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CD 73介导的CD8 T细胞外小泡分泌腺苷是免疫抑制的内在机制

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发表时间:2021-10-11 15:44作者:武汉新启迪Xinqidibi

摘要

炎症部位的免疫细胞被局部抗原和细胞因子持续激活,必须制定控制炎症的调控机制。胞外ATP由CD 39和CD 73内切酶逐步水解生成一种强效的免疫抑制剂腺苷。在这里,我们报告了人的效应细胞CD8 T细胞通过释放CD 73细胞外小泡在激活时释放腺苷来促进腺苷的产生。这些细胞外囊泡具有AMPase活性,由此产生的腺苷可以独立于调节性T细胞介导免疫抑制。此外,我们还发现,从幼年特发性关节炎患者滑膜液中分离出的细胞外小泡以CD 73依赖的方式参与了T细胞的抑制。我们的结果表明,T细胞活化过程中产生腺苷是人类效应T细胞的内在机制之一,它补充了调节性T细胞介导的对炎症组织的抑制作用。最后,我们的数据强调了免疫细胞衍生的细胞外小泡在控制免疫反应中的作用。

导言

炎症期间免疫细胞活化、细胞应激或代谢变化有利于ATP释放到细胞外间隙。高细胞外ATP是免疫细胞的危险信号,被ATP降解酶迅速代谢.其中,胞外核苷酸酶CD 39将ATP和ADP脱磷酸化为AMP,然后由ecto-5‘-核苷酸酶(CD 73)转化为腺苷。1。有效胞外腺苷的数量进一步决定于腺苷脱氨酶(ADA)介导的降解速率和细胞通过核苷转运体摄取。腺苷受体A亚型的激活2A,T细胞中主要表达的腺苷受体(ImmGen数据库联合体)2),导致胞内cAMP升高,导致T细胞活化和效应功能下降。3,4.

腺苷信号增强限制粘膜炎症5并在几种自身免疫动物模型中改善疾病6,7。删除A2A受体增强胃炎幽门螺杆菌-感染小鼠8并在实验性自身免疫性脑脊髓炎早期加重炎症。9。在人类中,自身免疫性疾病患者的血清中已记录到高ADA活性。7,10。因此,腺苷生成酶CD 73在关节炎动物模型中起着保护作用。11结肠炎12.

免疫反应的控制对于预防炎症所致的健康组织损伤至关重要。Foxp 3+调节性T细胞(Tregs)是维持外周对自身抗原耐受的关键细胞,通过抑制T细胞增殖和效应功能,在终止免疫应答中发挥关键作用。Tregs使用一系列抑制机制来恢复免疫稳态,包括产生抗炎细胞因子,参与协同抑制受体,以及调节效应T细胞代谢。13。小鼠Tregs在细胞表面表达CD 39和高水平CD 73,降解ATP并产生腺苷,而腺苷又具有双重作用:抑制效应T细胞。14提高Tregs的抑制能力15。然而,在人类T细胞室中,CD 73在大多数天真的CD8 T细胞表面和一小部分成熟的CD4和CD8记忆T细胞中表达,但在Tregs上几乎不存在。16,17,18。因此,CD 73与CD 39在Tregs上的共同表达是一个罕见的事件。17,19挑战腺苷生成作为Tregs在人体中的一种抑制机制的概念。有几项研究证实了CD 39在人胸腺中的表达对抑制能力的重要性。17,20,21,关于CD 73在Tregs中的重要作用的证据是有争议的。22,23,24.

考虑到CD 73在人Tregs上的低表达,免疫抑制腺苷是如何在炎症条件下在人体系统中产生的问题。我们的数据表明,活化的CD8 T细胞衍生的细胞外小泡(EVS)中的CD 73足以降解AMP,抑制T细胞的增殖和功能。这种T细胞的内在机制,协同作用与高ATP酶活性的Tregs,介导了腺苷的产生,并需要充分的免疫抑制。此外,我们发现从青少年特发性关节炎(JIA)患者的滑膜液(SF)中分离出的EVS以CD 73依赖的方式诱导T细胞抑制,强调CD 73对EVS在炎症控制中的作用。

结果

人调节性T细胞不能产生足够的腺苷抑制T细胞增殖和功能

细胞外ATP浓度增加对T细胞活化的影响25ATP通过CD 39和CD 73内切酶迅速代谢为腺苷。激活A2免疫细胞上的受体增加细胞内cAMP水平,导致T细胞活化和效应功能降低。4(无花果)1A)。为了评估腺苷受体激活在人原发性T细胞中的作用,我们首先加入了抑制腺苷降解的ADA抑制剂ehna。在ehna的存在下,我们观察到与未处理的对照组相比,T细胞的增殖减少了20%。1B)。类似地,代谢稳定的非选择性腺苷类似物5‘-N-乙基羧酰胺腺苷(NECA)和2-氯腺苷(CADO)导致浓度依赖性的活性下降(以CD 25的百分比来衡量)。+CD4 T细胞外的细胞增殖(如图所示)。1C,d),显示腺苷受体激活对人T细胞的抑制作用。

