BRCA 2抑制DNA损伤后复制叉的进展
为了探讨BRCA 2在DNA复制中的作用，我们检测了缺失BRCA 2的U2OS细胞的叉伸长率(图2)。1A)用DNA纤维法，用胸腺嘧啶类似物CldU和Idu标记DNA，标记时间为20 min，用相应的抗体染色观察。1B)。与对照siRNAs处理的细胞相比，BRCA 2缺失的细胞在未受干扰的复制过程中表现出正常的叉状进程。1C)。10 Gy电离辐射(IR)后6h，对照组细胞复制束长度明显下降(图1)。1CBRCA 2缺失细胞的束长也明显缩短，但明显长于对照细胞(图1)。1C)。我们随后进行了一个时间过程实验，以评估有或不含BRCA 2的细胞在10或2Gy IR后的进展动力学，而BRCA 2缺失的细胞在IR后的所有时间点(1、3和6h)都显示出明显的长束长度(图1、3和6 h)。1D，e).
图1：BRCA 2抑制DNA损伤后复制叉的进展。aWesternblots显示2种不同的对照和3种不同的BRCA 2 siRNAs作用于U2OS细胞中BRCA 2的表达水平。类似的结果n=3项独立实验。b标记方案和具有代表性的DNA纤维分析图像。c对照组和BRCA 2 siRNA作用于U2OS细胞10 Gy和10 Gy后6h的Idu标记复制区长度。d–f对照组(NSC 1)和BRCA 2(1949)siRNAs处理U2OS细胞后1、3、6h的复制束长度d)，2 Gy红外线(e)，或10毫克博莱霉素(BLEO)(f). gDMSO、BLEO(1M)、MMS(50 M)、CPT(1M)和HU(50 M)连续作用6h后，对照组和BRCA 2细胞的复制束长度。h人BRCA 2 cDNA重组U2OS、VC8和VC8细胞中BRCA 2和MCM 10的表达水平。我，j10 Gy照射前后VC8和VC8+BRCA 2细胞复制束长度i)或BLEO治疗后6小时(j)。数据(c–g)和(i, j)表示为平均±标准差(S.D.)，每列下面显示的点数。类似的结果来自n=2项独立于生物的实验。P值是使用双尾未配对学生的t测试一下。源数据作为源数据文件提供。
其次，我们研究了BRCA 2丢失对放射治疗性DNA损伤剂博莱霉素(BLEO)诱导的DNA损伤后叉子进展的影响。对照组和BRCA 2缺失的U2OS细胞接受高浓度(10μM)的短脉冲(1h)或低浓度(1μM)的持续处理(6h)。在这两种情况下，BRCA 2缺失的细胞中再次出现了抑制性叉状细胞的进展(图1)。1F，g)。另外，我们还测试了甲甲烷磺酸盐(MMS)、拓扑异构酶I抑制剂喜树碱(CPT)和羟基脲(Hu)连续处理后的进展情况，前者是一种导致碱基破坏的烷基化剂，后者是一种产生共价DNA-蛋白质结合物的拓扑异构酶I抑制剂，而羟脲(Hu)则耗尽了导致复制应激的细胞核苷酸库和复制叉处的ssDNA。同样，虽然这三种药物都导致对照细胞和BRCA 2细胞的FRACK速度显著降低，但后者在三种药物治疗后的复制范围都较长(如图所示)。1g)。这些发现表明BRCA 2在DNA损伤和/或复制应激后抑制叉子进展的作用是普遍的，而不是特定于IR和放射模拟剂。
