种细胞类型均感染肺炎球菌株19F。与以前的H1N1感染无关，胞内细菌被吞噬细胞清除。单一感染细胞与共感染细胞在杀灭细菌方面没有差异(图一)。沙一(b-D)此外，还测试了小鼠单核/巨噬细胞的病原清除特性。首先，在J 774细胞中证实了IAV的复制。沙一e)。肺炎球菌在单个和共感染的J 774细胞中的杀伤分析反映了人类的表型。然而，细菌清除延迟了19小时(如图所示)。沙一f)。这些结果表明，IAV感染并不影响这些细胞类型的一般杀伤功能。

肺炎链球菌19F对C57BL/6J小鼠的定植

为了模拟自然混合感染，使用肺炎球菌株是至关重要的，该菌株能够对小鼠进行定植。侵袭性肺炎球菌株(如TIGR 4)要么引起急性严重感染，要么在使用低初始接种量时被清除。22。因此，它的定殖特性S. 肺炎19F菌株是一种典型的与人类定植相关的血清型。定植是指URT中稳定的细菌负荷和无局部及全身炎症。初期定植的特点是体重下降，临床评分在细菌应用后第一天略有增加。在接下来的三天内，这两个参数都正常化了。1A、B)。S. 肺炎19只小鼠连续7天稳定定植，第7天肺内未检出细菌。1c，D)。为了排除持续的局部或全身炎症反应，我们测定了蛋白质和趋化因子浓度以及白细胞分化(WBC)。1(e-i)局部和全身炎症在定植后3天内开始增加。

非小鼠适应H1N1对C57BL/6J小鼠病毒性肺炎的轻微症状

小鼠适应的IAV菌株容易引起重症肺炎。为了只引起轻微的症状，小鼠感染了一种非小鼠适应的h1n1。23并监测疾病进展情况(图一)。2)。注意到剂量依赖性体重减轻和临床评分的增加(如图所示)。2A、B)。第四天，证实肺部存在病毒RNA(图一)。2c)。WBC显示循环中中性粒细胞水平升高(如图所示)。2d)。基于这些结果，1×105PFU用于所有H1N1感染。

肺炎早期局部和全身炎症反应

其次，在细菌定植后7天(也称为共感染)，可诱发轻微的H1N1感染。单个H1N1感染起控制作用。为了追踪严重的反应，一组高剂量的肺炎球菌感染被包括在内(如图所示)。3a)。与严重肺炎球菌肺炎不同的是，n1n1感染的定植和非定殖小鼠的特点是两阶段的疾病过程，导致完全恢复(图一)。3b、c)。对鼻腔冲洗液(NAL)和支气管肺泡液(BALF)细菌负荷的分析表明，肺炎球菌仍局限于小鼠的鼻咽，而肺炎球菌肺炎的特点是细菌负担较高，50%的共感染小鼠肺内存在细菌(图一)。3D、E)。虽然是当地的(图中所示)。3(F)和系统性(如图所示)。3(G)三种感染均有炎症反应，各组间无显着性差异。

基于这些结果，我们假设早期的炎症反应可以帮助健康的小鼠摆脱病毒和混合感染中的严重疾病进展。所有动物均在病毒感染两天后出现临床症状前处死(图一)。4A和补充图。S2)。虽然在两组感染H1N1病毒的小鼠中都没有发现明显的疾病迹象，但50%的共感染小鼠肺部有细菌，并表现出较高的全身反应(补充图1)。S2)。此外，白细胞在共同感染小鼠的肺中大量流入，特别是细菌性肺炎组(补充图)。S2)。其次，测定肺和血浆中的细胞因子。细菌性肺炎导致细胞因子水平升高。4)。只有背景水平的IL-10和IL-12p70出现在所有感染动物(补充图)。S3)。虽然两个病毒感染组均无症状，但与单个细菌性肺炎相比，局部和系统地检测到几乎同样高的细胞因子水平，只有IL-1α除外。两种病毒感染均有相似的IL-1α水平。然而，IL-1α仅在肺内升高(如图所示)。4)。相反，所有感染小鼠的血浆和肺炎球菌肺炎组的肺部均检测到GM-CSF(附图)。S3).

不同感染对肺部髓系细胞组成及其表型的影响

虽然单一病毒和共同感染的动物是临床上无症状的，但在肺部发现了一种炎症细胞因子反应。这促使我们探索肺部髓系细胞亚群的组成。为了区分血管和肺泡间质/肺间隔，小鼠静脉注射标记CD 45抗体。因此，CD 45嗨细胞被定义为来自血管和CD 45的细胞。罗氏肺泡/间质室的细胞。细胞亚群被进一步分类，如附图所示。S4.