图1:T细胞活化过程中产生的腺苷可防止T细胞反应加剧。
figure1

aCD 39和CD 73酶将ATP降解为腺苷的原理图。bdαCD3/αCD 28刺激PBMC或CD4 T细胞bADA抑制剂ehna或不同浓度的腺苷受体激动剂cNECA,和d卡多。流式细胞术检测CD 25在3~4天后的表达和增殖。数据显示b五个捐助者或c, d一个具有代表性的捐助者(技术复制的平均数)。e, fCD 73和CD 39在人T细胞亚群中的表达e有代表性的点图和f10名捐赠者的摘要(中位数)。gCD 73用αCD3/αCD 28刺激CD4conT细胞,并与Tregs、ATP(50 M)和重组CD 73(15 ng/mL)共同孵育。CD4conT细胞与Tregs的比值为1:0.125~1:0.5。流式细胞术检测CD 25的表达和增殖。第4天用ELISA法测定细胞培养上清液中干扰素γ的产生情况。双尾配对t-试验是用来比较未经处理的和处理过的样品。b.

腺苷是由cp在CD 39和CD 73协同作用下产生的,这些内切核苷酸酶的共同表达是小鼠Foxp 3的标志之一。+Tregs并允许它们产生免疫抑制的腺苷14。尽管这一途径在人类系统中也被广泛接受为有效,但来自人类蛋白质图谱的基因表达数据。26,27以及ImmGen项目2,28表示.的表达式NT5E,编码CD 73的基因在两种不同的免疫细胞区存在差异。根据基因表达数据,所有小鼠T细胞亚群均表达。NT5E,而在人外周血T细胞室中,CD8 T细胞有较高的NT5ETregs中的表达量和表达量都要低得多。我们的数据证实,几乎所有小鼠外周Tregs在细胞表面表达高水平的CD 73,三分之二的细胞共同表达CD 39(补充图)。1),满足腺苷生成的酶促要求。为了系统地探讨CD 39和CD 73在人外周血T细胞上的表达,我们用流式细胞仪检测了这两种外显子核苷酸酶的细胞表面表达。1E,f)。我们发现,只有极少数频率的人外周血Tregs表达CD 73(平均3%,从0.8%到6%,图1)。1F)。CD 39在10%至70%的Tregs上表达,这取决于供者的基因型。17,29和约5%的非激活常规CD4(CD4con,定义为非Treg CD4 T细胞)和CD8 T细胞。相反,CD 73在20%~60%的CD8 T细胞上表达,而在不到20%的CD4con T细胞上表达。鉴于Tregs表达CD 73的频率较低,即使在CD 39高表达的供体中,这两种外显子酶的共同表达也是罕见的。1E,f),质疑Treg衍生腺苷与人体免疫抑制的相关性。为了在实验上解决这个问题,我们用不同比例的CD4conT细胞进行了体外抑制实验:Treg(图1)。1g),考虑到Tregs的生理比例约为CD4 T细胞的10%30。作为应答细胞,我们使用了分类的CD 73。CD4con T细胞抑制CD 73分泌腺苷的研究+除Tregs以外的细胞(附图)2)。在这些特定的条件下,我们没有观察到Tregs在任何比例下对抑制的影响。当我们加入三磷酸腺苷模拟炎症环境时,我们观察到在较高的Treg比(1:0.5CD4conT细胞与Tregs,5倍的生理浓度)下,T细胞的活化、增殖和干扰素γ的产生受到极大的抑制。重组CD 73的加入没有进一步的抑制作用,表明系统中存在足够的CD 73(尤其是在这个供体中,2%的Tregs是CD 73)。+)生产腺苷。在较低的Treg比例(1:0.125 CD4con T细胞与Tregs的比值,类似于生理条件),Tregs只能在ATP存在下诱导部分抑制。但与重组CD 73联合后,CD 25的表达降低至最低,增殖和干扰素γ的产生完全消失(图1)。1g)。这些数据表明,在生理CD4con:Treg比值,没有足够的Treg衍生AMPase活性产生腺苷,介导明显的抑制。

