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局部胶束介导环核苷酸抑制治疗黑色素瘤的研究

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发表时间:2021-10-15 12:48作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

黑色素瘤中的酸性肿瘤微环境通过上调肿瘤浸润单核细胞中的环磷酸腺苷(CAMP)来促使免疫逃逸。在这里我们证明了腺苷酸环化酶(AC)抑制剂的无毒浓度从聚肌氨酸释放-块-聚L-谷氨酸γ-苄基酯共聚物胶束恢复抗肿瘤免疫。结合选择性、非治疗性调节性T细胞衰竭,AC抑制剂胶束可完全缓解已建立的B16-F10-OVA肿瘤。黑色素瘤浸润免疫细胞的单细胞测序结果表明,AC抑制剂胶束减少了抗炎髓样细胞的数量和T细胞上检查点受体的表达。因此,AC抑制剂胶束是对抗黑色素瘤免疫逃逸的一种免疫治疗措施。

导言

癌细胞起源于基因的积累和细胞调控过程的丧失。1。由于基因的改变,肿瘤细胞可以表达区别于正常组织的新的抗原模式。2,并引发对它们的免疫反应。3,4。因此,临床检测到的癌症通过免疫逃逸机制可以避免或抵抗有效的免疫攻击。5,6和/或免疫抑制7,8.

许多方法都试图提高或恢复对癌症免疫反应的有效性,其中最显著的是检查点抑制剂。9。然而,肿瘤微环境中主要的耐受机制限制了免疫治疗方法的有效性。因此,有必要破译和逆转肿瘤免疫抑制,以改善免疫治疗。

核苷酸信号分子是所有生命形式代谢和基因表达的普遍调节因子。在免疫系统中,细胞内环磷酸腺苷(CAMP)水平升高。10抑制先天和适应性免疫细胞功能11,12。调节性T细胞(Treg)利用这一效应通过cAMP传递抑制其他免疫细胞。13,14。可能是由于类似的机制,黑色素瘤中cAMP水平的升高与黑色素瘤的生长、免疫抑制和转移有关。15,16,17,18。在详述cAMP在黑色素瘤免疫抑制中的作用时,我们最近观察到人和小鼠黑色素瘤会使其微环境酸化,从而提高肿瘤浸润的单核/巨噬细胞内cAMP的水平,从而抑制其抗肿瘤活性。19.

综上所述,上述观察证实cAMP通路是治疗黑色素瘤生长的一个有吸引力的靶点,但其无数的生理功能阻止了对该途径的系统干预。

在本研究中,我们发现核苷酸环化酶抑制剂mdl-12,330 a。20可与聚吡咯烷酮(O)ide胶束结合21,22,23,24,25,26,27,28在黑色素瘤中不断地从他们身上释放出来。与游离药物相比,MDL胶束无毒,能有效抑制肿瘤组织中cAMP的形成和黑色素瘤的生长。用胶束介导的核苷酸环化酶抑制肿瘤生长需要一个完整的免疫系统,并与多个瘤内免疫细胞群的数量和功能变化有关。结合偶然的非保护性耗尽Treg,胶束介导的cAMP抑制导致肿瘤完全缓解。

结果和讨论

聚吡咯烷酮(O)ide胶束的合成与表征

两亲性嵌段共聚物(O)IDES(Psar)195--pGlu(海外国民)25)通过序贯亲核开环聚合法合成了相应的α-氨基酸N-根据Birke等人的说法,碳酸酐(NCA)。23。嵌段共聚物分子量为32.5kg/mol,分散性为1.15标记控制聚合(附图)。1)。嵌段co(polypept(O)ides)具有较低的细胞毒性,不引起免疫刺激作用。22.

MDL-12.330A(MDL)不可逆地抑制所有腺苷酸环化酶29。为了制备MDL负载胶束,对两亲嵌段共聚酯(O)IDES进行了双离心(卡通图).1)30在一种等量药物的存在下,然后通过自旋过滤净化。这种可扩展的方法允许在高剪切条件下快速制备负载胶束,而无需使用有机溶剂,在密封的小瓶中进行无菌处理。所得到的胶束含有9%的药物负荷,用反相高效液相色谱法测定.260%的MDL最终形成胶束,相当于60%的负载效率。相比较而言,溶剂交换载药量仅为<1%。冻干或50~150 mg/mL载药胶束水溶液贮存于4℃,保存数月,无失活。

图1:MDL负载聚醚(O)ide胶束性能。
figure1

聚吡咯烷酮(O)ide胶束合成和缓蚀剂负载的原理图表示。AMdl负载胶束在1mg/mL和1mg/mL下的冷透射电镜图像B采用高斯模糊效应和ImageJ进行优化对比度放大,提高电晕层的可见性。C离心后直接测定空胶束(nl-PM,蓝色)和负载胶束(L-PM,红色)未过滤溶液的单角度dls测量(n直径差异无统计学意义P=0.69(未配对Mann-Whitney检验,双边,0.95置信区间,显着性水平0.05).DL-PM的多角度DLS数据的验证和备份Zetasizer数据.E不同浓度L-PM或NL-PM胶束孵育4h后,小鼠B16细胞内cAMP水平受到剂量依赖性抑制。结果为平均±扫描电镜,n=每次治疗/剂量3次,*P=0.003(66平方毫米)(未配对)t-用Holm-Šídák测试-校正Pα=0.05,0.95置信区间)。NS=无意义。的每一个图像和图n=3项独立实验。

