乙醇中毒和烧伤后肠上皮细胞微RNA和mRNA表达异常的综合分析

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发表时间：2021-10-13 09:48作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

肠道屏障功能障碍常与酒精中毒和烧伤后的病理有关。MicroRNAs(MiRNAs)是基因表达的负调控因子，在肠道内稳态中起核心作用，但在酒精和烧伤后的作用尚不清楚。我们对miRNA和RNA测序数据进行了综合分析，以确定小肠上皮细胞(IECS)内的相互作用网络，从而促进肠道屏障的破坏。用~2.9g/kg乙醇灌胃，4h后给予~12.5%TBSA全层烫伤。一天后，取IECS，提取总RNA进行RNA-seq和miRNA-seq。RNA序列分析显示，酒精和烧伤后IECS中有712个差异表达基因(DEGS)(padj<0.05)。此外，miRNA测序显示有17种差异表达的miRNAs(DEM)(PADJ<0.1)。利用miRNet、miRDB和TargetScan数据库，对miRNA基因靶点进行了鉴定和预测。将小RNA测序数据与mRNA测序结果相结合，可以确定miRNA和靶基因表达的相关变化。上调的miRNAs与细胞增殖(miR-98-3p和miR-381-3p)和细胞粘附(miR-29a-3p，miR-429-3p和miR 3535)有关，而下调的miRNAs与细胞凋亡(mR-7d-5p和miR-130b-5p)和代谢(miR-674-3p和miR-185-5p)有关。总之，这些发现提示酒精和烧伤严重改变了IECS的mRNA和miRNA表达谱，揭示了许多miRNA-mRNA之间的相互作用，调节了酒精和烧伤后肠道屏障功能的关键通路。

导言

烧伤是美国意外伤害的主要原因之一，每年造成大约50万例和4万例住院。1。脓毒症和多器官功能衰竭是严重烧伤患者死亡的最主要原因，这是由于肠道屏障破坏和细菌移位造成的。2,3,4,5。酗酒是许多创伤中常见的混杂因素，因为它增加了意外伤害的风险。6。与其他创伤相似的是，近一半的烧伤报告发生在酒精的影响下。7。与烧伤面积和深度相似的病人相比，烧伤时中毒的患者需要更长的住院时间和手术程序。此外，他们感染、脓毒症、多器官衰竭的风险增加，最终死亡率更高。6,7,8,9,10。因此，烧伤时酒精中毒不仅普遍存在，而且严重影响了患者的预后。因此，这种恶化的病理机制是创伤研究的一个重要方面，需要进一步研究。为了研究酒精如何加重烧伤的病理生理，我们的实验室利用建立的小鼠急性酒精中毒和烧伤模型。利用这个模型，我们的实验室和其他实验室已经证明酒精会加重烧伤后的肠道炎症、肠道屏障破坏和细菌失调，这可能会增加患者感染的风险。8,9,10.

MicroRNAs(MiRNAs)是一种小的非编码RNA，通过与目标mRNAs的3‘非翻译区(UTR)的互补结合，转录后调控基因的表达。这种相互作用通过翻译抑制或mRNA降解对基因表达产生负面影响。11,12。据估计，超过一半的基因组是由miRNAs调控的，miRNAs可以调节多种细胞类型的关键信号网络。13,14。最近的研究表明，miRNAs在调节肠道内稳态和炎症中起着至关重要的作用。15,16。此外，在慢性肠道炎症模型中，许多miRNAs的调控失调与疾病恶化有关，包括炎症性肠病(IBD)和大肠癌。17,18,19。对于miRNA在急性损伤和炎症模型(如创伤和烧伤)中的作用知之甚少。此外，miRNA在调节酒精和烧伤后肠屏障功能障碍中的作用尚不清楚。本实验室先前的研究表明，酒精和烧伤后肠上皮细胞(Iecs)miR-150的表达减少。20。此外，我们还发现酒精和烧伤后肠上皮细胞中DROSHA和Argonaute 2(Ago2)的表达降低。20。DROSHA和Ago 2都是miRNA生物发生途径的组成部分，它们的表达变化可能对许多miRNAs的水平产生显著的影响。此外，研究表明，必要的miRNA处理酶Dicer-1的肠道基因敲除，破坏了紧密连接蛋白的表达和定位，增加了细胞凋亡，增加了肠道炎症。15。这表明miRNA表达的全球变化会对肠道炎症和屏障完整性产生不利影响，并强调需要进一步研究miRNA对烧伤后肠功能障碍的影响。