Tregs介导的CD 73介导的AMPase活性对CD4 T细胞增殖和功能的调控是不可缺少的。

在人类中,CD 73在Tregs中的表达频率低于CD4con和CD8 T细胞(如图所示)。1F)。我们推测,非调节性T细胞产生的AMPase活性有助于腺苷的产生和免疫抑制。为了验证这一点,我们刺激CD4con T细胞,并加入不同比例的Tregs。如预期的那样,在极高的CD4con:Treg比(1:2)中加入Tregs,可使T细胞活性降低30%~50%。我们观察到,当外源性AMP加入细胞培养时,在所有条件下都会显著减少CD 73的底物数量。重要的是,这种效应与Treg衍生的AMPase活性无关。2A)。我们推测,我们系统中AMPase活性的可能来源可能是来自应答者T细胞的CD 73。为了测试这一点,我们将CD4con T细胞分类为CD 73。和CD 73+并且在AMP的面前刺激他们,但没有Tregs(如图所示)。2B)。如预期,CD 73+与AMP孵育后,分选细胞在较低水平上较少活化和增殖,这种作用通过加入特异性CD73抑制剂PSB-14685而逆转。重要的是,在CD 73中加入AMP-分类CD4con T细胞对活化或增殖无抑制作用(图1)。2B),表明在应答者T细胞上的CD 73是产生腺苷所必需的。重组CD 73在AMP处理的CD 73中的添加CD4con T细胞重建抑制作用,表明外源性CD 73在功能上弥补了应答细胞中CD 73的缺乏(图1)。2C)。值得注意的是,重组CD 73能够诱导T细胞抑制CD 73。提供底物AMP时,CD4conT细胞的酶浓度低至0.15ng/mL(见图)。二维空间)。在图中所示的实验中,干扰素γ的产生与CD 25的表达和增殖一样。2A-d(补充图。3A-d)。我们的结论是CD 73介导的腺苷的产生是传统T细胞控制持续激活的内在机制。

图2:Treg衍生CD 73并不是腺苷介导的抑制传统CD4 T细胞所必需的.
figure2

ad用αCD3/αCD 28刺激CD4应答T细胞,同时加入ADA抑制剂ehna(10 M)。流式细胞术检测CD 25的表达和增殖。aCD4conT细胞经AMP(50M)和Tregs刺激后,按一定比例孵育。bCD4con T细胞分为CD 73和CD 73+与特异性CD 73抑制剂PSB-14685(10 M)共同孵育。cCD4con CD 73用特异性CD 73抑制剂PSB-14685(10 M)和重组CD 73(15 ng/mL)孵育T细胞。dCD4con CD 73T细胞用AMP(50μm)和不同浓度的可溶性重组CD 73(以15 ng/mL为3倍系列稀释剂)孵育。用PSB-14685阻断重组CD 73的最高浓度。数据显示a三,b, c九和d5例供者(平均±SD)。采用普通单因素方差分析和Dunnett多重比较试验,将所有条件与经ehna或ehna和AMP(第一BAR)处理的细胞进行比较。

酶活性CD 73在活化后从T细胞膜释放。

在人外周血T细胞中,CD 73主要表达于CD8 T细胞。1F),我们以前已经证明激活的T细胞失去了CD 73的膜表达31。我们假设活化细胞释放的CD 73在腺苷的产生中起作用。为了解决这一问题,我们首先研究了外周血单个核细胞(PBMCs)在活化过程中释放的时间点。我们观察到CD 73在CD8 T细胞上的表达在刺激后第1天出现峰值,然后在刺激后2或3天出现明显下降(如图1所示)。3A)。CD4 T细胞中还检测到细胞膜上CD 73的丢失。CD 39在两组T细胞中均表达上调。虽然CD 73在细胞膜上的丢失是一种普遍现象,但我们在CD 73丢失的时间和范围上以及在CD 39上调水平上都观察到了个体间的变异性。

图3:CD8 T细胞活化后释放酶活性CD 73。
figure3

a外周血单个核细胞活化后CD8和CD4 T细胞CD 73和CD 39表达的流式细胞术分析(第0天至第7天5个时间点)。提供了四个捐助者的数据。bPI-PLC处理或激活后CD8 T细胞释放CD 73的示意图。AMPase活性的测定由1,N6-乙炔-AMP(EAMP)至1,N6-乙醇-ADO(Eado)。c, d测定CD8 T细胞和上清液的AMPase活性。0.2×106CD8 T细胞cPI-PLC(0.5U/mL)或dαCD3/αCD 28刺激4d。直方图显示细胞在eAMP孵育时表达CD 73。用eAMP孵育细胞和上清液,用高效液相色谱法测定eAMP对Eado的降解率。c六个捐助者和d8名捐助者)。用ELISA法测定可溶性CD 73(SCD 73)含量。c六个捐助者和d两个捐助者)。双尾配对t-试验是用来比较未经处理的和处理过的样品。c, d.

