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HPV-16体液免疫应答的种系决定因素对口咽癌的保护作用

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发表时间:2021-10-15 14:11作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

虽然已经发现了几个口咽癌易感位点,但大多数以前的研究缺乏关于人类乳头瘤病毒(HPV)状态的详细信息。我们对4,002例口腔癌(OPC)和口腔癌(OCC)患者和5,256例对照者的HPV 16血清学状况进行了全基因组分析。我们检测了四个易感位点,表明HPV状态具有明显的遗传易感性。我们在HLA区域最显著的发现,即现在证实的HPV(+)OPC风险的特异性,揭示了两个具有强烈保护作用的独立位点,其中一个改进了先前报道的HLAⅡ类单倍型关联。针对HPV 16病毒蛋白的抗体水平将保护性HLA变异作为体液对L1衣壳蛋白或E6癌蛋白应答的主要决定因素,提示HLA变异促进了对HPV(+)OPC的自然免疫应答。这表明针对E6的治疗性疫苗在HPV感染后可减弱病毒的应答,可能对HPV(+)OPC有保护作用。

导言

口咽癌(OPC)是一种异质性的肿瘤,有些是由吸烟和过量饮酒引起的,另一些则是由人类乳头瘤病毒(HPV)感染引起的。大多数hpv阳性的opc是由hpv 16型(Hpv 16)引起的,在许多国家,hpv超过烟草暴露是导致opc的主要原因。1,2。Hpv 16阳性(hpv(+))opc现在被认为是一个独立的疾病实体,与hpv 16阴性(hpv 16,−)opc有不同的治疗方案,以及不同的生物学、流行病学、临床和预后特征。1,3,4,5,6.

种系遗传变异在人乳头瘤病毒(+)和人乳头瘤病毒(−)的易感性中可能发挥不同的作用,对特定变异体的鉴定可能有助于制定有效的预防、筛选和治疗策略。全基因组相关研究(GWAS)已经确定了几个opc易感位点,但由于缺乏有关hpv状况的信息而受到限制。7,8,9。在我们之前的研究中,人类白细胞抗原(HLA)区域(6p21.3),特别是HLA单倍型的作用DRB 1*13:01-DQA 1*01:03-DQB 1*06:03,被发现对OPC具有保护作用。9。同样的单倍型曾被报道对子宫颈癌有保护作用。10,这进一步强调需要通过HPV状态对OPC进行全面的遗传分析。

要做到这一点,正确识别HPV驱动的口咽肿瘤是至关重要的.HPV血清学是一个合适的解决方案,在情况下,肿瘤组织直接评估是不可用的。它通过检测抗病毒蛋白的抗体来捕捉体液免疫反应水平。抗hpv l1抗体被认为代表过去和现在从多个可能的解剖部位(如生殖器、肛门或口腔)累积的hpv感染,并且在没有hpv相关肿瘤的个体中比较常见。2,6,11,12,13。抗HPVE6和E7癌蛋白的抗体产生于潜在的HPV驱动的肿瘤过程,因此,在HPV驱动的肿瘤患者中抗体水平较高,而在无癌个体中的抗体水平较低。大量基于人群的队列研究表明,抗hpv 16早期病毒蛋白的血清学措施具有较高的敏感性和特异性,可用于检测由hpv 16驱动的opc个体。14,15。尤其是在HPV 16(+)OPC患者中,有90%以上的人出现了HPV 16 E6抗体,而人群中的血清学阳性是一种罕见的情况(<1%)。2,14,16,17。因此,针对特异性E蛋白的抗体在确定肿瘤HPV状态时是有用的。2,6,16。此外,他们还可能提供信息,哪些体液反应是激活的反应,对感染和恶性进展。

在本研究中,我们基于HPV 16血清学,在OPC中进行了一次GWAS,以检测相关基因座的遗传结构、易感性和潜在的功能后果,从而深入了解OPC的病因。我们的研究通过HPV 16状态来确定OPC的遗传异质性,并将HPV(+)OPC保护性HLA变异作为体液对病毒蛋白反应的主要决定因素。

结果

对基因分型数据采取严格的质量控制步骤9,1643例opc病例和5256例无癌症对照物进行分析(表)1、补充表13)。OC病例系列包括2359例病例,根据其共同的危险因素,用于补充hpv(−)opc分析(补充表)。4).