MDL-负载胶束(L-PM)的平均粒径约为76 nm,而非负载胶束(NL-PM)的水动力直径为98 nm(如图所示)。1A-D)。这表明,该药物增强了两亲性嵌段共聚物的相分离,表明在其存在下存在有序的胶束结构。低温透射电镜分析表明,球状胶束的平均直径分别为61±12 nm。它还证实了一个电子散射对比度较高的核,其周围有一个不太致密的电晕,说明疏水段和药物形成了致密的核心,而亲水性的多聚肌氨酸团则形成了电晕。多角度动态光散射(DLS)数据与Zeta Sizer和Cryo-TEM结果一致,与窄分布球形胶束的结果一致.表1总结了胶束的特性。

表1 MDL负载和非负载聚pept(O)ide胶束的表征。

B16黑色素瘤细胞内cAMP水平明显升高19允许抑制剂介导的减少很容易被确定。为了检测MDL负载胶束释放腺苷酸环化酶抑制剂的能力,我们用不同数量的MDL负载(L-PM)或非负载(NL-PM)聚PEPT(O)ide胶束孵育B16黑色素瘤细胞,并测定其胞内cAMP水平。L-PM(而不是NL-PM)以剂量依赖性的方式降低了培养的B16黑色素瘤细胞内cAMP水平超过75%(图1)。1E),证明是一种有效的抑制剂释放。

聚吡咯烷酮(O)ide胶束的瘤周滞留

MDL负载的胶束被设计成在肿瘤组织局部释放抑制剂,并在酶衰变时由机体排出或代谢。原发性皮肤黑色素瘤容易获得,因此可以测试局部治疗方法。

纳米粒子在组织中的滞留和渗透取决于它们的大小、形状和表面化学,但不能从它们的化学性质来预测。31。为探讨Ppept(O)ide胶束对黑色素瘤的保留作用,我们在B16F10-OVA黑色素瘤的瘤周注射俄勒冈绿标记的L-PM胶束,在C57BL/6小鼠皮下生长14天,并在1和24h后分析染料在不同组织中的分布。这些粒子被注射在瘤周,而不是在瘤内,用注射液包围肿瘤,而不会造成组织损伤(图)。2A)。生命内显微镜显示,瘤周注射胶束保留在肿瘤周围的结缔组织中,不进入中心肿瘤团(如图所示)。2A和补充电影1)。瘤周注射后1小时内,颗粒染料几乎完全保留在肿瘤组织中,并被CD 45吸收。+免疫和非造血CD 45内格细胞(图1.2B和补充图。4A)。在免疫细胞中,胶束与髓系(CD11b)选择性地相互作用。+)细胞(图1.2B)。只有在较长一段时间后(24小时),肾脏中才能发现颗粒结合的荧光(如图所示)。2B)主要存在于非造血细胞中。根据低于肾阈值的单个聚合物或聚合物碎片的水动力直径(Rh=1.5-3 nm),后一种观察显示肾清除率32。L-PM一直被用于保留数字。载载FDA批准的近红外荧光剂吲哚青绿(ICG)的胶束也证实了瘤周注射后局部滞留(补充图)。5).

图2:瘤周注射MDL负载聚合物胶束的影响及分布。
figure2

A瘤周注射。左图:小鼠瘤周注射伊文思蓝后出现B16黑色素瘤的图像,注射部位用箭头指示,去除皮毛以获得更好的可见度;右图:肿瘤周围注射俄勒冈绿(OG)标记胶束后肿瘤边缘的共焦显微图像。B瘤周注射OG标记的L-PM胶束后第14天B16-OVA黑色素瘤时,不同器官OG标记细胞的频率。有代表性的流式细胞仪图,数字代表门的细胞频率。淋巴结(n=6(1小时)和n=每个器官3(24小时),所有比较*P < 0.001 (parametric one-way ANOVA, with Holm–Šídák’s multiple comparisons test, alpha = 0.05, 0.95 confidence interval). C瘤周注射第14天黑色素瘤后1,4 h,肿瘤组织中的胶束(NL-PM,蓝色;L-PM,红色),游离抑制剂(MDL,灰色)和溶剂(DMSO,白色)毒性。小提琴图显示死亡CD 45的中值、四分位数范围、最小和最大值(截断在最大值和最小值以下)。内格CD 29+肿瘤细胞n=每次治疗5次,*P=0.00099(1小时)*P=0.00099(4 H)ns=无显着性(参数单向方差分析,用Holm-Šídák的多重比较检验,α=0.0 5,0.95置信区间).D在瘤周注射溶解于DMSO、L-PM(10 G MDL)或NL-PM(与L-PM相同数量的颗粒物质)10 g MDL后14d B16-OVA黑色素瘤组织细胞内cAMP水平。数据显示为平均值±扫描电镜,n=每次治疗3次,*P=0.006(nl-PM对L-PM,4小时),*P=0.00099(nl-PM对L-PM,1 h),*P=0.00099(mdl对nl-PM,1h)(参数单向方差分析,用Holm-Šídák的多重比较检验,α=0.0 5,0.95置信区间).所有的数字和图表都代表着三个独立的实验。

