中性粒细胞抑制作用对小鼠T细胞增殖和真菌清除的影响龙舌兰(Fonsecaea Pedrosoi)感染

中性粒细胞对于控制几种真菌感染是必不可少的。这些细胞以其促炎作用而广为人知.然而，一些研究表明，中性粒细胞在某些传染病中具有抗炎作用，最终抑制T细胞增殖。嗜铬细胞瘤病是一种深度和渐进性的真菌病，影响着全世界成千上万的人。虽然在病变组织学中观察到中性粒细胞浸润，但真菌可以超越免疫系统的反应，破坏宿主感染的组织。本研究表明，中性粒细胞在脾脏和肝脏中的IL-6分泌增加，随后这些器官的真菌负担降低到感染14天。中性粒细胞减少F.佩德罗索伊-感染后14天产生特异性抗体，刺激后T细胞增殖增强。F.佩德罗索伊-纯化的蛋白质。综上所述，我们的结果表明，调节性中性粒细胞在小鼠模型中的存在F.佩德罗索伊感染可能有利于真菌的传播和感染的慢性。这些发现为CBM的治疗提供了一个新的治疗途径，它可能以中性粒细胞极化为靶点来治疗CBM病变。

龙舌兰(Fonsecaea Pedrosoi)是黑线菌科的一种恶魔样真菌，被认为是发色母细胞增多症(CBM)的主要病原，是一种深部慢性皮下真菌病。1,2。CBM病变以皮肤疣状、红斑样丘疹和萎缩性病变为特征。3。与大多数真菌感染相似，CBM的治疗是复杂的，通常需要多种药物的使用。4与热/冷冻疗法相关5,6在某些情况下，手术7。此外，昂贵的长期治疗可能导致高发病率的疾病复发率和治疗中断.因此，了解宿主与病原体的相互作用对于开发新的煤层气治疗工具至关重要。8。在过去的十年里，我们做出了很大的努力来了解CBM感染中宿主的免疫反应(请参阅参考文献)。8)。CBM患者的皮肤活检显示有特征性的纤维组织外层，内层有厚肉芽肿性炎症组织，主要包括巨噬细胞和中性粒细胞。9,10,11。有几项研究表明巨噬细胞在脑血流中的活化能力很弱，在这种疾病中似乎没有起关键作用。12,13,14,15。然而，中性粒细胞控制真菌传播的重要性仍不清楚。显示中性粒细胞杀菌活性的领先研究之一F.佩德罗索伊“分生孢子”是上世纪90年代由RozentalGroup出版的。16。最近，我们小组展示了中性粒细胞消除。F.佩德罗索伊孢子在体外通过TLR-2和TLR-4依赖的吞噬和ROS的产生而产生，而菌丝的杀伤则是通过中性粒细胞胞外陷阱(Nets)释放的，而不依赖于ROS的产生和TLR-2/TLR-4受体。17。中性粒细胞又称多形核细胞(PMN)，是先天免疫系统中的粒细胞，在几种真菌感染中是必需的，包括白色念珠菌18, 烟曲霉19, 新生隐球菌20, 巴西对虾21，和申克氏孢子虫22。中性粒细胞是第一批从血液迁移到感染部位的白细胞，以遏制和消除外来病原体。因此，长期以来，它们被认为是高度亲炎细胞，具有吞噬、氧化爆发、脱颗粒和网状结构释放等抗菌特性。然而，在1987年，Young和他的同事在荷瘤小鼠中观察到一种与中性粒细胞相似但具有抗炎活性的髓系细胞。23。8年后，Pekarek和他的同事们证明，消除体内的粒细胞通过抑制肿瘤生长来促进小鼠的免疫系统。24。在过去的15年里，人们对这些具有抑制性特征的髓系细胞的兴趣增加了，但是缺乏统一的命名方式导致了研究者们的误解。2007年，“pmn髓源性抑制细胞”(pmn-mdscs)被认为是一种抗炎中性粒细胞。25。虽然这种细胞通常是在癌症背景下研究的，但已知它与其他病理条件有关，如自身免疫性疾病和传染病。最近，研究表明pmn-mdc在几种真菌疾病中积累，如新生隐球菌26, 烟曲霉26,27，和白色念珠菌28,29.