接下来,我们调查了释放形式的CD 73的命运。CD 73是一种gpi锚定蛋白,它是一种酶活性的可溶性蛋白,在人血浆中有cd73特异性的apmpase活性。32,33。我们采用了一种基于高效液相色谱法的灵敏度较高的荧光法,提高了信号对噪声的敏感性,N6-乙醇-AMP(EAMP)作为底物,测定细胞和细胞培养上清液中AMPase的活性。3B)。作为原理的证明,我们使用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)迫使CD8 T细胞表面CD 73脱落。3C并观察到PI-PLC处理细胞的AMPase活性低于未处理细胞(图1)。3C(中)相反,PI-PLC处理细胞的上清液将更多的eAMP转化为1,N6-乙醇-腺苷(Eado),与上清液中较高数量的CD 73相一致(见图)。3C,右)。CD 73特异性抑制剂PSB-14685完全阻断了eAMP的降解,证实了酶活性的特异性.失去CD 73表达的活化T细胞(见图)。三维空间(左),AMPase活性低于未刺激细胞(图1)。三维空间(中)细胞结合区活性的下降与活化细胞培养上清液中Eado的生成增加并行,同时ELISA检测到可溶性CD 73的浓度也随之增加(见图)。三维空间,右)。这些数据表明CD 73在T细胞活化后在细胞培养上清液中释放,并保持其酶活性。

EVS是CD8 T细胞培养上清液中AMPase活性的主要来源,介导应答T细胞的抑制。

接下来我们试图破译膜释放CD 73的机制。我们首先考虑的是酶介导的脱落,但是,无论是特异性抑制磷脂酶D,还是抑制金属蛋白酶,都不能阻止CD 73从细胞表面的丢失(补充图)。4)。CD 73在活化后在T细胞的脂筏中富集,表明这种释放可能以囊泡的形式出现,就像在肿瘤细胞中所描述的那样。34。采用细胞培养上清液差速离心法,观察了10,000×10,000×刺激CD8 T细胞上清液中AMPase活性的变化。g(大泡和凋亡小体被球化)和11万×g离心(小的囊泡是球状的),表明CD 73确实存在于囊泡上(见图)。4A)。目的:验证CD 73介导的酶活性对这些小泡(活化的CD 73的上清液)的特异性。和CD 73+分离的CD8 T细胞经差速离心后,测定各组分的AMPase活性。CD 73细胞培养上清+CD8 T细胞2000×后显示AMPase活性g离心(清除细胞碎片),但超离心大大减少了Eado的产生。值得注意的是,从110,000×g离心(以下简称EVS)显示了丰富的AMPase活性。4B)。CD 73上清CD8 T细胞不具有AMPase活性,表明CD 73对这些样品中AMP的酶降解具有特异性。

图4:细胞外小泡是人CD8 T细胞培养上清液中AMPase活性的主要来源。
figure4

a, b用αCD3/αCD 28刺激CD8 T细胞,培养4d。细胞内AMPase活性分析a受刺激或未刺激的CD8 T细胞培养上清液b分类CD8 CD 73的上清液和EVS+或CD8 CD 73差速离心T细胞。用高效液相色谱法测定eAMP向Eado的转化率。ceCD 73受刺激细胞培养上清液中EVS的CD 73和EV标记分析+或CD 73CD8 T细胞c西方污点,d流式细胞术e免疫金标记电镜。重组CD 73或受刺激CD8 T细胞的细胞裂解液为阳性对照。f在GW 4869(10M)存在或不存在时,从αCD3/αCD 28刺激的CD8 T细胞中分离出EVS,用NTA法测定其浓度和大小。gCD 73、CD 9和CD 81在分类CD 73中表达的显微分析+或CD 73用αCD3/αCD 28刺激4天后,CD8 T细胞。第0天加入GW 4869(10 M)。hCD8 T细胞活化前后CD 73和CD9表达的显微分析。测定皮尔逊系数,量化CD 73和CD9的共定位.数据来自7个(D4)或8个(d0,d1)高功率场(中心线:中值,盒限:25至75百分位数,晶须:min至最大值)。捐助者分析:a, b三个独立实验中的三个捐献者;c三个独立实验中的六名捐献者;df三个捐助者;g, h三个捐献者的样本是独立处理的。每个图形面板显示一个有代表性的供体/实验。用Kruskal-Wallis检验和Dunn多次比较试验比较了两种方法共定位的Pearson系数。h.