为了验证胶束介导的cAMP抑制剂给药的安全性,我们还测定了瘤周注射第14天黑色素瘤死亡细胞的频率。作为比较,我们给第14天的黑色素瘤注射了NL-PM,L-PM,一种游离药物,或其溶剂(DMSO)。膜联蛋白V/7-氨基放线菌素(7-AAD)和细胞表面标记染色在注射后1和4h显示部分死亡(CD 45)。内格CD 29+)注射高剂量游离药物(10μg)后的黑色素瘤细胞。相反,名义上相同的胶束剂量仍然是无毒的(如图所示)。2C和补充图。4B)。这一观察表明,胶束的使用避免了抑制剂的毒性作用。

Mdl负载(O)ide胶束对黑色素瘤cAMP的抑制作用

局部给药后瘤周荧光的保留表明,颗粒设计支持局部药物的释放。然而,颗粒结合的俄勒冈绿的测量并没有记录cAMP抑制剂MDL的命运.为了确定MDL载药胶束在体内的释放情况,我们将游离药物和胶束注射到第14天黑色素瘤中,然后在不同的时间点测定瘤内cAMP的水平。注射后1小时内,游离药物和抑制剂胶束均能降低B16黑色素瘤细胞内cAMP水平。然而,随着游离药物的使用,肿瘤内cAMP水平在4小时后恢复到未治疗肿瘤的水平,而抑制剂负载的胶束使肿瘤内cAMP水平下降(图1)。二维空间),这表明胶束释放MDL可以提高其局部可用性。

Mdl负载的聚吡咯烷酮(O)ide胶束对黑色素瘤生长的抑制作用

为了保证持续抑制肿瘤组织中cAMP的形成,我们每隔2天注射胶束药物制剂,从肿瘤开始(接种后第4天)开始。注射mdl负载胶束的小鼠接受200 M总药物含量(根据HPLC定量,见附图)显示黑色素瘤生长明显减少(见图)。3A)。Mdl负载的胶束抑制肿瘤生长的剂量依赖于10倍的减胶束抑制剂剂量的无效(补充图)。6A),比免费药物更有效(附图)。6B)。CAMP抑制对肿瘤的生长没有明显的副作用,无论是细胞毒性(图1)。2C)动物的不适。我们还进行了在肿瘤接种后第6天开始注射胶束的实验。L-PM以延迟的方式抑制肿瘤的生长(补充图)。5C),在更成熟的肿瘤中显示出治疗效果。

为了缩小可能的靶细胞范围,我们在缺乏适应性免疫细胞的破基因敲除小鼠上进行了实验。与免疫活性小鼠相比,负载抑制剂的胶束不影响B16黑色素瘤的生长。3B)。因此,根据OG标记胶束的荧光分布,免疫浸润对于观察到的抗肿瘤作用是必不可少的。

图3:载药胶束抑制黑色素瘤生长。
figure3

瘤周注射MDL负载胶束对B16黑色素瘤生长的抑制作用AC57BL/6小鼠BB6.RAG−/−C老鼠。小鼠接种S.C。用B16-OVA肿瘤细胞,从接种后第4天起,每隔一天接受一次瘤周胶束注射。A三个独立实验的代表性结果:平均值±扫描电镜,Ctrl(白色)n=5,L-PM(红色)n=6,NL-PM(蓝色)n=5,*P=0.000988(第9天)、*P=0.000989(第11天)、*P=0.00099(第13天)、*P=0.00098(第15天)(参数不成对双面)t-用Holm-Šídák测试-校正Pα=0.05,0.95置信区间)。B三个独立实验的代表性结果为平均值±扫描电镜,n=每组5人,P-数值没有达到统计显着性(参数未成对双面)。t-用Holm-Šídák测试-校正P价值。C一些小鼠在第7、14和18天接受了白喉毒素(DT)的额外注射(箭头)。两个独立实验的代表性结果显示平均值±扫描电镜,Ctrl(白色)n=5,L-PM(红色)n=4,DT(橙色)n=4,DT+L-PM(紫)n=5,Ctrl诉L-PM:*P=0.00098(第15天);Ctrl诉DT:**P=0.007(第12天)、*P=0.00098(第15天);DT与DT+L-PM:*‘p=0.000998(第18天)、*P=0.000997(第20天)、*P=0.00098(第23天)、*P=0.00099(第25天)(参数不成对双面)t-用Holm-Šídák测试-校正Pα=0.05,0.95置信区间)。