为了评估miRNA的全球分布，并开始评估miRNA作为酒精和烧伤后肠屏障破坏的分子机制，我们利用我们建立的小鼠模型对肠上皮细胞miRNA和mRNA的表达进行了综合分析。用小RNA序列分析，也称为miRNA-seq，在酒精中毒和烧伤后的第一天，产生肠上皮细胞的miRNA表达谱。此外，我们并行进行mRNA测序(RNA-seq)，以评估基因的表达.为了了解miRNA表达的变化如何影响不同的基因表达网络，我们将miRNA-seq数据与rna测序数据结合起来，评估miRNA表达及其基因靶点的相关变化。我们的研究结果表明，IECmiRNA的表达受到酒精和烧伤损伤的影响，因此很可能在烧伤后的发病机制中起重要作用。此外，利用基因和miRNA表达的相关变化以及已验证和预测的miRNA基因靶点数据库进行综合分析，可以确定与肠道屏障功能相关的mRNA-miRNA相互作用，这可能在酒精和烧伤后肠屏障的破坏中发挥关键作用。

结果

乙醇中毒和烧伤后肠上皮细胞miRNA表达的变化

为探讨乙醇中毒和烧伤对肠内miRNA表达的总体影响，对伤后24h分离的小肠上皮细胞进行miRNA-seq分析，其中5例为假手术组(n=5)，5例为乙醇处理组(n=5)。初步差异表达分析(p<0.1)在乙醇烧伤小鼠体内获得了65种微RNA，与假手术组比较，差异有显着性(图1)。1a)。为了进一步缩小我们的结果，我们调整p值使用本杰明霍奇堡来控制多重测试。用此方法鉴定了17例差异表达的微RNA(DEM)，其中11例显著上调，6例明显下调(PADJ<0.1)。1b)。为了阐明这些DEMS在乙醇和烧伤后肠内稳态中的潜在作用，我们利用miRNet数据库对已证实的基因靶点进行了评估。在miRNet上发现的数据库是一个强大的在线工具，它集成了两个广泛使用的miRNA基因靶标miRTarBase和TarBase(v8.0)的数据。21,22。在17个dems中，有12个miRNAs(miR-1964-3p，miR-501-3p，let-7d-5p，miR-185-5p，miR-30b-5p，miR-29a-3p，miR-429-5p，miR 181d-5p，miR-429-3p，miR-26b-5p，miR-181 a-5p，miR 381-3p)。共鉴定了5,068个有效的基因靶点，用于这12个DEM。然后，我们使用miRNet在超几何测试中构建的KEGG和GeneOntology(GO)数据库对这些目标进行功能丰富分析。KEGG通路分析表明，DEM与多种重要的信号转导途径有关，包括叉头盒家族蛋白(FOXO)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、Akt(又称蛋白激酶B或PKB)、肿瘤坏死因子(TNF)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)、Janus激酶(JAKs)和转录蛋白信号转导子(STATS)。此外，我们还发现细胞内吞、局灶性粘连、肌动蛋白骨架调控、泛素介导的蛋白水解和细胞周期等相关基因的富集。1c)。为了区分酒精和烧伤后可能被上调或下调的通路，我们将上调的DEM和被下调的Dems分离出来。然后，利用GO生物过程(BP)术语对miRNet鉴定的基因靶标进行功能富集分析。我们发现上调miRNAs特异的基因靶点与细胞的增殖和分化，以及细胞骨架和肌动蛋白的组织密切相关。2a)。预测的显著下调miRNAs基因靶点与蛋白质、脂质和碳水化合物、细胞连接组织、细胞周期阻滞和细胞死亡等代谢有关(图一)。2b)。

乙醇和烧伤对肠上皮细胞转录谱的影响

为了进一步探讨酒精和烧伤对基因表达的影响，我们在miRNA测序的同时进行了RNA-seq分析，用同样的样品再次比较了假载体小鼠(n=5)和乙醇烧伤小鼠(n=5)的小肠上皮细胞。测序结果表明，平均每样净读量为4570万条，平均作图率为94.9%。共鉴定出11,809个表达基因(FPKM>1)，其中11,078个基因在两组中均有表达(93.8%)。然后用DESeq 2进行差异基因表达分析，鉴定出712个差异表达基因(DEGS)，其中349个基因显著上调，363个基因与假手术组相比显著下调(padj<0.05)。3a)。为了评估这些基因表达变化对功能的影响以及下调和上调基因之间的差异，我们采用了KEGG通路分析。KEGG通路分析显示，上调DEGS的代谢途径明显富集(PADJ<0.05)，包括氧化磷酸化、脂肪酸降解、细胞色素P 450药物代谢和过氧化物酶体(图一)。3b)。另一方面，下调的DEGS在多种途径上表现出明显的富集(padj<0.05)，包括细胞粘附分子、肌动蛋白细胞骨架的调节和趋化因子信号(图1)。3c)。