为了进一步证实BRCA 2在抑制DNA损伤后叉子进展中的作用，我们分析了双等位基因BRCA 2突变的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株VC8细胞中的叉子进展。6用人BRCA 2 cDNA重组相同的细胞7(无花果)氢)。在未受干扰的复制过程中，BRCA 2在VC8细胞中的重新表达对叉子速度没有任何影响，但在IR或BLEO处理后，BRCA 2的表达显著缩短了复制束的长度(如图2所示)。1I，j)。综上所述，这些结果表明BRCA 2抑制DNA损伤后复制叉的进展。
BRCA 2抑制引物聚合酶(PrimPol)介导的DNA损伤后的申述
DNA损伤后缓慢的叉状进展可能是几种不同的机制所致。首先，我们考虑叉反转，因为有缺陷的叉反转会导致更高的整体叉速度。21。虽然BRCA 2保护(失速和)倒叉，但它本身并不是叉子倒转所必需的。8,9,10。几个叉子重塑因素，包括HLTF22、SMARCAL 123，以及ZRANB 321是形成倒叉所必需的。因此，我们使用siRNAs下调这些叉子重构因子(图1)。2A在BRCA 2存在或不存在的情况下，测量对叉子进展的影响。而这些因素的丢失对未照射细胞的叉子进展没有任何影响(图1)。2B)，每一种物质的消耗导致辐照细胞的整体分叉速度更高(如图所示)。2C)，表明叉的反转确实导致了叉在DNA损伤上的减速。这些因素与BRCA 2的共耗导致叉速进一步增加，主要表现为加性效应(图二)。二维空间)。这些结果证实了在没有BRCA 2的情况下，叉子反转正常工作，更重要的是，它们表明BRCA 2缺失的细胞中叉子进展的增加是由一种不同的机制引起的。
图2：BRCA 2在DNA损伤后抑制了PrimPol介导的斥责和ssDNA间隙的形成。aWesternblots显示siRNA介导的U2OS细胞中HLTF、SMARCAL 1和ZRANB 3的缺失。每个基因使用两个siRNAs。类似的结果n=3项独立实验。b, c在缺乏BRCA 2、HLTF、SMARCAL 1或ZRANB 3的U2OS细胞中复制束长度(b)或6小时后(c)10 Gy的IR。dU2OS细胞与HLTF、SMARCAL 1或ZRANB 3共缺失BRCA 2细胞，10 Gy IR后6h复制束长度。eWesternblots显示两种不同siRNAs的PrimPol缺失水平。类似的结果n=3项独立实验。f单用PrimPol的U2OS细胞中复制束长度在10 Gy前和10 Gy后6h分别与PrimPol和BRCA 2共缺失。gS1核酸酶处理对对照组和BRCA 2缺失U2OS细胞10 Gy后6h复制束长度的影响。h在U2OS细胞中，加入BRCA 2、HLTF、SMARCAL 1或ZRANB 3单独或与PrimPol联合作用于10 Gy IR后6h内复制束长度。数据(b–d)和(f–h)表示为平均值±S.D.，每列下面所示的点数。P值是使用双尾未配对学生的t测试一下。源数据作为源数据文件提供。
最近的研究已经建立了引物聚合酶(PrimPol)。24，它具有修复损伤下游DNA合成的活性，是dna损伤后复制叉进程的关键调节因子。25。最近的一项研究还表明，PrimPol是在顺铂治疗后诱导的，促进了病变的跳跃，防止了BRCA 1缺陷细胞的叉状逆转和降解。26。因此，我们询问PrimPol是否对IR后BRCA 2缺乏症细胞所观察到的低约束叉子的进展负责，因为训斥和病变跳过会防止叉子停滞，从而增加叉子的进展。SiRNA介导的单用PrimPol在IR前后对叉速度的影响不大。2E，f然而，当PrimPol与BRCA 2共耗尽时，BRCA 2丢失引起的叉子的增加完全逆转(图1)。2F)。野生型(WT)PrimPol在共贫化细胞中的瞬时重新表达恢复了IR后叉子进程的增加，而CH(Primase Death)和Axa(催化死亡)突变体则恢复了其在IR后的增长。27两人都没有这样做(附图)。1这意味着PrimPol的蛋白酶和聚合酶活性都是BRCA 2缺失细胞DNA损伤后复制叉进程受到抑制所必需的。