Treg/cAMP联合干扰对黑色素瘤的排斥反应

这种无法通过cAMP干扰抑制黑色素瘤生长的现象揭示了适应性免疫细胞在治疗效果中起着至关重要的作用。在适应性免疫细胞中,Treg的区别在于细胞内cAMP水平的升高和通过缝隙连接cAMP传递调节其他免疫细胞的能力。13。在序列中,Treg的特征是FOXP 3诱导PDE3B表达降低。33和增强腺苷酸环化酶9(AC9)活性34,以及,非功能性Treg在Foxp 3-突变的scurfy小鼠港明显降低了细胞内cAMP的水平。35。AC抑制、cAMP特异性拮抗剂的应用或PDE过表达抑制小鼠和人Treg抑制对cAMP形成的药理抑制作用13,36,37,38,39。相反,PDE抑制对cAMP降解的阻断改善了Treg介导的抑制作用。40。此外,在辅助黑色素瘤治疗中使用的干扰素-α通过干扰cAMP的产生来阻断Treg抑制活动。14.

Foxp 3的选择性耗尽+Treg是提高抗肿瘤治疗效果的有效策略。41在人体中去除它们的试剂正在评估中。42,43。因此,我们询问,减少Treg频率是否可以协同胶束cAMP抑制和结合胶束cAMP抑制与实时的,非保护性Treg-耗竭(耗尽调节性T细胞(Deregbac)转基因)小鼠。偶然和不完全的Treg耗竭延缓肿瘤的生长,联合cAMP抑制/Treg缺失则导致肿瘤的完全排斥(图1)。3C)。这表明cAMP抑制作为免疫激活的一种手段与其他免疫刺激或抑制性治疗很好地结合在一起。

胶束瘤周cAMP抑制预防肿瘤免疫细胞功能紊乱

胞内cAMP水平升高降低天然免疫和适应性免疫功能11,12在黑色素瘤浸润的单核/巨噬细胞中诱导一种非炎性表型。19。为了了解胶束cAMP抑制是如何有效地抗肿瘤免疫的,我们对所有的cd 45进行了单细胞水平的mrna表达谱分析。+在胶束治疗的黑色素瘤中肿瘤浸润免疫细胞。经过数据处理,质量控制,随机下采样,2820 CD 45。+每个样本的肿瘤浸润细胞被保存作下游分析(见“方法”一节)。基于IMMGEN数据库的高维空间无监督聚类及后续分类Www.immgen.orgB细胞、树突状细胞(DC)、浆细胞样树突状细胞(PDC)、巨噬细胞/单核细胞(Mono/Macro)、中性粒细胞、NK细胞和T细胞。4A)。进一步的分析揭示了几个免疫细胞群体的数量变化。当B细胞、巨噬细胞/单核细胞和中性粒细胞数量减少时,表达细胞毒性NK细胞相关基因的细胞及与PDC相关的基因也明显增加(图一)。4A).

图4:胶束瘤周cAMP抑制可防止肿瘤免疫细胞功能紊乱。
figure4

A肿瘤体积,实验流程和无监督的细胞聚类。C57BL/6小鼠皮下接种B16-OVA肿瘤细胞,自接种后第4天起每隔一天接受瘤周胶束注射。肿瘤体积为平均±扫描电镜,n=每组10人,nl-PM(蓝色)与L-PM(红色):**P=0.0079(第11天),**P=0.0084(第13天),*P=0.0196(第15天);(参数不成对的双面t-用Holm-Šídák测试-校正Pα=0.05,0.95置信区间)。第15天,CD 45+从肿瘤组织中分离出单细胞,进行单细胞转录谱分析。2D tSNE彩色编码细胞群图和饼图,显示聚集细胞(单核/巨噬细胞,橙色;中性粒细胞,红色;树突状细胞(DC),浅蓝;浆细胞样DC,绿色;自然杀伤(NK)细胞,深蓝色;T细胞,黄色;B细胞,灰色)。BAUC使用抗炎输入基因进行评分(Ptgs 2, VEGFA, EGFR, Arg 1, CCL 22, Ccl 17, IL 10,IL12a)NL-PM或L-PM处理的单核/巨噬细胞和中性粒细胞。*P=0.024,*P=0.001(非参数不成对的双边Mann-Whitney检验)。C热图显示z-标记基因在NL-PM或L-PM(左)处理的T细胞中的平均表达,AUC评分以热图的衰竭标记基因为输入的NL-PM或L-PM处理的T细胞(右)。***P=0.00099(非参数不成对双边Mann-Whitney检验,α=0.0 5,0.95置信区间).数据显示为方框和胡须图。中心线代表中间线,框边代表第25和75百分位数,胡须代表第10和第90百分位数。可通过NCBI基因表达总括(GEO)数据库登录号:GSE 166028访问单细胞RNA-Seq数据。Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE166028].

其次是数量变化,尤其是质的变化可能有助于在瘤周给药时观察到较强的抗肿瘤作用。通过分析与免疫抑制或交替激活状态相关的基因在髓系细胞中的表达,发现Ptgs 2(前列腺素-内切酶2),VEGFA(血管内皮生长因子A),EGFR(表皮生长因子受体),Arg 1(第1条),CCL 22(C-C基序-Chemokine配体22),Ccl 17(C-C基序-Chemokine配体17),伊林(白细胞介素1受体拮抗剂),IL 10(白细胞介素10)和IL12a(白细胞介素12A)在巨噬细胞/单核细胞簇和中性粒细胞集落中的表达(如图所示)。4B和补充图。7).