由于CBM感染是一种慢性真菌病，以严重的中性粒细胞和巨噬细胞浸润为特征，我们推测这些中性粒细胞是否被真菌调控到PMN-MDSC谱，有利于真菌的存活和感染的慢性化。因此，我们用一种特异性的抗粒细胞抗体(α-Gr1)诱导小鼠中性粒细胞减少。我们发现粒细胞缺失的动物在感染的早期和晚期，脾脏和肝脏的真菌负担较低。我们还发现中性粒细胞性动物具有较高的T细胞增殖能力和较低的T细胞增殖能力。F.佩德罗索伊特异性抗体产生。这种模式通常出现在轻度疾病患者身上，而较低的T细胞反应和较高的抗体滴度则与这种疾病的严重形式有关。因此，我们的结果表明F.佩德罗索伊调节中性粒细胞到抗炎/PMN-MDSC的轮廓，暗示在CBM感染中宿主保护。

动物

涉及动物的实验协议以前已得到药物科学学院动物护理和研究机构伦理委员会的批准(CEUA/FCF协议474)。在体实验是根据美国国家卫生研究院“动物保护和使用指南”的建议进行的。简单地说，在10-12周龄的雄性C57BL/6小鼠是从圣保罗大学药物科学学院的畜舍生产和实验设施获得的。实验过程中，这些动物被保存在SPF环境中，并被安置在温度控制在23-25°C的温控房间中，同时还有食物和水。安乐死程序是根据美国兽医协会的“动物安乐死指南”(2020)进行的，使用过量的氯胺酮和西拉津方法。在本研究中，我们每组使用4~5只动物，并在两天内进行实验。除非另有说明，这两项实验是经过汇编的。在这项研究中，没有使用任何策略来盲目或随机地将我们的小组。

真菌菌株与生长条件

本研究采用F.佩德罗索伊Cbs 271.37菌株，以前是从一名被诊断为脑梗死的巴西病人中分离出来的。.的基因组F.佩德罗索伊Cbs 271.37已被完全测序，该菌株通常用于研究。F.佩德罗索伊因其感染能力大而引起的感染30。这个F.佩德罗索伊在30°C的Sabouraud琼脂上培养，直至接种制剂。为了避免真菌毒力的衰减或丧失，我们每月给一些动物接种一次，感染15-20天后，从小鼠脾脏和肝脏中恢复真菌。样品保存在Sabouraud琼脂上，直到使用为止(最多三道)。将真菌转移到150 mL的马铃薯地塞米松肉汤(Difco，BD)中，在30°C条件下摇动培养5天。在此期间，接种物通过40μM细胞过滤器过滤。从流过液中分离出分生孢子颗粒，300×离心5 min。g沉淀小菌丝和大分生孢子。收集小孢子上清液，在9000×10 min内离心10 min。g然后在1×PBS中重新悬浮。分生孢子浓度用Neubauer室计数法测定。

外周血中性粒细胞耗竭

8~12周龄的C57bl/6动物用抗Gr1消耗粒细胞(称为耗竭动物)或同类型对照抗ltf 2(Bioxcell)处理。®-命名为同型对照动物)。简单地说，动物被腹腔内(I.P.)不同浓度的抗Gr1(0~200μg)作用于−1d，24h后(0天)，取外周血，用低渗溶液溶解红细胞，制备细胞贴片。白细胞用Wright-Giemsa试剂盒(InstantProv试剂盒，新prov)染色。®)在常规显微镜下进行白细胞计数，对100个白细胞进行核形态和形态分析，并计算中性粒细胞百分比。

从杂交瘤培养上清液中获得抗Gr1抗体(克隆RB6-8C5)。约1×107杂交瘤细胞在含rpmi和10%超低IgG胎牛血清的生物反应器(细胞系生物反应器-Argos技术)中培养。®)，按照生物反应器制造商的指示。培养5d后，收集上清液，用0.01%叠氮钠冷冻，直至IgG纯化。IgG纯化采用蛋白G柱(日立蛋白G-GE保健)®按照制造商的指示。然后将样品放入透析膜中，在pbs溶液中保存24小时，用NanoDrop装置(热费雪仪)测定抗体浓度。®)。用FITC标记的第二抗体标记的小鼠中性粒细胞染色评价抗Gr1功能，然后进行流式细胞术分析(数据未显示)。随后，我们通过分析不同浓度抗Gr1治疗后小鼠外周血中性粒细胞耗竭情况来检测抗Gr1活性。1).