整合测序数据分析miRNA-mRNA相互作用

MiRNA及其基因靶点的复杂网络调控着广泛的信号通路。单个miRNA可以有几个不同的mRNA靶点，因此，调节多种途径的选择。此外，多个miRNA分子可以靶向单个mRNA转录子。因此，miRNAs网络协同显著影响基因表达和随后的细胞信号传递。为了可视化全球范围的miRNA和基因靶相互作用最受酒精和烧伤的影响，我们构建了一个相互作用网络，整合了我们的miRNA和RNA测序数据。首先，我们评估了之前为我们的DEMS确定的5068个有效的基因靶点(图1)。1)利用miRNet数据库与RNA测序鉴定的差异表达基因重叠。在我们测序数据中的712个基因中，188个(26.4%)基因是我们9个差异表达的miRNAs的靶基因。然后通过miRNet生成miRNA-mRNA网络，以显示酒精和烧伤后失调基因与miRNAs之间的相互作用(见图)。4)。MiRNet数据库为每个基因和miRNA节点提供了几个网络连通性和相互作用的度量，包括节点度，或直接连接到特定节点的节点数，以及中间的中心性，这是一种更全面的网络结构，用于度量通过节点的最短路径数(补充表)。ST1)。为了评估最连通的核心dems及其基因靶点的功能影响，我们使用g：Profile和g：scs多重测试校正方法，对中央网络基因(度>3，中间度>100)进行了GO-bp富集分析。23。显著丰富的途径(PADJ<0.05)包括细胞粘附、增殖、代谢以及与应激和炎症反应相关的信号通路(表)1).

图4

MiRNAs的整合网络及其预测的基因靶点，在酒精和烧伤后第一天在小肠上皮细胞中差异表达。利用含有dems(蓝方阵)的miRNet及其已验证的miRNA基因靶点(Dgs)构建miRNA-mRNA相互作用网络，并通过mRNA测序(红圈)验证miRNA基因的差异表达基因(Degs)。

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表1综合miRNA-mRNA网络分析。

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作为阐明酒精和烧伤后单个DEM潜在重要基因靶点的另一种方法，我们用RNA测序数据对每个DEM进行了单独的整合分析。由于有些dems没有在miRnet数据库中对基因目标进行实验验证，因此我们扩展了我们的分析，将TargetScan和mirdb数据库中的每个dem的预测基因目标包括在内。24,25。然后，通过RNA测序分析(即，对于下调的DEM，我们提取了显著上调的基因)，我们确定了哪些目标的差异表达呈负相关。此数据聚合的结果显示在补充表中。ST2和ST3。然后，通过g：Profile和g：SCS多重测试校正，通过KEGG途径富集分析，评估与每个DEM所识别的相互作用相关的生物通路。为了获得对调控网络的广泛理解，我们首先将下调和上调DEM的所有目标结合起来。对于上调的miRNAs，我们发现共有167个基因目标被RNA测序下调。这些基因显著丰富的KEGG通路包括Rap1信号、细胞粘附、钙信号和激素信号，包括醛固酮、甲状旁腺激素和apelin(图1)。5)。另一方面，我们发现了121个上调的下调miRNAs基因靶点，这些目标与代谢途径、TNF信号、IL-17信号以及与结直肠癌相关的基因有关(图一)。5)。为了更深入地了解miRNA在酒精和烧伤后肠道屏障功能障碍中的作用，我们还分离了预测的基因靶点，并对单个dems进行了相关表达(补充表)。ST2和ST3)并再次进行路径富集分析。补充表ST4表明下调的Dems、miR-674-3p和miR-185-5p的KEGG通路数量最多。特别是miR-185-5p的上调基因靶点与可能破坏肠屏障完整性的途径有关，包括细菌侵袭上皮细胞和TNF信号。其他下调的DEM要么在上调的基因靶点中没有明显的途径富集，要么只是一个显著的富集途径。例如，过氧化物酶体通路是唯一一个显著丰富的KEGG术语，被发现用于let-77-5p相关基因。补充表ST5显示了大量的KEGG通路与我们上调的Dems的下调基因靶点显著相关。最常见的KEGG通路包括细胞粘附和紧密连接(miR-29a-3p，miR-429-3p和miR-3535)，RAS信号通路(miR-429-3p和miR-26b-5p)和细胞周期(miR-98-3p和miR-381-3p)。此外，我们还发现与胃肠运动和粘膜功能相关的激素信号通路明显富集，包括催产素(miR-181-5p，miR-98-3p和miR-381-3p)，醛固酮(miR-429-5p，miR-181a-5p和miR-98-3p)，以及甲状旁腺激素(miR-98-3p和miR-381-3p)。