肿瘤中的免疫抑制性髓系细胞导致T细胞处于功能失调状态,其特征是几个免疫检查点的升高44值得注意的是,瘤周注射L-PM导致LAG 3(LAG 3),CTLA 4(CTLA-4),Pdcd 1(PD-1)和哈弗克2(TIM3)而且,稍微不那么强烈,蒂吉特(T细胞免疫受体与Ig和ITIM结构域)通过瘤内T细胞(图1)。4C)。这些数据支持了粒子介导的cAMP形成抑制对抗肿瘤T细胞功能失调的观点。

综上所述,我们的数据显示,粒子介导的cAMP形成抑制通过保留黑色素瘤组织中免疫细胞的功能来帮助免疫系统对抗黑色素瘤。

总之,我们提供了临床前证据表明,用抑制剂负载的聚合物胶束抑制局部cAMP抑制黑色素瘤生长。我们证明,它是安全的,依赖于免疫激活,并为优化局部黑色素瘤免疫疗法的发展提供了一条合适的途径。

方法

聚合物合成

Glu(OBN)NCA、Sar NCA和pGlu(OBN)的合成25-b-p萨尔195聚合物按Birke等人的要求进行。23。首先,采用Fuchs-Farthing方法合成了两种NCA.在ABS中,Glu(OBN)NCA的聚合一直在0°C进行。DMF可防止由焦谷氨酸形成的末端基团丢失。根据单体与引发剂的比例,链长为25。

在氮气逆流条件下,将527.9 mg Glu(OBN)NCA(1.98mmol)转移到装有搅拌棒的预干燥Schlenk管中,在高真空条件下干燥1h,在4mL干式DMF中溶解。13.86L新戊胺加入1.5mL干式DMF玻璃瓶中,用氩浸泡混合。在引发过程中,用注射器直接将制备的溶液1mL加入施伦克管(单体含量为100 mg/mL,共可得5mL)。溶液在0°C下搅拌,并通过Schlenk线保持在1.25巴干氮的恒定压力下,防止杂质进入反应容器,同时允许CO。2逃跑。红外光谱证实反应完成(nca峰消失(1853和1786 cm)。−1))。反应结束后,在15 mL干式DMF中加入含1754.0 mg肌氨酸NCA的溶液,经注射器加热至室温。在完全消耗Sar NCA后,80%的溶液用10种醋酸酐和20种三乙胺在每链端进行搅拌,并在室温下过夜搅拌。未加盖的20%的部分直接沉淀到冷乙醚中,然后离心(2540×)。g在4°C下进一步功能化15 min,第二天分别沉淀了端冠聚合物。丢弃后,再加入乙醚,将聚合物重新悬浮在声波浴中。悬浮液再次离心,重复两次。经再悬浮纯化后,将聚合物分散在水和冻干中,制得无色粉末1054.1 mg(97%)。

1核磁共振:PGlu(海外)25-b-Psar195(400 MHz,dmso−)d6): δ[ppm]=8.70-7.60(22H,Br,--CO-CH-),7.56-6.90(131H,Br,-C6H5),5.25-4.70(50H,Br,-O-2-C6H5),4.65-3.65(412 H,Br,-NCH32-CO-和-CO--NH-),3.15-2.60(595 H,Br,-N3,1.85-0.94(67H,Br,-2-CH2),0.84(9H,s,-C(3)3)在六氟异丙醇(HFIP)中使用PMMA校准的GPC:Mn分散性指数Đ=1.15kg/mol。

用俄勒冈绿488琥珀酰亚胺酯(OG 488-NHS)标记嵌段共聚物(O):为使嵌段共聚物(O)与俄勒冈绿(OG 488-NHS)的端基功能化,将60.0 mg(非乙酰化)聚合物溶于1mL DMF中,加入1.25等价物OG 488-NHS,溶解于DMSO的0.5 mL中。溶液在0℃搅拌16h,40℃搅拌8h,然后沉淀成冷乙醚,离心(3215×)。g4°C作用15 min)。在丢弃液体部分后,将聚合物悬浮在水中并进行冻干处理。将20 mg冻干聚合物溶于50/50 THF/水中,用制备反相高效液相色谱法进行纯化。THF用旋转蒸发器除去,残渣冻干,得到10.02mg(50%)纯度的荧光标记聚合物。用Lambert-Beer-Law法在496 nm处定量吸收,建议用紫外-可见分光光度法测定53%的末端标记不定标物(V-630;JASCO公司;详情和计算见SI)。

胶束

通过对嵌段共聚物(O)ide与药物的严格混合,采用双离心法制备了MDL胶束制剂。乙酰基聚(γ-苄基-L-谷氨酸)25--多聚肌氨酸195溶解在氯仿中,用200 nm聚四氟乙烯过滤器(CHROMAFIL)过滤。®