一般来说，在细菌性肺炎组的两个肺室中，收集到的中性粒细胞和单核细胞的频率升高(如图所示)。5A、B)。中性粒细胞内流在合并感染中略有增加(图1)。5a)。相反，在两种病毒感染的肺中检测到更多的单核细胞(图一)。5b)。对单核细胞亚群的分析表明，单核细胞总数的增加可能与炎症/经典单核细胞的流入有关，而非经典单核细胞的频率在所有感染中都减少了(图一)。5c)。对常住巨噬细胞的分析表明，在疾病的早期，病毒感染不会导致AMs和IMS的耗尽。相反，严重的细菌感染导致这两种细胞类型的急剧下降(如图所示)。5D、E)。基于当前的模型8，对IMS的三个亚组进行了检测(附图)。S4)。无论感染类型如何，IM2频率均下降。相反，IM3频率在所有细菌感染中都增加了(图一)。5f)。此外，在共感染小鼠中只检测到pDC的频率升高(如图所示)。5g)。相比之下，疾病预防控制中心的总人数仍未受到合并感染的影响。然而，单一的病毒和细菌感染的特点是CDCs数量减少(图一)。5h)。CD11b亚群体分析显示CD11b的频率+CDCs在所有感染病例中增加，而CD 103则增加。+CDCs大部分未受影响(图1)。5i)。

天然免疫细胞进入感染部位主要是通过CC趋化因子受体2(CCR 2)检测CCL 2。24。此外，驻地细胞和被招募细胞通过MHCII呈递抗原，从而促进适应性免疫应答。25。因此，对这两种活化标记进行了分析。MHCII和CCR 2表达中性粒细胞、AMs和CCR 2的频率升高+IM1主要在单个细菌和共感染小鼠的肺中检测到(如图所示)。6)。然而，在大多数细胞群体中，表达MHCII和CCR 2的天然免疫细胞亚群的频率没有显着性差异(附图)。S5)。为了更详细地研究MHCII和CCR 2的表型，我们分析了MHCII和CCR 2在所有细胞上的表达水平。7)。在间质/肺泡间隔内，AMs、CD 103的MHCII和CCR 2水平升高。+CDCS和pDC在所有感染中。CD11b+疾病预防控制中心显示这两种分子在共感染中都有上调作用(如图所示)。7)。而在IM3中，这两种蛋白在病毒感染中都被上调，而在单个细菌感染中则有相反的调节。此外，单核细胞的特点是两种分子对大多数感染的反应水平较低(图一)。7)。在血管室内，只有中性粒细胞显示单个细菌和合并感染时MHCII和CCR 2水平升高(见图)。7).

讨论

包括CAP在内的严重感染的特征是最初的超炎症，然后是免疫麻痹。26。据推测，IAV为定植细菌进入下呼吸道铺平了道路，导致高死亡率。3。然而，大多数研究使用的是最初的病毒应用，其次是细菌感染。由于多达三分之一的人类无症状地被肺炎链球菌27，我们的模型可能更接近于人类的呼吸道混合感染。我们的研究表明，健康小鼠肺炎的发生与免疫反应的同质性有关。感染的特点是肺和血浆细胞因子水平升高，中性粒细胞和单核细胞大量流入肺。大多数免疫细胞表现出活化的表型。

在最初的轻微症状后，肺炎球菌可以无症状地定植小鼠。在50%的病例中，受定植小鼠的轻度H1N1感染并没有导致严重肺炎，而是导致肺炎球菌肺部入侵。最近的一项研究表明，肺炎球菌必须适应受iv感染的肺部的恶劣环境，这种环境的特点是高炎症和毛细血管渗漏，并有抗氧化物流入肺泡腔。28。此外，体内研究将肺炎球菌引起严重混合感染的可能性与包膜血清型联系起来。29。尤其是侵袭性包膜血清型会引起严重的混合感染。然而，这一现象似乎相当特定于紧张，表明其他肺炎球菌因素也参与了其中。29。尽管如此，非侵入性菌株仍可导致致死性共感染。11。值得注意的是，上述所有研究都使用了(一)小鼠适应的IAV菌株，这些菌株很容易造成严重的组织损伤，并且(Ii)在病毒应用之前不涉及小鼠的定植。此外，研究还表明，严重的混合感染与患有共患病的人、老年人、孕妇和一岁以下的儿童有着特别的联系。7。进一步的研究，使用的共同感染模型，相当于在共同或老年小鼠建立的模型是有必要的。