表1参试对象在质量控制后的背景特征。

根据血清学资料,65.6%的OPC病例(1643例中有1078例)被归类为HPV(+)。在有血清学资料的对照组(1543人)中,16人(1%)被归类为HPV 16的血清阳性,群体特异性为99.0%(95%CI:98.3-99.4%)。HPV 16血清标志物(E1、E2、E7)的中位荧光强度(MFI)值在病例组明显高于对照组(补充表)。5).

GWA按HPV 16状态(1078人乳头状瘤病毒(+)和565人乳头状瘤病毒(−)OPC病例和5256人对照)在每个大陆进行分层分析,经Meta分析得出7,574,753个SNPs用于风险关联分析。这两个性状的GWAS结果如图所示。1。没有证据表明基因组膨胀后的任何一项分析后,将其扩大到1000个病例和对照组。9(补充图。1)。所有调查结果P值小于1×10−6在补充数据中报告13.

图1:全基因组关联区域元分析结果。
figure1

红线P=5×10−8。这个y轴显示−log 10P价值。aHPV(+)OPC病例分析1078例,对照组5256例。b人乳头瘤病毒(−)OPC病例分析565例,对照组5256例。对每个世界区域进行GWAS,采用多变量无条件Logistic回归,假设以年龄、性别和特征向量为协变量,建立对数加性遗传或剂量模型。P-数值由区域协会统计的固定效应元分析显示.人乳头瘤病毒OPC口咽癌。

HLA区域与HPV(+)OPC风险显著相关

强烈的信号(P=4.5×10−11)定位于6p21.32的HPV(+)OPC病例。12)。基因组的这一区域编码HLA区域,该区域调节免疫反应。此外,在3q26.1和4q35.1位点检测到的两个暗示性关联正好低于GWAS的显着性水平(P < 1 × 10–7,补充表6).

表2人类乳头瘤病毒16型血清状态分析口咽癌基因组范围内最重要的区域及其最有可能的功能变异。

分层分析,通过研究的特点总结在补充图。2。没有观察到特征地层在有效尺寸上存在差异的证据。

值得注意的是,在这个更大的研究人群中,人类乳头瘤病毒的状态信息,我们也复制了先前观察到的三个HLA特异性等位基因的关联(DRB 1*13:01, DQA 1*01:03,DQB 1*06:03)及其单倍型降低HPV(+)OPC的风险(表)2和补充图。2)9.

HLA区域的精细定位揭示了与HPV(+)OPC风险相关的两个独立位点。

HLA区域高度多态,存在广泛的连锁不平衡(LD),识别关联的因果关系难以评估。为了精细绘制该区域的地图,我们推测了经典HLA基因的序列变异.在关联分析中使用的最后一组假定变体是高质量的;92.5%的变体R2≥0.9和68.2%较不常见的变异体(MAF<0.0 5)R2≥0.9.

与HPV(+)OPC风险的关系延伸到第一类和第二类区域(图1)。2A)。最显着的变异是rs4713462的A等位基因,这是一个HLA I类基因间变异,定位于AL671883.1的5.6kb 5‘。这种变异在以前的gWAS分析中还没有被识别出来。9只有有限数量的人乳头瘤病毒状态数据。(或=0.66,P=4.5×10−11;图1.2A2)。考虑到它与HLA-B和-C的接近性,我们在我们的数据中检验了涵盖该区域的单核苷酸多态性(SNPs)的配对LD统计数据。在附图中。12,成对D‘和R2提示SNP rs 4713462在HLA-B、C编码区或周围区域与SNPs有一定的相关性。这与我们在附图中的结果是一致的。13,其中rs4713462是该地区最重要的变异体,LD和关联统计数据包含HLA-C和B。功能注释显示,rs 4713462被预测为eQTL。赫拉-丙跨越不同的组织,包括上消化道组织。考虑到mhc区域的扩展性LD和相当数量的在全基因组水平以下的变体的重要性,显示出类似的关联。赫拉-丙MRNA水平(补充表)7),我们探索了赫拉-丙MHC区域的基因表达控制。Rs4713462 A等位基因与赫拉-丙基因在口腔相关组织中的表达(附图。3)。这可能表明HLA-C的表达不太可能介导这种关联。