讨论

众所周知，酒精中毒和烧伤后肠道屏障的破坏会导致病人病情恶化，包括脓毒症、多器官功能衰竭和最终死亡。2,3,4,5,6,7,8。虽然先前的研究表明，酒精和烧伤后肠上皮细胞中关键的miRNA处理酶DROSHA和Ago 2的表达降低，但miRNA失调对急性创伤后肠屏障功能的影响尚未得到充分的研究。本报告的目的是评估酒精和烧伤对肠上皮细胞miRNA表达的全球影响，并深入了解miRNA可能导致复合损伤后肠屏障破坏的潜在机制。我们发现在酒精和烧伤后肠道上皮细胞中miRNAs及其靶基因的表达发生了广泛的变化。此外，miRNA和mRNA测序数据的整合揭示了几种与肠屏障完整性高度相关的相互作用，并证明酒精中毒和烧伤后miRNA表达的变化是烧伤后发病机制的重要组成部分。

肠上皮细胞是一种重要的物理屏障，它维持微生物群中的病原体与宿主防御反应之间的平衡。3,26。这个屏障的破坏会导致烧伤后的严重并发症，包括脓毒症和多器官功能衰竭。2,4。酒精和烧伤后，肠屏障的破坏主要是由炎症加剧，紧密连接蛋白丢失，IEC增殖减少和IEC凋亡增加引起的。27,28。根据文献，我们的RNA测序数据显示下调基因与细胞粘附通路之间存在显著的关联(图一)。3c)。在正常情况下，部分通过miRNAs与其基因靶点之间复杂的相互作用来维持肠内动态平衡，这种相互作用除了保持紧密连接的稳定性外，还协调了对iec凋亡和炎症信号调节至关重要的信号通路。15。我们的研究结果表明，酒精中毒和烧伤后miRNA表达的广泛变化可能导致正常肠道稳态的破坏。利用miRNet，一个经过实验验证的miRNA基因靶点，我们发现我们的一些差异表达的miRNAs调节与肠道屏障完整性相关的基因靶点。1c)。具体来说，与细胞粘附相关的途径，包括肌动蛋白细胞骨架的组织和Rho-GTPase信号，在我们的上调Dems的预测基因靶点中得到丰富(图1)。2a)。此外，与细胞骨架组织负调控相关的预测基因靶点在下调的DEMS中得到丰富(见图)。2b)。虽然细胞粘附对于保持完整的肠屏障至关重要，但肠上皮细胞却不断地被脱落和替换。这一过程使得细胞增殖和细胞死亡之间的平衡变得非常重要。我们发现下调的DEM与细胞周期阻滞和包括凋亡在内的程序性细胞死亡密切相关(图一)。2(B)细胞分裂和细胞周期是上调Dems基因靶点的富集途径(图二)。2a)。由于miRNAs抑制了其mRNA靶点的翻译，因此我们预计，在酒精和烧伤损伤后，这些对IECS miRNA表达谱的改变将促进细胞死亡，同时降低细胞的增殖和粘附。为了进一步阐明哪些DEMS最有可能导致酒精和烧伤后肠功能障碍，我们采用两种不同的方法来评估DEM表达及其基因靶点的相关变化。由此，我们发现许多与调节肠道屏障完整性有关的相互作用，包括减少细胞增殖(增加miR-98-3p和miR-381-3p)和粘附(增加miR-29a-3p，miR-429-3p和miR-3535)，同时增加炎症(减少miR-130 b-5p，miR-674-3p，miR-185-5p和let-7d-5p)和细胞死亡(让-7d-5p和miR-130b-5p)。1、图1.5，和补充表ST4和ST5).