PrimPol通过修复DNA合成在复制DNA上产生ssDNA间隙，这是由于病变旁路的结果。25。因此，我们进行了一种改良的dna纤维分析，其中细胞经胸苷类似物标记后，用ssdna特异性s1内切酶处理细胞。28。在此分析中，任何经S1处理后标记DNA片段的缩短都将成为ssDNA间隙存在的证据。事实上，照射后的BRCA 2细胞经S1核酸酶处理后，复制域明显缩短，而转染对照siRNAs的细胞中，S1处理没有引起任何改变(图1)。2G)。此外，在缺乏BRCA 2和PrimPol的细胞中，S1核酸酶处理也没有产生任何差异。2G)。这些结果清楚地显示了IR后BRCA 2缺失细胞中ssDNA间隙的形成，进一步表明PrimPol介导的申述是BRCA 2缺失细胞在DNA损伤后的欠约束叉状突起的基础。
最后，我们测试了在IR后缺乏HLTF、SMARCAL 1和ZRANB 3的细胞中，PrimPol介导的申述是否有效。我们发现在IR后，PrimPol与这三个因素中的每一个共同消耗都能显着地逆转叉子的增加(图1)。2H)。这表明，在没有叉子逆转的情况下，在DNA损伤后，PrimPol的斥责有助于增加叉的进展；换句话说，叉反转阻止PrimPol被招募和/或在损坏的叉子上行动。
BRCA 2基因损伤后PrimPol丢失对基因组稳定性和细胞活力的影响
为了确定PrimPol和Repriming在BRCA 2缺陷细胞基因组稳定性中的作用，我们单独和组合地耗尽了这两种蛋白质(图1)。3A)，在U2OS细胞中分析有丝分裂的传播情况。3B)基因组不稳定。在没有外部DNA损伤的情况下，缺乏PrimPol或BRCA 2的细胞均表现出明显的基因组不稳定性，主要表现为染色单体断裂(CTB)，与对照siRNA相比(见图)。3C)。在PrimPol-和BRCA 2-缺失细胞中也检测到少量的染色体断裂(CSB)，而几乎没有观察到径向染色体。IR(2Gy，6h)后，所有细胞的基因组不稳定性升高，PrimPol-和BRCA 2-缺失细胞的基因组不稳定性水平仍高于对照细胞(图1)。三维空间)。有趣的是，在IR之前，缺乏PrimPol的细胞比BRCA 2缺乏的细胞含有更多的CTB，而在IR之后则更少。这表明，在未受干扰的细胞中，PrimPol产生的ssDNA间隙会导致比BRCA 2缺失的细胞更多的DSB无法修复DSB，而在辐射引起的DNA损伤后，HR介导的DSB修复的丢失对细胞中未修复的DNA断裂的数量有更大的影响。此外，与辐射前相比，PrimPol和BRCA 2的联合丢失导致CTB进一步增加，但与辐射后的BRCA 2相比，CTB减少。这表明，这两种蛋白的丢失对未受干扰的细胞可能是加性的，而辐射后，PrimPol的丢失及其引起的重新启动和ssDNA形成的损失可能防止DNA断裂(在ssDNA的区域)，从而减少CTB。在辐照细胞中，CSB的水平仍远低于CTB的水平，但似乎与CTB的趋势相同。辐射还导致少数径向染色体的形成，BRCA 2丢失导致这种形式的染色体异常增加，而PrimPol缺失几乎没有作用(图1)。三维空间).