体内感染

动物是I.P。感染5×107的F.佩德罗索伊给药24h后分生孢子(第0天)。感染后1、2天进行安乐死，观察感染早期。在晚期，动物分别在第3天和第7天接受两次额外剂量的抗体。感染14天后，他们被安乐死，并采集脾脏和肝脏来分析真菌负担、细胞数量和细胞因子的产生，因为这些是小鼠模型感染中最常见的受感染器官。F.佩德罗索伊。简单地说，这些器官是用细胞过滤器(70μM)采集并粉碎的。采集浸泡后的器官，接种到Sabouraud琼脂中进行进一步菌落形成单位(CFU)分析，其馀部分离心。离心后，收集上清液，在−80°C冷冻后进行细胞因子测定，再将细胞悬于1mL的PBS中，放置3mL Ficoll(1119密度)，分离出其它组织细胞(Ficoll层底)中的白细胞(Ficoll层顶部)。从Ficoll层顶部采集白细胞，用合适的抗体染色，进行流式细胞分析(Suppl)。表1)。根据制造商的指示(R&D系统)，用ELISA技术检测器官上清液中的细胞因子。

因为这项工作旨在验证中性粒细胞在小鼠模型中的作用。F.佩德罗索伊感染后，我们首先对感染后1天和2天(早期)的动物进行分析，因为在这一时期，免疫系统的主要反应依赖于先天细胞的迁移和激活，特别是中性粒细胞。31,32。后来，我们打算了解中性粒细胞减少对适应性免疫系统的影响；因此，在感染14天后，当适应性免疫系统被完全激活时，我们进行了这一分析。

淋巴细胞增殖试验

用5×10腹腔感染14天后取同型对照组(α-LTF 1)和中性粒细胞(α-Gr1)脾进行T细胞增殖评价。7的F.佩德罗索伊分生孢子。取脾取总细胞，按制造商的指示(分子探针)用10μM cfse(羧荧光素二乙酸琥珀酰酯)染色。接下来，1×105细胞/mL在37°C添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1mm丙酮酸钠的RPMI培养基中培养3d。非受刺激细胞仅用培养基培养，而刺激细胞用含15μg的培养基培养。F.佩德罗索伊纯化的蛋白质(蛋白质提取协议如下所述)。在此期间，收集细胞，用流式细胞术(FACSCanto II-Becton Dickinson)门控CD3进行T细胞增殖分析。+细胞。

体液免疫应答F.佩德罗索伊

抗宿主特异性抗体F.佩德罗索伊采用Westernblot技术进行分析。首先，来自F.佩德罗索伊根据阿尔梅达和同事的修改33。简单地说，F.佩德罗索伊分生孢子和菌丝在超纯水中用5000×离心冲洗三次。g5 min(4°C)。球团用液氮和锤子浸泡，直到我们得到一种细细的粉末。蛋白悬浮5 min。分生孢子和菌丝碎屑经离心(8000×)去除。g，4°C，10 min)。采用Bradford法测定蛋白质浓度，并将样品保存在−80°C，直至使用。我们用梯子标记和10μg加载了sds-页面。F.佩德罗索伊还原条件下的蛋白质。用10%(w/v)奶粉在PBS-吐温(0.05%)作用2h后，将蛋白转移到硝化纤维素膜上，阻断非特异性结合位点。然后将薄膜切割，使每条条子上有两口井，一口用梯子标记，另一口用F.佩德罗索伊纯化的蛋白质。评估F.佩德罗索伊-以前感染过的动物产生特异性抗体，每条试纸与一只动物(同类型对照或中性粒细胞)的血清(稀释1：200)孵育2h。洗涤后，用过氧化物酶结合二次抗体孵育60 min。用增强化学发光法(SuperSignal West Pico，Pierce)检测阳性信号。所有试纸都是在相同的曝光时间内同时开发的(使用ImageQuant LAS 500-GE医疗保健系统)。®)，这样就可以(用ImageJ程序)测定这些带的密度，并在不同的动物群之间进行比较。