在伤后的急性期，烧伤患者必须在伤后数年内满足于全身和慢性高代谢反应。这种高代谢状态的特点是能量消耗增加，代谢率增加，全身分解代谢，肌肉蛋白质降解，脂肪分解增加，胰岛素抵抗。29,30,31。研究表明，这一过程是由血浆儿茶酚胺和皮质类固醇水平的增加和系统促炎介质的升高所介导的。29,32,33。人们也知道，慢性饮酒后炎症的增加会对胰岛素信号产生负面影响，从而也会导致代谢过程的增加。33,34。虽然烧伤和慢性饮酒都会促进代谢亢进，但很少有研究探讨合并酒精中毒和烧伤对代谢结果的影响。最近的一项研究显示，与单纯烧伤相比，酒精和烧伤小鼠的代谢发生了显著变化，包括高血糖和血清胰岛素、胰高血糖素和胃肠激素的变化。35。在我们的研究中，几乎所有的KEGG通路都与酒精和烧伤后IECS中的上调基因显著相关。3b)。胃肠道是人体对营养物质吸收和代谢的最初视觉。肠上皮细胞的适当代谢功能对肠内稳态和屏障功能都至关重要。例如，胰高血糖素样肽-2(GLP-2)是一种在胃肠道上皮中产生的激素，对营养吸收、脂类代谢和能量平衡非常重要。然而，研究也显示glp-2通过刺激iec的增殖、抑制细胞凋亡和增加紧密连接蛋白的表达来促进肠屏障的完整性。36,37。除了多种营养素的含量外，脂肪和胆汁酸的代谢也会影响肠道屏障功能和炎症。38,39,40,41。综上所述，这些发现表明酒精和烧伤后的肠道高代谢可能在肠道功能障碍中起主要作用。在过去的十年里，miRNAs已经成为肝脏、胰腺、肌肉和脂肪组织代谢的重要调节因子。MiRNA表达失调与几种代谢紊乱有关，包括肥胖和糖尿病。42,43。最近的研究表明肠上皮细胞代谢与miRNAs之间存在着明显的关系。高脂饮食和过量脂肪暴露可显著改变小肠miRNA的表达。43,44。此外，一项利用小鼠肠道Dicer-1基因敲除模型的研究表明，肠mirna表达的中断导致脂质吸收和积累的改变。45。其他研究证实肠道miRNAs对脂质代谢有广泛的调节作用。46。虽然目前尚缺乏研究miRNA在酒精和烧伤环境下对肠道代谢的调节作用，但我们的发现强调了小肠上皮细胞代谢是受酒精和烧伤后miRNA变化影响的一个重要网络。根据miRNAs的抑制性，我们发现代谢途径(脂质生物合成、细胞呼吸、有机物氧化能量来源、碳水化合物和蛋白质代谢)丰富了miRNet来源的有效基因靶标。2b)。当我们整合来自rna测序的基因表达数据，并提取出同样具有差异表达的基因靶标时，由此产生的网络也显示出与代谢过程的调节显著相关(表)。1)。这一与代谢的关联在单独的整合分析中得到了进一步的证明，该分析将DEM基因靶点的验证和预测与RNA测序数据结合在一起(图1)。5，补充表ST2–ST5)。对每个DEM的个体评估发现miR-674-3p和miR-185-5p是与脂质和蛋白质代谢相关的上调基因靶点的关键下调miRNAs(补充表S)。T4)。进一步研究这些miRNAs影响酒精和烧伤后IEC代谢的机制，可以为其对肠屏障完整性的影响提供新的见解。

本研究的一个局限性是缺乏乙醇单独或烧伤单独组进行比较。然而，我们实验室先前的几项研究已经证实，仅酒精或烧伤损伤(约12.5%)对肠道病理生理没有任何显著影响，而且屏障功能也没有变化。47,48,49。此外，最近的一项研究表明，复合损伤后小肠上皮细胞微RNA生物合成成分DROSHA和Ago 2的基因表达明显下调，而单纯酒精或烧伤损伤则不然。20。虽然烧伤和酒精侮辱本身的作用仍有待确定，但我们认为，这份手稿中的研究结果为miRNA表达的全球变化提供了充分的概览，并为今后关于酒精和烧伤后肠道屏障功能障碍的机制研究奠定了基础。我们进一步认识到，本研究仅限于雄性小鼠，性别是否对酒精和烧伤后miRNA表达的改变有任何作用仍有待于研究。

总之，我们的结果显示，严重的肠道miRNA失调后，酒精和烧伤。此外，我们还发现了一些感兴趣的miRNAs，如图所示。6可能通过减少肠增殖(miR-98-3p和miR-381-3p)，破坏上皮细胞紧密连接(miR-29a-3p，miR-429-3p和miR-3535)，促进肠细胞凋亡(让-7d-5p和miR-130b-5p)和高代谢(miR-674-3p和miR-185-5p)，在降低肠屏障完整性方面发挥重要作用。总之，这些发现为未来的机制研究打开了大门，这些研究可以提高我们对miRNAs如何调节和控制肠道屏障功能和肠道稳态的理解。