图2:HPV(+)OPC病例在MHC区的逐步条件关联图。
figure2

ac用于调节的每个轨迹的关联显示在每个面板中:a无条件的,b条件是rs 4713462,c条件为rs4713462和HLA-DRB1氨基酸在第71位(71-Glu)发生变化。表中的详细关联结果2和补充图。2。圆圈表示-log 10(P每个二元标记的数值),使用估算的等位基因剂量(在0到2之间)和基因型变异。以年龄、性别和特征向量为协变量的对数加性遗传或剂量模型作为基线模型,进行多变量Logistic回归分析。虚线黑色的水平线代表了研究范围内的重要阈值。P=5×10−8。HLA基因在6号染色体上的物理位置在下面。圆圈的颜色表示标记的类型;HLA基因内外的浅蓝色SNPs、绿色经典HLA等位基因和HLA基因的红色氨基酸多态性。HLA人白细胞抗原、MHC主要组织相容性复合物、HPV人乳头瘤病毒、OPC、口咽癌。

在rs 4713462上进行条件处理后,仍有证据表明HLAⅡ类区域存在另一种保护性联系(P < 5 × 10−8)。该基因定位于rs9269942的一个A等位基因,这是一个导致谷氨酰胺在71(71-Glu)密码子中的氨基酸变化的多核苷酸变异。HLA-DRB 1蛋白质(OR=0.56,P=2.8×10−9;图1.2B2),并将其翻译为肽结合槽中的位置。HLA-DRB 1*13:01还有另外三个HLA-DRB 1等位基因(*)04:02, *13:02和*11:02),其保护趋势也被确定(补充图)。4;补充表8)。这一结果进一步加强了该变异体可能的功能作用,并进一步完善了HLA单倍型的关联。DRB 1*13:01-DQA 1*01:03-DQB 1*06:03在我们以前对OPC的GWAS分析中识别出来的9子宫颈癌风险降低10.

当rs 4713462和HLA-DRB 171-Glu为条件,未检测到残留信号(图一)。2C).

除了识别与HPV阳性OPC风险相关的位点外,单倍型分析还被用于定义HLA区域内关联变异的边界,考虑到其复杂性和扩展的LD。唯一发现的与OPC风险相关的单倍型是HLAⅡ类单倍型,DRB 1*13:01-DQA 1*01:03-DQB 1*06:03(表)2;补充图。1A)。当考虑I类或I类和II类时,没有其他单倍型表现出显著的关联。条件分析DRB 1*13:01-DQA 1*01:03-DQB 1*06:03而rs 4713462在同一模型中,也揭示了这两种效应的独立性(表)。3).

表3从HPV(+)OPC分析得到的最佳模型中所含的HLA等位基因、SNP和氨基酸按BIC标准判断。

我们随后评估了被鉴定为保护OPC的独立变异体是否表示了来自单倍型、单倍型中特定氨基酸的保护作用,还是可以从功能上映射到与HLA无关的其他变体的保护作用。11)。为了细化MHC区域内的关联,采用模型选择的方法,以贝叶斯信息准则(BIC)作为模型选择准则,识别变异型、氨基酸型和(或)单倍型组合。表3显示最适合此搜索数据的组合模型。模型A被认为是最佳拟合模型。这意味着HLA-DRB 1*13:01中的71-Glu氨基酸解释了II类单倍型的关联。DRB 1*13:01-DQA 1*01:03-DQB 1*06:03高危HPV(+)OPC(表)23;补充图。2A)。虽然Glu-71是DRB 1-DQA 1-DQB 1的主要作用部分,因为它符合条件模型中的数据,并且具有生物学意义,但氨基酸(Ala-74)似乎并不是对Glu-71的独立影响,因为这种影响并不显著(p>5×10−8),当两者都在模型中时(补充表)12,模式E),而在没有Glu-71(补充表)的情况下,效果更强、更显着。12、模式C)和个别模式(补充表)11)。由于这个原因,我们不能排除在单倍型中的附加位点支持或增加风险,可能是发生在HLA-DRB 1*1301中的氨基酸位置74,也位于蛋白结合槽(补充图)。4).