图3：在BRCA 2熟练和缺乏的细胞中，PrimPol丢失对DNA损伤后基因组稳定性和细胞活力的影响。aWesternblots显示U2OS细胞中siRNA介导的BRCA 2、PrimPol或BRCA 2+PrimPol的缺失水平。类似的结果n=3项独立实验。b吉姆萨染色后有丝分裂扩散的一种有代表性的图像，显示不同形式的异常染色体。CTB，染色单体断裂；CSB，染色体断裂；径向，径向染色体。c, d对照、BRCA 2、PrimPol或BRCA 2+PrimPol siRNAs对U2OS细胞染色体畸变的定量研究c)或在2Gy的红外线照射后6小时(d)。数据以平均±S.D表示。从…n=3项独立实验。e–h上述siRNA处理细胞对IR的敏感性(e)，BLEO(f)，MMS(g)，以及CPT(h)。72h后测定细胞活力。结果为平均±S.D。从…n=3项独立实验，每项实验以技术三阶段进行。源数据作为源数据文件提供。
最后，我们分析了上述细胞对IR、BLEO、MMS和CPT的敏感性。三维空间)。正如预期的那样，BRCA 2的丢失导致对所有四种dna损伤剂的敏感性增加，而PrimPol的耗尽则没有显示出任何效果，这与以前的报告一致。29,30。值得注意的是，PrimPol与BRCA 2的共耗导致BRCA 2缺失的细胞对辐射和博莱霉素过敏，而不是MMS和CPT，这表明PrimPol或ssDNA在某些类型的DNA损伤后对细胞的敏感性有促进作用，这有待于充分确定。
MCM 10作为BRCA 2结合蛋白的鉴定
我们曾经使用串联亲和纯化(TAP)结合质谱(MS)来鉴定PALB 2的新的结合伙伴。PALB 2是一种主要的BRCA 2结合蛋白，是它的染色质结合、dna损伤诱导的病灶形成和HR活性所必需的。31。这些努力导致了BRCA 1和Keap 1作为PALB 2结合蛋白的鉴定。32,33。然而，在先前的实验中，单个条带或凝胶切片被MS分析，导致不完全识别复合物的成分。为了进一步鉴定PALB 2复合物的新成分，我们重新进行了纯化，并对复合物的全部内容进行了MS分析。如图所示。4A，除了已知的交互行为者，如BRCA 2、BRCA 1(及其密切合作伙伴BARD 1)、Keap 1、RAD 51、MRG 15和MRGX34，我们的新的TAP-MS分析确定HNRNPM、LMNA和MCM 10为PALB 2复合物的候选新成分。我们决定把重点放在mcm 10上，因为它是dna复制的基本因子。13.
图4：鉴定MCM 10为BRCA 2-矿化蛋白.a从两个独立的PALB 2串联亲和纯化(TAP)-LC-MS/MS实验中得到的胰蛋白酶肽的数目。b内源性PALB 2和BRCA 2与异位MCM 10的共IP。标志-HA标记的MCM 10在293 T细胞和IPED中瞬时过表达。cU2OS细胞内源性MCM 10和内源性PALB 2和BRCA 2的共IP效应。dGFP标记的BRCA 2变异体和标志-HA标记的MCM 10共ip在293 T细胞中过表达.e内源性BRCA 2与异位标志-HA标记的MCM 10的关联。手术按以下方式进行：b)除了最后的IP材料在珠子上用DNase I处理，然后清洗后再进行西方印迹。fDMSO处理后3h，BRCA 2和MCM 10在S期同步U2OS细胞中共IP，IR 10 Gy，IR 2Gy，BLEO(1M)，CPT(1M)或顺铂(CDDP，1M)。细胞在S期以单一的胸苷阻滞同步24h，在处理前释放2h。为(b–f)，类似的结果在n=3项独立实验。源数据作为源数据文件提供。
为了证实MCM 10与PALB 2之间的联系，我们将人MCM 10 cDNA克隆到标志-HA双标记载体中，瞬时表达和免疫沉淀(IPED)，并检测沉淀中内源性PALB 2和BRCA 2的存在。事实上，PALB 2和BRCA 2都很容易被检测到(如图所示)。4B)。然后，IPED内源性MCM 10，并再次检测到PALB 2和BRCA 2在沉淀中(图1)。4C)。因此，MCM 10是PALB 2/BRCA 2复合物的真正组分。HU处理对MCM 10与PALB 2/BRCA 2的结合无明显影响，但可触发PALB 2磷酸化。
鉴于已知的BRCA 2在DNA复制中的作用以及相对大量的BRCA 2与PALB 2相关，我们询问MCM 10实际上是否与BRCA 2相互作用。为此，我们测试了由病人衍生的BRCA 2变异体在plb 2结合基序中的表现。31因为他们有能力与MCM 10联系在一起。如图所示。4EMCM 10不仅与PALB 2结合中性变异体(F12V和I27V)，而且与缺陷变异体(G25R、W31R和W31C)共同IP，表明它确实与BRCA 2独立于PALB 2结合。为了排除BRCA 2-MCM 10的结合可能是由细胞裂解液中的DNA介导的，我们在IP完成后用DNaseⅠ处理了反旗珠上的IPED材料，并且保持了完整的结合(图1)。4E)。为了研究DNA损伤对DNA复制过程中MCM10-BRCA 2结合的影响，我们在S期同步细胞，将其暴露于IR、BLEO、CPT和顺铂(一种交联剂)中，然后用BRCA 2 IP进行分析。结果表明，在这些药物引起DNA损伤后，这种联系基本没有改变(如图所示)。4F).