大多数关于混合感染的研究主要涉及一种免疫细胞类型，据我们所知，这是第一项通过分析几种吞噬免疫细胞来评估这种感染的复杂性的研究。一般情况下，单个IAV与共感染小鼠在疾病进展和肺免疫细胞组成上的差异很小。这很可能是因为(一)感染的顺序(第一次定植，然后是病毒感染)，(二)分析的时间点(感染的早期无症状期和晚期)，以及(三)所选病毒株的低毒力。尽管如此，我们的小鼠模型显示了对所有类型感染的显著免疫反应，这可能部分解释了大多数人类群体的非致命性表型。与严重的肺炎球菌感染不同的是，在两阶段感染后，受殖和非定居小鼠的h1n1感染导致完全恢复。为了追踪观察到的感染表型的潜在解释，我们分析了局部和全身免疫反应。与感染类型无关，细胞因子水平较高，主要与髓系免疫细胞室有关。CCL 2/mcp-1的主要特征之一是单核细胞在感染部位的聚集。30,31。与此相一致，所有受感染小鼠的肺中单核细胞总数都有所增加。IL-1家族细胞因子刺激CCL 2/MCP-1和CXCL 1的表达32,33，而Cxcl 1水平的升高与中性粒细胞的招募有关。34。IL-1β多见于肺炎球菌感染小鼠的肺部，单个细菌和共感染动物的中性粒细胞内流增加。局部产生IL-1β的作用可进一步归因于肺炎球菌是炎症小体激活和随后IL-1β释放的有力诱导剂。35,36。此外，所有感染小鼠的肺组织中都有较高的IL-6水平。IL-6的产生主要与高致病性IAV病毒有关。37在IAV感染中起保护作用38,39。我们的结果表明，即使是轻微的H1N1感染也是保护IL-6水平的一种强有力的诱导剂。

在细胞水平上，肺中性粒细胞吸收受损与合并感染的细菌过度生长有关。40。我们的结果显示了中性粒细胞对病毒感染的独立免疫反应，证实了早期的发现表明单核细胞而不是中性粒细胞在IAV感染中起着至关重要的作用。41。然而，IAV感染导致单核细胞凋亡死亡。42，这很可能反映在小鼠肺中非经典单核细胞的减少。作为一种潜在的补偿机制，我们观察到经典单核细胞频率升高。肺内免疫细胞，包括肺泡巨噬细胞，在组织稳态和炎症的解决中发挥着重要作用。9。据报道，IAV感染会消耗AMs。10,43,44。我们的分析表明，在病毒感染的早期，AM和IM的总水平仍未受到影响。体外分析进一步证实了这一事实。在H1N1感染细胞中，人和小鼠单核/巨噬细胞的抑菌特性没有受到损害。与此形成对照的是，在单一细菌感染中，两种细胞类型的频率降低。Ims最有可能通过产生IL-10来诱导抗炎状态，从而抑制dc的成熟和激活。45。Pdc和cdcs在肺部病毒感染中具有多余的和基本的功能。15。PDC限制病毒复制，并通过产生Ⅰ型和Ⅲ型干扰素传播。46。然而，研究表明，感染h1n1会导致pdc持续耗竭。47。在我们的实验方法中，单个病毒或肺炎球菌感染时CDC计数减少，而PDC计数未受影响。相比之下，合并感染的特点是pDC数量增加，CDC计数不变.

为了启动适应性免疫反应，天然免疫系统中的细胞上调mhcⅡ的表达是至关重要的。48。此外，CCR 2的上调是细胞从骨髓向感染部位转运的重要机制。24。因此，这两种分子的上调是细胞活化的标志。我们主要观察到细菌驱动的mhcⅡ膨胀。+和CCR 2+血管中性粒细胞AMs和CCR 2+IM1人口。此外，除单核细胞外，大多数被分析的细胞表现出活化的表型。CCR 2的高表达是有益的还是有害的还在争论中。几项研究将CCR 2的流入联系在一起。+主要是IAV介导的肺部感染中细胞对肺损伤的影响49,50,51。相反，CCR 2+细胞对细菌清除很重要。52,53,54。在这一阶段，我们只能推测，观察到的CCR 2在单核细胞上的下调和在其他细胞上表达的增加可能有利于健康小鼠的细菌清除，从而使其从单一病毒感染和混合感染中完全恢复。

总之，我们的结果表明，细菌和病毒混合感染的早期发病与细胞因子的产生、居民巨噬细胞的活化以及主要活化的中性粒细胞的流入有关。相反，浸润的单核细胞表现出抑制性表型。这种对轻微病毒感染和肺炎球菌定植株的免疫反应可能有助于清除健康小鼠的病原体。未来的研究跟踪局部和全身的天然免疫反应作为一个整体和阐明共同或高年龄的作用是有必要的。

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