每种HLA变异体与抗病毒蛋白抗体的关联表明HLA对病毒蛋白的不同反应

我们利用HPV 16、E6或L1抗体水平对8291个MHC推测变异体进行了蛋白定量性状位点(PQTL)分析,以探讨这些变异与抗体水平之间的关系。Rs4713462和71-Glu分别是与E6和L1抗体水平密切相关的变异体(图1)。3,补充图。9)。具体来说,结果显示rs4713462等位基因(A)与(?)B=−0.31,P=1.3×10−8)有较低的E6抗体水平,而不是L1 MFI水平(B=−0.07,P=0.05);71-Glu,位于HLA-DRB 1*13:01,显示出一个强有力的关联(B=−0.30,P=7.0×10−8)L1MFI水平较低,而与E6MFI水平无关(B=−0.12,P=0.11)。提示它们与HPV(+)OPC的关系可能是通过影响病毒肿瘤发生过程中的体液免疫反应来实现的,并证实了这些变异体与HPV(+)OPC的相关性。

图3:前两位相关的HPV(+)OPC HLA变异体抗HPV抗体水平的pQTL分析。
figure3

方框图aHPV16E6MFI水平和rs 4713462基因型bOPC患者HPV 16、L1 MFI水平及DRB 1(71-Glu)变异。效应大小(B,回归系数)根据年龄、性别和特征向量进行调整。对于HLA-DRB 1 71-Glu,A代表缺勤,P代表存在.方格图显示中间线(中线)和第25和75百分位数(框边),胡须延伸到间隔范围的1.5倍。采用线性多元模型检测MHC区遗传变异与HPV 16 L1或E6对数转化MFI水平的相关性,假设剂量模型以年龄、性别和特征向量为协变量。HLA人白细胞抗原、pQTL蛋白定量性状位点、HPV人乳头瘤病毒、OPC口咽癌、MFI中位荧光强度。

我们对被分类为HPV(+)的OPC病例子集中的顶级关联变体进行了重复分析,希望找到与使用所有OPC病例的病例相似的关联。对HPV 16、E6+病例(>1000 MFI)的分析再次发现与rs4713462(B=−0.1)相关;P=0.01)。鉴于数据数量较少,且数据范围缩小,这一关联不像预期的那么显著(补充图)。11)。当局限于HPV 16 L1+病例时,我们没有发现与71-Glu变异体和L1水平有关(B=−0.04;P=0.22)。这可以再一次解释,当一个限制在L1+的情况下,数据范围更有限(补充图)。11).

HPV16E6和L1联合阳性在OPC患者中较常见(42%,1643例OPC中685例)。因此,我们研究了E6或L1抗体水平对它们与各自遗传变异的关联的可能影响,通过调整可选的血清学标记。如补充表所示11,结果与图中的原始结果非常相似。3,表明其他血清学指标的调节作用不大。

由于其他E蛋白(E1、E2、E7)与HPV16E6之间的功能联系和相关性,我们探讨了HLA的顶级相关变异与抗这些蛋白抗体之间的关系,作为敏感性分析。我们还探讨了其他已知但不太常见的高危型HPV(HPV 18/31/33/35/45/52/58的E6和E7)之间的关系,以评估所鉴定的HLA变异是否是与HPV类型无关的E6特异性相关变异。提示rs4713462与HPV16E6抗体的结合可能与HPV16E6抗体有特异性,但与HPV16E6的相关性最强。6)。其他高危型hpv的血清阳性率在hpv(+)或hpv(−)opc中所占比例非常有限,减少了非hpv 16标记解释hpa遗传发现的可能性(补充表)。910).