MCM 10的N端盘管模体是BRCA 2结合所必需的。
为了确定MCM 10与BRCA 2相关的结构元件，我们首先在Myc-MCM10-GFP载体中产生了跨越整个MCM 10编码序列的6个缺失序列(补充图)。2A)并执行瞬时过表达和IP-West。令人惊讶的是，在所使用的条件下，BRCA 2被发现与所有六种缺失蛋白共同IP(附图)。2B)。这很可能是一个人造产物，因为蛋白质是在非常高的水平上表达的。正如我们所研究的那样，BRCA 1-PALB 2协会是由它们各自的盘绕线圈(Cc)基序介导的。35然后，我们采取了一个候选的方法，并集中在N-末端，其中包含一个保守的CC模体(图)。5A)。删除此基序将取消BRCA 2与MCM 10的共同IP，表明它们之间的关联是必需的(如图所示)。5B)。据报道，非洲爪蟾MCM 10介导它的二聚体/寡聚，并且保守的疏水残基突变使这种自缔合消失。36。因此，我们在人类MCM 10中产生了相应的突变，并测试了它们对BRCA 2结合的影响。事实上，2D(L114D/L118D)和4A(L114A/L118A/M125A/L128A)突变都导致BRCA 2结合缺失(图1)。5B)。因此，MCM10-MCM 10和BRCA2-MCM 10的结合似乎都涉及到相同的残基。此外，我们还测试了2A(l114A/l118a)突变，该突变对mcm 10的自关联没有影响。36。有趣的是，这一突变也废除了BRCA 2与MCM 10的关联(图1)。5B).
图5：BRCA2-MCM 10结合抑制DNA损伤后复制叉的进展。aMCM 10结构域原理图和MCM 10 N端盘管(CC)基序的氨基酸序列比对。b内源性BRCA 2与标志-HA标记的MCM 10蛋白在293 T细胞中瞬时高表达。c稳定表达标志-HA标记WT和CC突变型MCM 10蛋白的U2OS细胞系中外源MCM 10蛋白与内源性BRCA 2的表达水平及其相关性。为(b)和(c)，类似的结果在n=3项独立实验。d–fU2OS细胞在10 Gy IR前或6 h内选择性表达外源WT或突变型MCM 10蛋白的复制束长度(英文)d)，2Gy后3h(e)，或使用DMSO(车辆)或1M BLEO连续处理6小时后(f). g上述细胞在IR前和IR后的复制束长度，用DNA结合法测定。左边显示有代表性的梳状图像。h上述细胞中停滞复制叉的稳定性。测定方案在顶部显示，经HU处理后的Idu/CldU束长比如下。数据(d–h)表示为平均值±S.D.，每列下面所示的点数。P值是双尾未配对学生的t测试一下。类似的结果来自n=2个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
BRCA 2-MCM 10结合抑制DNA损伤后复制叉的进展
为了确定BRCA 2-MCM 10结合在DNA复制中的作用，我们构建了稳定的表达MCM 10-WT、MCM 10-ΔCC或MCM 10-2A的U2OS细胞系。5C)。在此背景下，MCM 10-ΔCC仍基本不能与BRCA 2结合，而2A突变体表现出显著的残留关联。然后，我们用两个siRNAs池对其mRNA的3‘-UTR(补充图)耗尽稳定细胞系中的内源性MCM 10。3)和测量由外源蛋白支持的复制叉的进程。在未受干扰的复制过程中，细胞间无显着性差异(见图)。5D然而，在IR或BLEO引起DNA损伤后，有选择性地表达任何一个突变型MCM 10蛋白的细胞表现出抑制性的叉状进程(图1)。5D-f).