统计分析

利用图形贴片棱镜进行了统计分析。®节目。学生t-用一个变量对两组间的分析进行检验。数据表示为平均±SEM，当p<0.05(5%)时，观察到的差异显著。

道德声明

在体实验是根据美国国家卫生研究院“动物保护和使用指南”的建议进行的。涉及动物的实验协议以前已得到药物科学学院动物护理和研究机构伦理委员会的批准(CEUA/FCF协议474)。

抗Gr1治疗导致早期严重中性粒细胞减少

首先，我们旨在确定α-Gr1诱导小鼠严重中性粒细胞减少所需的剂量。因此，采用不同剂量的抗Gr1抗体来调整模型的适宜剂量。用尾剪采集的血液样本显示，即使在最低剂量(50μg)下，注射抗体24h后循环中性粒细胞也减少了50%(如图所示)。1(a-c)当抗体量增加到200μg时，中性粒细胞耗竭增加到75%左右。我们还观察到，单次注射α-Gr1后，48小时后中性粒细胞耗竭率保持在50%左右，但72小时后这一耗竭水平下降到大约25%(图1)。1b)。我们决定在未来的实验中使用最低剂量，因为与接受150μgα-Gr1治疗的动物相比，没有观察到更大的耗竭。1b)。

中性粒细胞的动物在早期表现出较低的真菌负担。F.佩德罗索伊感染

一旦我们确定了消耗中性粒细胞的抗体剂量，我们在第1天用150μg的α-Gr1(或抗ltf 2，同型对照)治疗，然后用F.佩德罗索伊(第0天)。我们发现脾脏中的中性粒细胞大量减少(如图所示)。2A，b)和肝脏。2C，d)感染后1天和2天。感染2天后，肝脏中巨噬细胞(MO)和树突状细胞(DC)的数量也增加。2然而，这些变化并不存在于感染1天的动物的脾脏和肝脏中(如图所示)。2(a-c)中性粒细胞耗竭的动物在感染1天和2天后，脾脏和肝脏的真菌负担减少(图1和2)。2(e，f)，表明中性粒细胞具有pmn-mdscs特征，具有抗炎活性。F.佩德罗索伊感染。

中性粒细胞缺乏的动物在感染早期有较高水平的IL-6。

当我们评估动物脾脏和肝脏中细胞因子的产生时，我们观察到感染后第1天和第2天中性粒细胞中IL-6的水平较高(见图)。3(D)感染后2天，这些动物肝脏中IL-10水平升高(图1)。3d)。而中性粒细胞感染后1天脾脏中IL-4和TNF-α水平下降(图1)。3a)。在感染早期，IL-12、IL-17和IFN-γ的产量与中性粒细胞比较无显着性差异(P>0.0 5)。

中性粒细胞减少

为了更好地了解中性粒细胞对适应性免疫反应的影响，在同类型对照组和中性粒细胞中诱导了14天的感染。有一次我们证明，单次注射α-Gr1可使中性粒细胞耗竭达72h(如图所示)。1)，我们包括了两个额外的剂量，以使中性粒细胞耗竭的时间更长。简单地说，我们执行了上述相同的方案，包括第3天和第7天的额外剂量。中性粒细胞水平在感染后第2、5、8和12天被尾剪血涂片追踪(图1)。4a)。利用14天的时间点，我们分析了淋巴细胞的数量.我们证实，中性粒细胞动物的B淋巴细胞水平较低，T淋巴细胞的数量没有差异(图一)。4b，c)。

大鼠14d后同型对照组和中性粒细胞的中性粒细胞和淋巴细胞分析F.佩德罗索伊感染：术后12天监测外周血中性粒细胞水平。F.佩德罗索伊感染(a)。感染14天后，脾脏T细胞和B细胞(b)和肝脏(c)采用流式细胞术，根据Suppl中所描述的抗体进行分析。表1。将两个独立实验(每组动物4~5只)和实验结果汇编在一起。数值表示为平均值±SD。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001, two-tailed unpaired Student t-测试。

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中性粒细胞缺乏的动物表现出较高的T细胞增殖和较低的体液反应。

接下来，我们确定中性粒细胞的存在是否损害了体液和细胞免疫反应。F.佩德罗索伊感染。除了较低水平的B细胞(图1)。4B，c)，中性粒细胞的动物也表现出一种特异性抗体的产生减少。F.佩德罗索伊，确认这些动物的体液反应受损(图一)。5a，b)。然而，通过增殖实验来评估T细胞功能，我们证实了中性粒细胞具有较高的细胞免疫反应(图一)。5C，d)，表明PMN-MDSC在对照组动物中的存在损害了T细胞的增殖.