人乳头瘤病毒(−)

在人类乳头瘤病毒(−)OPC病例和对照组的GWA分析中,12p23.3有一个危险变异(rs35189640,OR=2.73,P=1.1×10−9;图1.1B2)与人乳头瘤病毒(−)OPC的危险性显著相关。基因组注释显示rs 35189640是Btb域-包含11 (BTBD 11一种DNA结合蛋白,如锌指转录因子。有趣的是,rs 35189640也被定位到一个被抑制的多梳组蛋白(PcG)结合位点,该结合位点是根据30多个组织中的染色质状态来评估的(补充图)。5)。表中显示的地理区域或研究特征没有发现异质性的证据。1(补充图。二维空间)。在另外5个位点3p26.2、1p36.13、13q33.3、5q34和6p21.32处发现了其他暗示性易感性变异,它们仅低于GWA的显着性水平(P < 1 × 10–7,补充表6).

OCC和人乳头瘤病毒(−)OPC病例的合并GWAS

为了提高调查结果的可靠性,我们将2 35 9例口腔癌患者与5 6 5例人乳头状瘤病毒(−)OPC病例合并,并重复分析。这是在假定OCC是一种以人乳头瘤病毒(−)为主的疾病,并有共同的危险因素的人乳头瘤病毒(−)OPC,即烟草和酒精的使用。

曼哈顿的集合数据集的地块显示在补充图中。7。除了以前报告的变体9对于这两个肿瘤位点,我们在6p21.32处鉴定了两个易感位点(rs 3828805,OR=0.77,P=2.5×10−9)和15q21.2(rs10851478,OR=1.22,P=1.3×10−8)共同的两个癌症实体。Rs 3828805与HLA-DRB 171-Glu变式(r2我们发现HPV(+)OPC中HPV 16 L1抗体水平与HPV16L1抗体水平有关。如所料,rs 4713462与抗HPV 16 E6病毒癌蛋白的抗体完全相关,独立于rs 3828805(r2=0.0004),与OC/opc(−)风险无关(表)。4)。对于rs 10851478,此变体为顺式-EQTLFgf 7基因(附图)8)是一种强有力的上皮细胞特异性生长因子,在上皮的形态发生中起着重要的作用。

表4从OCC和HPV(-)OPC的区域Meta分析中发现的基因组范围内最重要的区域和先前分析中突出的区域。

评估研究结果的一致性

总体上,非均一性检测显示,人乳头瘤病毒(−)、OPC和OC具有最高的与疾病相关的遗传关联,而HPV(+)和HPV(−)OPC的遗传关联不同,揭示了不同的遗传倾向和可能的遗传结构(附图)。10)。简而言之,显著的异质性(p < 0.05) was identified in the meta-analysis of HPV(+) and HPV(−)OPC for rs4713462 at HLA region and for rs35189640 at BTBD 11位点表明分别与人乳头瘤病毒(+)和人乳头瘤病毒(−)OPC有排他性关联(补充图)。10b). Fgf 7LHPP联合对HPV(-)OPC和OCC分析有共同和一致的影响(附图)。10A)以及AD-H1B以前被确定为与总体OPC和OCC相关的9. BTBD 11对人乳头瘤病毒(−)OPC有较强的作用。10).

讨论

总之,我们的研究通过HPV 16状态来确定OPC的遗传异质性,并扩展了口腔癌遗传学的现有知识,以识别多个遗传位点。

HLA区域的两个位点对HPV(+)OPC风险的保护作用最强:rs4713462和HLA-DRB 171-Glu后者改进了以前报道的HLAⅡ类单倍型关联,最近在一个独立的系列中复制。9,18。根据hpv血清学数据,rs 4713462只与抗HPV16E6的抗体水平有关,而hpv 16 E6是一种病毒癌蛋白。HLA-DRB 171-Glu仅与抗病毒衣壳蛋白HPV 16 L1的抗体水平有关.