在先前转移的45毫克聚合物中,添加了5毫克MDL和175毫克陶瓷珠(SiLiBeadZY0.30.4由德国Warmesteinach Sigmund Lindner善意提供)。加入450升微孔水,使聚合物膨胀1小时。在离心前直接加入0.53mg氢氧化钠溶解在50升微孔水(每毫升1.25eq)中,在1048×10 48×下进行20 min。g配备双离心机(德国Tuttlingen Andreas Hettich GmbH公司善意提供的ROTTATA 400 DC原型)。离心机使用定制的3D打印样品支架配件。

离心后,用Eppendorf管将浊度溶液从微球中分离出来,用微孔水冲洗两次。溶液被转移到自旋过滤器上,用am图标进行自旋过滤分离游离mdl。®超2mL离心式过滤器®(100 K)在1429×g。滤液样品采用高效液相色谱法,部分纯化胶束溶液冻干,获得总质量浓度。

ICG负载胶束采用双离心法制备,类似于MDL负载胶束,但不加入氢氧化钠.

胶束表征

400 MHz1在Bruker avance-II 400上记录了HNMR谱.在室温下记录光谱,用MestReNova 10.0软件进行分析。通过比较新戊胺引发峰积分、保护基保护基亚甲基积分和甲基和甲基的平均积分,计算聚合度。α-400兆赫肌氨酸质子1核磁共振谱

以含3g/L三氟乙酸钾的HFIP为洗脱剂,在40°C下进行HFIP凝胶渗透色谱(GPC),柱内填充改性二氧化硅(PFG柱,粒径7m,孔隙度100,1000 Au)。聚合物用折射率(RI)检测器(G1362A RID,JASCO)和UV/VIS检测器(UV-2075 Plus,JASCO)检测。用PMMA标准(聚合物标准服务公司,德国美因茨)和甲苯作为内部标准进行校准,计算分子量。利用聚合物标准服务公司的WinGPC UniChrome 8.00(Build 994)软件对洗脱图进行了分析。

衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)是在FT/IR-4100(JASCO公司)上用ATR取样附件(奇迹)进行的。TM,并使用频谱管理器2.0版(JASCO公司)进行分析。

在MalvinZetasizer纳米ZS上进行了静态散射角为173°的DLS实验。1将MDL胶束溶液稀释至1mL微孔水。在平衡到25°C后,进行三次测量,每次12次。颗粒的RI、粘度和RI分别设为1.330、0.8872 CP和1.45。实验结果表明,该装置的吸收系数为0.01,衰减器和测量位置的优化。

对于多角度dls,浓度为1mg/mL的样品用450 nm ghp滤光片过滤。®PSF注射器过滤器,Pall生命科学)进入无尘圆柱散射细胞(SUPRASIL,直径20毫米,Hellma,Mühlheim,德国)。DLS测量采用单相He/Ne激光器(λ=632.8 nm,25 mW)、ALV-SP 125测角仪、光纤检测ALV/高QEAPD雪崩光电二极管、ALV 5000/E/pci相关器、20°C下的劳达RC-6恒温器,在30°−15°范围内进行了15°角相关测量。在数据评价方面,利用Siegert关系扩展到基线减法后的负值,将实验强度相关函数转化为振幅相关函数。g1(t)=标志(G2(t)·平方吨(ABS(G2(t)−A)/A)A测量的基线和G2(t)实验强度相关函数。所有场相关函数都用两个指数和进行拟合。g1(t)=a·exp(−)t/b)+c·exp(−)t/d)考虑多分散性。平均表观扩散系数DAPP都是通过q2·DAPP=(ab−1+c·d−1)/(a + c)导致角相关扩散系数或倒数水动力半径<1/RhAPP。这个z-平均水动力半径Rh由<1/的外推得到RhAPPq=0。归一化二次累积量μ2在90°时用累积量拟合法计算。

胶束载量定量

HPLC采用Agilent 1100系统,配备四泵,二极管阵列检测器记录在254 nm,YMC Triart C18 RP柱,在20 mm醋酸三乙铵(TEAA;1 M TEAA溶液在水中的恒定浓度2%):0 min:1%ACN,1%ACN,25 min:98%ACN,30 min:1%ACN,25 min:98%ACN,30 min:1%ACN。

间接测定胶束制剂中MDL的浓度,从初始加入量中减去滤液中的游离MDL(用高效液相色谱法测定)。相对于0.25-7.5g mdl(0.25,0.5,0,75,1,1.5,2,3,4,5,7.5g)的校正曲线,滤液MDL峰的强度得到了分离的MDL量(0.2,0.5,0,75,1.5)。c高效液相色谱法*V滤液)。将50 L的胶束浓缩液冻干,得到胶束的总质量。m(聚合物+MDL)。

药物负荷的计算采用MDL浓度除以冻干法测定的总含量的质量。给药处方的计算药量为9.2%。

${rm{药品}$;{\rm{load}\left(\frac{w}{w}\right)=\frac{{m}({\rm{total}\;{rm})-{m}({rm},{\rm{MDL})}{{m}({\rm{Polymer}+{\rm{MDL})}$$
(1)

为了量化加载的有效性,计算了封装效率:

${rm{封装};{\rm{efficiency}=1-\frac{{m}({\rm{total}\;{mdl}-{m}({rm{rm};{\rm{MDL})}{{m}({\rm{total}\;{rm{mdl}$$
(2)

动物与细胞培养

C57BL/6,B6.129S7-Rag1妈妈/J和C57BL/6-TG(Foxp3-DTR/EGFP)23.2Spar/Mmjax(DerEG)小鼠是Mainz大学医学中心中心动物设施的面包(12/12-h光/暗周期(早上6:00亮),温度(22±2°C),相对湿度(45~65%)。所有动物实验都是在莱茵兰-帕拉茨州调查局(授权G17-1-069)根据相关法律、现行机构准则和赫尔辛基动物使用和照料公约批准后进行的。提交人遵守了“抵达准则”。

小鼠腹腔注射0.5g白喉毒素(DT)可使Treg耗竭。

B16F10-OVA黑色素瘤细胞在37℃加湿5%CO中生长。2在含10%胎牛血清、100单位/mL青霉素、100μg/ml链霉素和500μg/ml G 418(Geneticin)的MDM培养基中培养。每3个月检测一次支原体。B16F10-OVA黑色素瘤细胞(2×10)5)植入皮下(S.C.)8~10周龄雌性小鼠后侧翼45°注射。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤面积(长×宽),计算肿瘤体积:vol=(W*W*L*)/2.在可见坏死或单个肿瘤大小在任何方向超过2cm时处死小鼠。

治疗方面,用30毫米针注射器在瘤周注射胶束、MDL-12或DMSO(PBS)(德国Melsungen,Braun医疗公司,Omnican 50)。为此,用钳子取出肿瘤边缘的皮肤,并在距肿瘤周围2mm的地方皮下插入针头。尾侧和吻侧各注射10μl。

低温透射电镜

将胶束配方溶液的5L(1mg/mL,在微孔水中)应用于铜200目(QuantfoinMicroToolsGmbH)的新辉光放电碳栅中。通过直接杂交(2.5s)去除多余的流体,并将栅格分别浸入液体乙烷中冷冻。采用Gatan制冷机(626 DH型)将栅极在液氮中冷冻,并在120 kV加速电压下工作,并在Tecnai T12型透射电子显微镜上工作。图像记录使用Temcam-F 416(TVIPS,Gauting,德国)。

流式细胞术

血、脾、淋巴结、肝、肺、肾的单细胞悬液通过70m细胞过滤器产生,然后用ACK裂解缓冲液溶解红细胞。肿瘤的单细胞悬液是通过组织消化产生的。肿瘤切除后切成小块,在37℃分离缓冲液(100 U/ml胶原酶II型(生命技术),100μg/mL DNase I(RPMI 1640+Gltamine+10%FCS))中消化30 min。用70m细胞滤器固定消化后的肿瘤悬液,用MACS缓冲液(1×PBS+1mMEDTA,0.5%HSA)多次冲洗。细胞再悬浮于FACS缓冲液(1×PBS+1mM EDTA,0.5%HSA,20μg/ml山梨红蛋白)中。流式细胞术数据采集于DVA 8的LSRⅡ流式细胞仪(BD Bioscience)上,后用Flowjo 10进行分析。表面染色首先用抗CD 16/CD 32的未标记mAb孵育细胞,以阻断非特异性Fc受体介导的染色抗体结合。细胞在4°C下染色30 min,用相应的细胞表面标记抗体染色。用FoxP 3染色试剂盒(EBioscience)进行核内染色。

基于非排他性的FSC/SSC门控,采用脉冲几何门控(SSC-A和SSC-H),然后是死细胞排斥和随后的表面生物标志物识别(补充图)。4A).

共焦显微镜

B16黑色素瘤细胞注射S.C。B6小鼠后侧翼。瘤周注射OG标记的L-PM胶束和4ʹ,6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI,分子探针,加拿大安大略省)后1h分离肿瘤。共焦图像是在高速旋转盘共焦显微镜(Andor,贝尔法斯特,NI,英国)和DIC(CFI 75)上用LWD 16×W浸水系列透镜(Nikon)拍摄的。

死细胞测定

孤立性肿瘤(2.5×10)6细胞表面染色,悬浮于100 mR-1×Annexin结合缓冲液(Invitrogen)中。分别加入5μl和5μl的7-氨基放线菌素(7-氨基放线菌素;Sigma A-9400),在黑暗中轻轻旋转,15 min孵育。加入900μL后,在BD-LSRII(RBV构型)染色后1h内分析1×结合缓冲液细胞。

抗体

应用以下单克隆抗体进行流式细胞分析:抗CD 16/CD 32(克隆93;eBioscience,#14-0161-82,1:50);抗CD45PAN-BV 711(克隆30-F11;BioLegend,#103147,1:100);抗CD45PAN-aPC-eFluor 780(克隆30-F11;eBioscience,#47-0451-82,1:60);抗CD11b-PE(克隆M1/70;BD生物科学,#557397,在1:100);抗CD29-a Fluor 488(克隆HM 1-1;生物传奇,#102212,使用1:80),可固定活力染料(eFluor 506;eBioscience)用于死细胞排斥。