中性粒细胞的动物在晚期表现出更好的结果。F.佩德罗索伊感染

通过对中性粒细胞和对照动物的适应性免疫反应的研究，分析了感染后期细胞因子的产生情况。我们证实了较低浓度的IL-6，IL-10，IL-12和TNF-α在脾脏中的浓度(图).6(a，b)中性粒细胞动物肝脏中IL-6、IL-12和IL-17的浓度较高(图1)。6c，d)。此外，与我们先前发现的感染后1天和2天的结果一致，中性粒细胞感染后14天的脾脏和肝脏真菌负担也有所降低，显示出更好的清除真菌的能力。F.佩德罗索伊在没有PMN-MDSC的情况下(如图所示)。6e)。

感染14天后动物脾脏和肝脏细胞因子和真菌负荷F.佩德罗索伊：我们证实中性粒细胞性动物脾脏中IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的含量下降(a,b)和增加IL-6、IL-12和IL-17在这些动物肝脏中的产量(c,d)。感染14天后，中性粒细胞的脾脏和肝脏真菌负荷减少。(e)将两个独立实验(每组动物4~5只)和实验结果汇编在一起。数值表示为平均值±SD。*p < 0.05; **p < 0.01, two-tailed unpaired Student t-测试。

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真菌感染以其治疗的高度复杂性而闻名。几种真菌可以逃避宿主的免疫系统，导致该病的发生。慢性煤层气皮肤伤口有较高的中性粒细胞和巨噬细胞浸润率，表明细胞迁移在本病中没有受到损害。9,10,11。在体外研究中，巨噬细胞的杀菌能力很低，这可能是因为F.佩德罗索伊能抑制这些细胞中一氧化氮的产生14,15，中性粒细胞在体外显示出重要的杀菌能力。F.佩德罗索伊分生孢子和菌丝16,17。然而，巨噬细胞和中性粒细胞在体内CBM感染中的重要性尚不清楚。自从最近观察到具有抑制功能的中性粒细胞以来，新生隐球菌26, 烟曲霉27，和白色念珠菌28,29感染，我们想知道F.佩德罗索伊还可以调节体内中性粒细胞的活性，从而抑制宿主的免疫应答和感染的慢性。为了回答这个问题，我们用α-Gr1给药方法在小鼠体内诱发了暂时性中性粒细胞减少。我们证实，24小时和48小时后，这些动物的外周血、脾脏和肝脏中的中性粒细胞显著减少。F.佩德罗索伊感染。中性粒细胞的缺乏导致真菌感染的更好的清除(如图所示)。2E，f)，感染后48小时，脾脏和肝脏中IL-6水平升高(图1)。3)。这种细胞因子是由不同类型的细胞(从天然免疫细胞到间充质细胞、内皮细胞、成纤维细胞等)在感染性病变中产生的。34。第一次被描述于20世纪80年代，IL-6对炎症、免疫反应和造血有多向性作用。35。目前，IL-6在造粒中的作用36和PMN-MDSCs分化37定义得很清楚。因此，我们的结果表明F.佩德罗索伊通过刺激IL-6的产生，调节中性粒细胞在宿主免疫反应的早期阶段对PMN-MDSCs的活性。一旦这些细胞被耗尽，IL-6在α-Gr1处理的动物的病变部位会出现较高的积聚。类似的结果在肺炎球菌38和锥虫克鲁兹39感染，中性粒细胞的动物表现出较低的病原体负荷和较高水平的IL-6。虽然pmn-mdSCs通常与T细胞抑制有关。40,41最近的研究表明，这些细胞也可以调节先天免疫细胞，如MO。42,43、DC44,45,46，自然杀伤(NK)细胞27,47,48,49。这些细胞在体内CBM感染中的相关性尚不清楚。我们相信F.佩德罗索伊刺激PMN-MDSCs的积累作为一种免疫逃逸机制，导致天然免疫的激活和感染的进展受到损害。然而，为了证实这一假说，有必要对体内CBM感染中的天然免疫反应进行详细的研究。