对CD8 T细胞EVS的纳米粒子追踪分析(NTA)显示,大部分分离的CD8 T细胞小泡的大小约为100 nm(补充图)。5)。Ev标记CD 81和FLOTLIN的存在以及高尔基蛋白GM 130的缺失证实了EV的性质和纯度。此外,从CD 73衍生的EVS中检测到CD 73蛋白。+CD8 T细胞,而不是CD 73细胞CD8 T细胞(图1.4C)。尽管EVS的小尺寸限制了常规流式细胞术的精确分析,但以正向散射和侧散射为基础的颗粒显示CD 73在CD 73衍生小泡中的染色强度增加。+CD8 T细胞与CD 73细胞的比较CD8 T细胞,而Ttraspanin CD9的表达与之相当(图1)。4D)。纯化后囊泡的电镜观察显示,囊泡呈典型的杯状形态,大小在50~200 nm之间。免疫金标记进一步证实CD 73来源的EVS中存在CD 73。+CD8 T细胞(图1.4E)。为了研究CD 73的水泡释放,我们用GW 4869来治疗T细胞,GW 4869是一种药理化合物,可以阻止一种叫做Exosome的特定类型EVS的产生。35。在细胞培养中加入GW 4869可减少产生的EVS数量,而大小不受影响(图1)。4F)。它还防止了四天半胱氨酸CD 9和CD 81从细胞中的丢失(如图所示)。4G)。CD8 T细胞的高分辨荧光显微镜显示,刺激4d后CD 73表面表达下降(图1)。4H)与流式细胞仪的结果一致(见图)。4H右上面板和图。3A)。CD 73与Ttraspanins、CD 9和CD 81的重叠显示CD 73在激活后第1天和第4天与囊泡标记物共同定位(如图所示)。4H右下角面板和补充图。6)。总之,这些数据表明CD 73在T细胞活化时与EVS一起释放,而这些EVS在T细胞培养上清液中占AMPase活性的绝大部分。

我们想知道从T细胞培养上清液中分离出的含CD 73的EVS是否在功能上弥补了T细胞活化和增殖过程中缺乏膜结合CD 73的缺陷,如我们对重组CD 73所显示的那样。2C)。为了测试非细胞结合的cd73的天然来源esv是否能抑制T细胞功能,我们激活了cd 73。在AMP存在的情况下,CD4con T细胞(为防止残余膜结合CD 73对应答T细胞的任何影响)。从CD 73上清液中分离纯化重组CD 73或EVS的研究+CD8 T细胞有较强的抑制作用,且呈剂量依赖性,并可被CD73抑制剂PSB-14685所阻断。5A,b和补充图。7)。重要的是,从CD 73上清中分离出EVS。CD8 T细胞不能抑制应答者T细胞的活化和增殖,细胞培养液超离心后的颗粒物质也不受抑制(图1)。5和补充图。8),表明所观察到的抑制效应是CD 73-特异性的,而不是由于EV制备过程中的污染物所致。总之,我们发现酶活性CD 73是从活化的CD8 T细胞中释放出来的,而EVS来自活化的CD 73。+T细胞具有高度抑制作用。

图5:从活化CD 73细胞培养上清液中分离的细胞外囊泡+CD8 T细胞具有免疫抑制作用。
figure5

CD 73用αCD3/αCD 28刺激CD4conT细胞,并与AMP(50 M)、重组CD 73(15 ng/mL)、EVS和PSB-14685(10 M)共同孵育。aCD 25表达及b4天后用流式细胞仪检测细胞增殖情况。数据显示为来自独立实验的三个捐献者的中间值。对于每个供体,CD 25的表达和增殖与仅用ehna处理的细胞有关。重复测量单因素方差分析和Dunnett多重比较试验,将所有条件与用ehna和AMP(第二BAR)处理的细胞进行比较。

免疫细胞活化过程中释放的T细胞衍生抗体与调节性T细胞协同有效抑制效应T细胞

在我们之前的实验中,我们外露地提供了CD 73的底物AMP。ATP是由CD 39酶活性产生的。与传统T细胞不同的是,很大一部分Tregs在人体内构成性地表达CD 39(图1)。1F)。因此,Tregs有可能比传统T细胞更好地降解ATP。用高效液相色谱法比较纯化Tregs、CD4con和CD8 T细胞活化后ATP酶的活性。使用1,N6-乙醇-ATP(EATP)作为底物,我们发现Tregs在所有被测T细胞亚群中具有最高的ATP酶活性。6A,在Tregs上有大量基底CD 39表达的供者中,这种情况更为明显(见图)。6A,左侧面板)较低频率的供者CD 39表达Tregs(图1)。6A,右面板)。值得注意的是,CD8 T细胞是ATP降解效率第二高的细胞类型,而CD4con T细胞ATP酶活性最低,与活化后CD 39细胞升高的百分率一致(图1)。3A).