为了证实上述发现，我们进行了DNA组合分析，在相同的条件下，DNA分子将比在DNA纤维分析中得到更充分的拉伸。如图所示。5GDNA结合法检测的复制区比纤维法长2~2.5倍，表达WT的细胞与突变型MCM 10蛋白的差异更大。此外，表达MCM10-2A的细胞的复制域明显长于表达WT蛋白的细胞，但明显短于表达ΔCC突变体的细胞，这一表型与BRCA 2结合能力的部分丧失相一致。综上所述，上述结果提示BRCA 2通过与MCM 10的联系，在DNA损伤后抑制叉子的进展。
为了排除表达突变型MCM 10蛋白的细胞中可能是由于MCM 10二聚体/寡聚体或CC基序的其他功能受损，我们在上述稳定的细胞中与内源性MCM 10共缺失BRCA 2，并利用DNA纤维分析法分析了MCM 10基因的表达。在此条件下，表达WT的细胞与突变型MCM 10蛋白之间不再存在差异。5D)。此外，内源性BRCA 2的缺失并没有进一步加速稳定表达突变型MCM 10蛋白的细胞的叉子生长。因此，BRCA 2与MCM 10的CC基序之间的联系抑制了DNA损伤后的进展。
由于BRCA 2对于停滞的复制叉的稳定性是必需的，我们接下来询问它与MCM 10的关联是否有助于它的分叉稳定功能。我们标记上述细胞选择性表达外源WT和突变的MCM 10蛋白，用HU处理，然后测定CldU和Idu标记区域的长度(图)。5H)。以缺失BRCA 2的空白U2OS细胞为阳性对照。BRCA 2的丢失导致HU处理后新合成的DNA片段大量缩短，表明停止的叉子退化，而失去BRCA 2-MCM 10结合则没有影响(图1)。5H)。因此，BRCA 2和MCM 10之间的联系是细胞在DNA损伤后抑制复制叉的过程所必需的，但在停滞时不参与叉的稳定。
BRCA 2-MCM 10联合作用防止DNA损伤后PrimPol介导的斥责
最后，我们询问BRCA 2抑制PrimPol介导的斥责的功能是否取决于它与MCM 10的关系。我们在上述表达WT或MCM 10 CC突变体的稳定细胞系中与内源性MCM 10一起耗尽了PrimPol(补充图)。3)和测量复制域的长度。单用PrimPol对未受扰细胞的叉子生长没有影响，但能明显逆转IR后表达MCM 10突变体的细胞数量的增加(图1)。6A)。此外，S1核酸酶处理也减少了表达突变型MCM 10蛋白的细胞的束长，而对表达WT蛋白的细胞没有任何影响。6B)。这些结果表明BRCA 2通过与MCM 10的结合，通过抑制PrimPol介导的斥责和损伤而抑制DNA损伤后的叉子进展。
图6：BRCA2-MCM 10的结合抑制了DNA损伤后PrimPol介导的斥责和ssDNA间隙的形成。aPrimPol耗竭对稳定的U2OS细胞复制叉进程的影响在IR前后有选择地表达外源WT与ΔCC突变的MCM 10蛋白。内源性MCM 10与PrimPol一起被靶向其mRNA 3‘-UTR的siRNAs所耗尽。bS1核酸酶处理对IR后上述细胞复制束长度的影响。数据(a)和(b)表示为平均值±S.D.，每列下面所示的点数。P值是使用双尾未配对学生的t测试一下。类似的结果n=2个独立实验。c提出了BRCA 2和BRCA 2-MCM 10在DNA损伤后复制叉进程中的作用模型。BRCA 2通过与MCM 10的关联被招募到复制叉中。当叉子遇到病变时，聚合酶ε停止，而MCM2-7螺旋酶复合物继续解离下游DNA，导致过量的ssDNA形成。RPA与ssDNA结合，并可能招募PrimPol；然而，BRCA 2阻止了PrimPol的招募，而BRCA 2可以取代ssDNA中的RPA。当BRCA 2丢失或BRCA 2-MCM 10结合受到破坏时，rPA在ssDNA上的增加和(或)持续存在将导致PrimPol的发生，从而引起损伤下游DNA合成的重新启动和ssDNA间隙的形成。详情见文本。