虽然mdSCs对天然免疫有重要的抑制作用，但其抑制作用主要发生在适应性免疫上。50。在这里，我们证明了T细胞增殖的增加(如图所示)。5C，d)和较低的B细胞群(图1)。4B，c)次之F.佩德罗索伊特异性抗体的产生(图.5(A)中性粒细胞耗竭的动物。这些发现提示中性粒细胞在脾脏浸润。F.佩德罗索伊受感染的动物表现出抗炎作用(MDSCs)，抑制T细胞的体外增殖.从被感染动物的血清中分离出的抗体分析确定了两个主要的类群。F.佩德罗索伊抗原，免疫原性低，重约54 kDa，高免疫原基约48 kDa。此前至少有两项研究有类似的结果，显示CBM患者血清中的抗体对F.佩德罗索伊重约54 kDa的抗原51,52。除了54 kDa抗原外，vida和他的同事还观察到对66 kDa抗原有很强的免疫反应。52。我们认为这种差异可能是由于使用了不同的协议。F.佩德罗索伊-抗原提取或CBM感染的物种特异性体液反应。以往的研究表明，宿主的体液反应在人类cbm感染中不起保护作用，疾病的严重程度与体液反应的激活成正比，与T细胞反应的激活成间接的比例。53,54,55,56。因此，我们的发现证实了这些先前的研究，证明PMN-MDSCs-耗竭的动物发展为轻度感染-与较低的脾脏和肝脏真菌负荷(图一)。6(E)-与较高的T细胞增殖和较低的抗体水平有关(如图所示)。5)。虽然细胞因子谱没有遵循一个明确的模式，我们认为较低水平的白细胞介素-10(图一)。6(B)在中性粒细胞的脾脏中，脾T细胞的体外增殖率较高(图二)。5),一旦已知IL-10能刺激pmn-mdSCs的活动，例如抑制T细胞增殖。42,57,58。然而，在T淋巴细胞增殖试验中没有检测到细胞因子来证实这一假设.

值得一提的是，像其他实验模型一样，小鼠模型F.佩德罗索伊感染有一定的局限性。这个模型并不完全模仿人类的疾病。虽然人类的疾病是慢性的，需要一个长期和复杂的治疗，小鼠可以很容易地消除感染后25-30天。因此，为了评估我们模型中的感染/炎症过程，我们选择感染后14天的时间点(晚期)来比较中性粒细胞存在与否时的真菌负担。

多项研究表明，mdSCs的存活、分化和免疫抑制活性受不同的Toll样受体(TLRs)的影响。59。卡介苗激活TLR-4的研究60和免疫®免疫刺激剂61减少mdcs的频率，而imiquimod对tlr-7/8的刺激则将mdc的抗炎特征转变为促炎和抗肿瘤作用。62。因此，TLRs-激动剂成为治疗癌症的潜在药物，是食品和药物管理局(FDA)最近批准的治疗基底细胞癌的Imiquimod。63。虽然这是第一个证明mdscs在cbm感染中存在的研究，但以前的研究已经成功地使用tlr-4。64和TLR-7/8激动剂治疗小鼠脑梗死65,66。几位作者建议F.佩德罗索伊不良的激活宿主免疫系统，因此，TLR激动剂是必要的，以提高宿主的免疫反应，并杀死感染。然而，大量的中性粒细胞和巨噬细胞浸润在患者的伤口中，表明宿主免疫系统至少被真菌部分激活。因此，我们认为F.佩德罗索伊负调控宿主免疫应答，刺激MDSCs的分化和增殖。使用tlr激动剂的治疗将有助于宿主免疫系统将这些抗炎细胞转化为有利于炎症的特征，有利于解决感染。因此，本工作为CBM感染开辟了一个新的研究领域，首次证明了这一点。F.佩德罗索伊刺激PMN-MDSCs，抑制宿主免疫反应，导致感染的时间延长。然而，主要的问题仍有待解决：F.佩德罗索伊目的：促进PMN-MDSC的增殖和分化。