图6:Treg衍生CD 39和囊泡CD 73的联合活性导致T细胞功能的最佳抑制。
figure6

a两供体T细胞亚群ATP酶活性的HPLC分析。活化细胞(αCD3/αCD 28,3d)与1、N6用高效液相色谱法测定了乙烯-ATP(EATP)和乙烯-核苷酸的降解.直方图显示在eATP孵育时CD 39在细胞上的表达。bCD 73用αCD3/αCD 28刺激CD4conT细胞,用Ada抑制剂ehna(10 M)刺激CD4conT细胞,并与Tregs、ATP(50 M)和CD8 T细胞培养上清液中的EVS孵育。流式细胞术检测CD 25的表达和增殖。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定第4天收集的细胞培养上清液中干扰素γ的产生情况,并对4例有代表性供者(技术复制均值)的数据进行分析。

我们怀疑Tregs的高ATP酶活性与含有CD 73的EVS结合在一起,介导了最大限度的免疫抑制。我们用CD 73进行了抑制试验CD4conT细胞作为应答T细胞,并加入不同比例的Tregs。当CD4conT细胞与Tregs比值接近生理状态(1:0.125)时,Tregs只能诱导部分抑制。CD 73中EVS的添加+CD8 T细胞是非细胞结合CD 73的天然来源,它降低了CD 25的表达,完全抑制了效应T细胞的增殖和干扰素γ的产生。6B)。重要的是,源自CD 73的EVSCD8 T细胞对抑制应答T细胞无明显作用,提示其与Tregs不协同产生免疫抑制性腺苷。我们认为Tregs是我们系统中ATP酶活性的主要提供者,Treg来源的ATP酶活性与效应细胞AMPase活性以EVS形式的协同作用保证了免疫抑制的最佳条件。

从幼年特发性关节炎患者滑膜液中分离出的EVS具有免疫抑制作用。

一个有趣的问题是非细胞结合CD 73与炎症的相关性。自身免疫性关节炎患者的SF为分析人体系统中的炎症室提供了一个理想的机会,因为我们可以接触到与疾病相关的浸润免疫细胞。8例JIA患儿SF细胞组成的流式细胞术分析(图1。7A表明T细胞是主要的细胞群,与PB相比,CD8 T细胞在SF中富集。B细胞,是人类免疫室中唯一一种重要的cd73表达细胞类型。2,28,在SF中的表达明显低于PB在所有患者中的表达。我们接下来比较了CD 73和CD 39在PB和SF T细胞上的表达(图)。7b)。与公布的数据一致36,37我们发现,在滑膜T细胞亚群中,CD4 T细胞和Tregs上CD 39的表达增加,CD8 T细胞上的CD 73表达降低。与我们激活后的体外研究结果类似,我们怀疑CD 73已经从细胞膜上丢失了。事实上,我们检测到几乎所有患者的SF中有中到高浓度的可溶性CD 73(如图所示)。7C并证实了AMPase在样品中的活性(如图所示)。7D)。接下来,我们从SF中分离出EVS,并通过电子显微镜和westernblot验证了EVS的性质。除CD 73(补充图)外,在所有EV标本中均能检测到EV标记物FLOTLIN和CD 81。9a,b)。我们还评估了蛋白质污染的存在,并发现了白蛋白的存在,就像以前用差示超速离心法分离EV时所报道的那样。38,但不含载脂蛋白(附图)。8B).

图7:从幼年特发性关节炎滑液中分离出的细胞外囊泡具有免疫抑制作用。
figure7

a, b流式细胞术分析a免疫细胞亚群bCD 73和CD 39在JIA患者SF和PB中的表达。cELISA法检测SF细胞无细胞结构中CD 73的表达.dSF与eAMP共同孵育,用高效液相色谱法测定eAMP的降解。eCD 73用αCD3/αCD 28刺激CD4conT细胞,并与ATP(50 M)、重组CD 73(15 ng/mL)、EVS(3.1×10)孵育。8和psb-14685(10 MM)。流式细胞术检测CD 25的表达和增殖。数据显示a8名个人捐助者b九,c十五,和d四个捐助者,由DOTS表示,或e被分析的三个中有代表性的捐献者(技术复制的平均值),标记为bd。用双尾Wilcoxon试验比较pb和sf在pb和sf中的表达。b.