根据我们目前的理解,人类乳头瘤病毒(Hpv)的血清学阳性反应是对病毒蛋白的体液免疫反应的结果,这些人试图通过T细胞反应来消除受影响的细胞。19,20。T细胞介导的免疫反应对于清除hpv感染和hpv驱动的肿瘤细胞都是必不可少的,人们可能会推测相关的HLA变异正在促进目标细胞介导的对病毒蛋白的反应,从而对hpv驱动的癌症产生保护作用。事实上,在那些携带高能量物质的个体中,L1或E6的MFI水平相对较低。HLA-DRB 1当T细胞看到反映主动免疫反应的抗原时,rs4713462的Glu或A等位基因可能会被更活跃的抗体“消耗”所解释。21,22。因此,HLA-DRB 171-Glu变异体可能意味着对预防HPV 16感染的更有效的控制,从而最终保护人类乳头瘤病毒(HPV)驱动的癌症。这将模仿预防疫苗的作用,利用L1衣壳蛋白在组织特异性感染及其抗原性中的作用,或可能诱导更有效的T细胞对L1的反应,从而阻止致癌转化。Rs4713462的A等位基因可能在稍后阶段通过靶细胞介导的对HPV 16感染细胞提供的表达E6的病毒致癌反应而发挥作用。因此,我们的结果为HLA生殖系变异体在导致癌症的感染过程的不同阶段对HPV驱动的肿瘤提供了自然免疫反应的证据。这表明,在E6相关变异体中,针对hpv 16 e6的治疗疫苗可以减轻已建立的hpv感染后的病毒影响。23。已经开发了几种很有前途的方法,其中一些已经达到了临床试验的高级阶段。24,25,26,27。癌蛋白E6和E7在治疗性HPV疫苗研究中得到了广泛的应用,因为HPV16E6和E7蛋白都是最常见的致癌HPV类型中未受抑制的细胞增殖的驱动因子,并且是构成性表达的。单独使用E7的HPV疫苗比E6更常用。E7的表达更加丰富且高度保守,这一事实使它成为一个更好的候选基因,但它实际上是一种免疫原性较差的蛋白质。我们的结果特别强调了抗E6蛋白/肽疫苗的潜力。然而,结合其他针对肿瘤微环境的调节机制和局部免疫抑制的治疗方法,癌症治疗疫苗的接种才能在临床上取得成功。

人乳头瘤病毒(−)OPC分析显示,在12p23.3BTBD 11与OCC有共同的遗传联系,除了已知的两个危险位点:6p21.32和15q21.2。12p23.3的功能证据是有限的,尽管我们发现BTBD 11变异映射到一个组织特异性的PcG蛋白结合位点和附近的转录起始位点。这表明转录调节的潜在损害增加了上皮性恶性肿瘤的风险。28,29,30。在15q21.2时,rs 10851478对人乳头状瘤病毒(−)口腔癌的发生具有显著的风险效应,而且也倾向于成为Fgf 7成纤维细胞基因特异性。Fgf 7是一种强有力的上皮细胞特异性生长因子,在上皮细胞的形态发生中起着重要作用,提示该变异是肿瘤基质中的恶性肿瘤因子之一。31,32.

目前研究的一个局限性是一些分析的样本规模相对较小。然而,包括丰富的数据收集部分弥补了这一限制。对于HPV(+)OPC,来自不同方法(GWAS和pQTL)的联合证据显示HLA中相同的变异是与HPV感染相关的最佳变异。对于HPV(-)癌,使用具有潜在遗传联系的第二个数据集所赋予的统计能力使我们能够支持发现更多的全基因组显着的SNP。

总之,本研究的结果对于理解口腔和OPC的生物学有着重要的意义。虽然我们需要进一步的功能分析来证实我们的发现的影响,但我们提供了关于相关基因变异可能产生的后果的广泛信息,这些变异为人类乳头瘤病毒(−)和人乳头瘤病毒(−)和癌组织提供了一套丰富可行的基因靶点和功能跟踪的生物学机制。特别是,我们的发现增强了HLA变异在HPV(+)OPC免疫发病机制中的作用,并可能对目前正在进行临床评估的HPV靶向疫苗等癌症免疫治疗产生影响。


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