ELISA法测定细胞内cAMP水平

用cAMP环境影响评价试剂盒(开曼化学)测定细胞内cAMP浓度。1×106细胞在裂解缓冲液(150 mm NaCl,50 mm Tris-HCl(pH 7,6),5 mm EDTA,1,5 mm MgCl)中溶解。2、1%Triton X、5%甘油、50 mm磷酸钠、20 mm焦磷酸钠、10 mm NaF、10 mm Na2HPO4加抑制剂1mm Na3Vo4和100毫米完全,迷你EDTA-无)之前,cAMP测定.为测定肿瘤组织中cAMP的含量,将10 mg组织块(边缘至中心)按比例分离,立即冷冻在液氮中。将冻好的组织在液氮下研磨成细粉,再加入不锈钢支架和灰浆。粉末在100 L裂解缓冲液中均匀化,保存在−80中,进行cAMP分析。夏令营ELISA是按照制造商的指示进行的。在HidexSense Beta微型平板阅读器上测定了光学密度。

全转录体单细胞RNA测序

B16黑色素瘤细胞注射S.C。在B6小鼠后侧(见“动物和细胞培养”一节)和肿瘤用L-PM治疗,对照组用NL-PM(见“MDL负载多聚PEPT(O)ide胶束抑制黑色素瘤生长”一节)。第15天,nl-PM和L-PM处理肿瘤的单细胞悬液(n=3)用小鼠肿瘤解离试剂盒和软MACS进行组织消化。TM解离剂(Miltenyi Biotec)肿瘤浸润CD 45+用MACS技术富集小鼠CD 45(TIL)微球(Miltenyi Biotec)。细胞用FACS缓冲液(PBS+0.5%BSA+5mm EDTA)洗涤,用固定活性染料(EBioscience)和CD 45抗体(EBioscience)染色30 min。+细胞用Aria III流式细胞仪(BD生物科学)进行分类。分离细胞纯度>95%。

单细胞计数和捕获使用BD Rhapsody单细胞分析系统遵循制造商的指南(BD生物科学)。根据BD Rhapsody系统mRNA WTA和样本标记库制备协议(BD Bioscience)构建了完整的转录组分析(WTA)库准备和样本标记库准备。样品采用IlluminaNovaSeq 6000测序系统(英国剑桥,Novogene)和150 PE战略进行测序。根据Illumina标准协议对得到的原始数据进行预处理,并利用BD Rhapsody WTA分析流水线进行文本比对、计数和分选,共生成4388个所谓的假定细胞,平均每个细胞对齐读取16万条。在Partek Flow软件(9.0版)中导入流水线输出的RSEC Mols/cell文件,从后续分析中删除含有<500个检测基因和线粒体计数高于15%的细胞。单细胞计数由Partek流推荐的规范化顺序(CPM(计数_百万),Add:1和log 2)标准化。在降维方面,采用主成分分析(PCA),然后采用基于图形的聚类(SLM)聚类算法和t-SNE算法进行可视化。2D-t-SNE预测中显示的人群按ImmGen‘s注释。Www.immgen.org)数据浏览器。为了比较nl-PM-和L-PM处理样品中细胞总数的差异,随机降低了细胞计数(总共有2820个细胞,每组NL-PM和L-PM每组1410个细胞)。研究抗炎标志(基因集包括Ptgs 2, VEGFA, EGFR, Arg 1, CCL 22, Ccl 17, IL 10, IL12a在巨噬细胞和中性粒细胞中,对Partek流进行AUcell分析(Aibar等人)。(2016)AUcell:单细胞rna-seq数据中“基因集”活性的分析。若要定义耗尽的T细胞,表示Pdcd 1(Pd-1)), HAVCR 2(TIM3)), CTLA 4, 提吉特LAG 3在分层聚类后(聚类距离度量=平均连锁;点距离度量=欧几里得)和二维散点图显示。

统计与重现性

除非另有说明,所有数字和补充数字的实验都独立地重复了至少三次,得到了类似的结果。所有的测量都是从不同的样本中进行的。使用GraphPad棱镜8.0.2版进行了统计评估。评估了所有数据集的正常度(n < 50) with the Shapiro–Wilk to decide for nonparametric (Figs. 1C4B、C)或参数(所有其他数据集)测试。两组的参数测试使用未配对的双面。t-95%可信区间检验,0.05显着水平(α)和Holm-Šídák校正P-价值观。对于两个以上的组,选择了一个具有Holm-Šídák校正多重比较的普通的单向方差。

从scrna seq实验中收集的大量数据被清除为具有rout函数的离群值(Q使用Prism 8.0.2设置为1%)。利用PartekFlow 9.0对主成分1和2的主成分进行PCA-图观察,验证了选择的正确性。正如预期的那样,scRNA-seq数据没有遵循正态分布,因为(Log)正态分布的测试没有通过(Shapiro-Wilk/D‘Agostino-Pearson),因此进行了非参数的非参数Mann-Whitney检验。根据尼姆样式(ns≤0.12,*P≤0.033,**P≤0.002,*P≤0.001)。


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