在其他细胞类型中,T细胞明显地参与了SF中EVS的细胞来源(补充图)。9C用常规流式细胞仪(附图)可以显示CD8和CD 73在EVS上的共同表达。9d)。我们评估sf衍生的esv是否抑制CD 73。CD4con T细胞。正如以前观察到的那样,在应答者T细胞中加入重组CD 73和ATP会导致T细胞活化减少,并完全抑制增殖。在无ATP的情况下,将SF衍生的EVS加入培养中,我们观察到细胞的激活和增殖增加。重要的是,在ATP的存在下,这一增加被取消,细胞增殖明显减少,这是通过加入CD 73特异性抑制剂psb-14685来逆转的(如图所示)。7E)。值得注意的是,SF衍生的EVS以剂量依赖性的方式降低了应答者T细胞的活化和增殖(补充图)。9E)。总之,从JIA患者的SF中提取的EVS可以降解AMP,产生腺苷,抑制T细胞的增殖和功能。

讨论

腺苷是一种强有力的调节炎症产生于细胞外空间,由ATP的顺序水解,由内切核苷酸酶CD 39和CD 73。我们在这里显示,活化的人CD8 T细胞释放出含有CD 73的EVS,产生腺苷,在很大程度上促进免疫抑制。

ATP的降解和腺苷的生成是小鼠Foxp 3抑制的一种较好的机制。+在细胞表面同时表达CD 39和CD 73的Tregs14。然而,很少有人使用FOXP 3+Tregs表达CD 73,不擅长腺苷的产生。我们在这里描述了CD 73介导的腺苷的产生在很大程度上独立于人类系统中的Tregs,并提出了一个协调的努力,包括CD 39在Tregs上降解ATP为AMP,CD 73在T细胞衍生的EVS上,以提供产生腺苷所必需的AMPase活性。我们已经证明从活化的CD8 T细胞中释放出含有CD 73的EVS。然而,CD4 T细胞在激活后也会从细胞膜上丢失CD 73,这表明CD4 T细胞具有平行的机制。

细胞内ATP是一种重要的能量来源。一旦释放到细胞外空间,ATP就成为一种生物活性的信号分子。39。细胞活化和应激、炎症、缺血或缺氧等条件可促进ATP的释放,提高ATP的周细胞浓度,足以激活P2受体,支持炎症。25,40,41。胞外ATP被胞外核苷酸酶迅速水解,逐步产生腺苷,这是一种与P1受体A结合的强有力的免疫抑制因子。2A和A2B免疫细胞。ADA对腺苷的降解进一步调节了腺苷信号传导的有效性。因此,由嘌呤能酶和受体组成的复杂网络控制嘌呤能信号的持续时间和大小,并调节免疫反应。42。值得注意的是,嘌呤能分子与其受体的亲和力和受体激活后的结果是细胞和物种特异性的。43。腺苷信号通路支持小鼠胸腺的扩张和抑制作用15同时抑制效应T细胞。在人类中,腺苷同时抑制Tregs和效应T细胞。44。不仅对细胞外腺嘌呤核苷酸的反应在小鼠和人之间存在差异,而且对CD 39和CD 73内切酶的表达和调控也有一定的影响。这两种酶在小鼠胸腺中的共同表达保证了腺苷的产生,这一代谢途径对它们的抑制作用很重要。14,45。相反,很少有循环的人Tregs表达CD 73,而且他们仍然是抑制性的。这就提出了一个问题:人类胸腺是否依赖于腺苷的产生,或者更倾向于其他免疫抑制机制。人胸腺细胞膜上缺乏CD 73可能是一种进化上的优势,可以避免细胞外腺苷的产生,从而抑制其功能。44。此外,人Tregs不表达CD 26,这是ada在细胞膜上的对接位点。46,缺乏有效降解去细胞腺苷的机制。

CD 73是一种gpi锚定蛋白,它位于脂筏的质膜上,准备形成ev。47,48。我们发现CD 73在激活后3~4天从T细胞表面急剧下降,伴随着细胞室AMPase活性的丧失。同时,细胞培养上清液中酶活性增加。重要的是,细胞培养上清液中产生腺苷的能力在超离心后丧失,表明它包含在EVS中,而不是以可溶性蛋白的形式存在。部分AMPase活性在10,000×g离心,我们认为是CD 73对凋亡小体或更大的EVS。尽管与膜结合变异体相比,CD 73具有更高的可溶性酶活性。49我们推测囊泡形态具有延长半衰期、通过体液更好地分布等优点。目前尚不清楚esv在人体体液中能传播多远,但在静脉注射6小时后消除之前,小鼠esv可以快速地传输到脾脏和肝脏。50。EVS的产生提出了细胞如何恢复膜丢失的问题。一种可能是与国外电动汽车融合,这将允许细胞间非常动态地交换膜成分,并获得新的功能。51,52.

Ev和T细胞来源的腺苷在体内对免疫抑制的确切贡献是很难预测的,因为在免疫反应中影响腺嘌呤核苷酸有效性的多个调控水平。影响因素包括信号相关分子的快速生成和降解、核苷酸浓度的局部差异、潜在的前馈抑制机制和替代降解酶。在我们对人T细胞的体外实验中,我们使用不同的底物和特异性抑制剂来克服这些困难。通过用ADA抑制剂阻断腺苷的降解,我们强调了嘌呤能级联在免疫抑制中的作用。加入中等浓度的外源ATP(50μm)可以模拟局部ATP的增加,这是在炎症和缺血的不同环境下报道的。53。在没有Tregs的情况下,我们加入AMP来保证CD 73的有效底物,因为传统的T细胞在产生AMP方面的效率远远低于Tregs。此外,加入AMP作为底物可以绕过ATP或adp对CD 73的前馈抑制作用。54。虽然cd73是主要的AMP降解酶,但cd73缺失时,组织非特异性碱性磷酸酶(Tnap)仍能产生腺苷,如cd73基因敲除小鼠所示。55,56CD 73缺乏症患者的细胞57。在我们的实验中,我们可以用一种特定的CD 73抑制剂完全消除Ampase的活性。58,59,表明TNAP活动在我们的系统中是可以忽略不计的。所观察到的ATP酶活性很可能是由CD 39介导的,但我们不能排除其他酶的贡献,例如ENPP 1(ENPP 1)或这类焦磷酸酶家族的其他成员。60。值得注意的是,ENPP 1在T细胞上的表达、调节和活性尚未被探索。ADP作为中间产物的检测表明ATP是逐步降解的,有利于CD 39等ENTPDase(ENTPDase)的作用,而不是焦磷酸酶。

CD 39和CD 73在不同的免疫细胞类型中均有表达。在人类,除T细胞外,B细胞表达两种外显子核苷酸酶,而单核细胞和树突状细胞主要表达CD 39。内皮细胞和间充质细胞表达CD 73,所有这些细胞类型都参与体内ATP代谢。从间充质干细胞、B细胞和Tregs中分离出含有CD 39或CD 73的EVS。24,61,62。这些电动车具有免疫调节特性。63它们在癌症中的调节作用已经被报道。34,62。在这里,我们没有讨论T细胞源性EVS中存在的其他外显子核苷酸酶对ATP代谢的贡献,但有证据表明Treg衍生EVS含有CD 39并抑制T细胞增殖。24。需要进一步研究细胞和EV相关的外显子核苷酸酶在免疫抑制中的作用。

我们有一个独特的机会从人类炎症的部位,JIA患者的SF中分离出EVS。SF主要由单核细胞和记忆T细胞组成,它们产生炎性细胞因子,维持受影响关节的炎症。64,65。与以前的报道一致,我们发现CD 39增加,而CD 73在SF T细胞中的表达可以忽略不计。当sf-浸润细胞表现出ATP酶活性时,ampase活性在细胞内降低。36,37。我们的分析显示CD 73存在于SF的无细胞部分,包括EVS.这些EVS的细胞来源是T细胞、单核/巨噬细胞、内皮细胞和间充质干细胞。因为人类单核细胞不表达CD 7326,27我们认为活化的T细胞是水泡CD 73的相关来源。在SF衍生的EVS上CD 73和CD8的共同表达证实了这一点.滑膜衬里的内皮细胞和间充质干细胞(均表达CD 73)也是CD 73的合理来源。+SF电动汽车。这一发现值得进一步调查。我们的体外实验表明,来源于sf的esv促进T细胞的活化和增殖,这可能是由这些ev中含有的细胞因子和生长因子所致。66。然而,随着ada抑制剂ehna和atp的加入,我们加强了嘌呤能信号级联,从而扭转了结果,使ev变得免疫抑制,就像肿瘤细胞产生的含CD 73的esv所显示的那样。34。因此,在富含ATP的环境中,就像在炎症和缺血部位或肠道一样,嘌呤能信号级联与免疫调节密切相关。67.

我们认为Tregs上CD 39的大量表达可以保证ATP的水解生成ADP和AMP,但CD 73的AMPase活性是由CD8 T细胞提供的,主要包含在EVS中。我们认为传统的(非调节性的)T细胞产生腺苷是抑制持续炎症所必需的免疫抑制的内在机制,并对Tregs必须为腺苷生产提供整个机制这一共同范式提出质疑。最后,我们的结果强调了EVS在控制免疫反应中的作用,并支持了调节嘌呤能轴治疗局部炎症的前景。


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