Δ克尔 OTULIN小鼠有发炎性皮损，发展为疣状癌 为了研究OTULIN在表皮中的作用， 奥特林 Fl/fl 小鼠 24 横渡到 角蛋白-14 CRE 在角质形成细胞中选择性地实现CRE介导的重组和OTULIN缺失的细胞系 25 。角质形成细胞特异性OTULIN缺陷原代培养物(Δ)的免疫印迹分析 克尔 OTULIN小鼠显示OTULIN(补充图)的有效缺失。 1A )。Δ 克尔 OTULIN小鼠出生时有正常的孟德尔分离，但在背部和尾部皮肤上出现了明显的炎症皮损(图一)。 1A )。Δ中的这些皮损 克尔 OTULIN小鼠从出生后第6天起就可以观察到(附图)。 1B )。7周龄成人Δ背部皮损组织学检查证实了皮肤病理。 克尔 OTULIN小鼠有明显的表皮增生和黑素。 1B )。这些炎症性皮损逐渐发展为疣状癌(如图所示)。 1B )，被定义为具有极小转移潜能的鳞状细胞癌的高分化变异体。 26 由于伦理上的考虑，在肿瘤形成之前必须牺牲小鼠。Δ的皮肤炎症 克尔 OTULIN小鼠的表皮厚度也明显增加，而非松弛性皮肤的表皮未增厚，与对照组(OTULIN)相当(OTULIN)。 Fl/fl )小老鼠(如图所示。 1C )。Δ 克尔 OTULIN小鼠还表现出皮肤透性屏障完整性的丧失，经皮透皮水分损失(TEWL)测量结果如下(图1)。 1D )。Δ皮炎 克尔 Δ中CD11b和F4/80阳性巨噬细胞的明显存在进一步证实了OTULIN皮肤。 克尔 OTULIN皮肤病变(图1. 1E )，角质形成细胞分化在Δ的皮损和非角质皮肤中均有表现。 克尔 OTULIN小鼠基于异常角蛋白-6(K6)和丝素染色的皮肤切片(图6。 1E )。Δ 克尔 OTULIN皮肤也表现出与对照小鼠皮肤相比较的高脂溶性物质，如油红O染色(补充图)所示。 1C
图1：Δ 克尔 OTULIN小鼠表现出可发展为疣状癌的炎症性皮损。 a 7周龄大鼠背部皮肤和尾部的典型图像 Fl/fl 和Δ 克尔 OTULIN小鼠。 b 标记基因型7周龄小鼠H&E染色皮肤切片的代表性图像。标尺：100μm。下面两个面板显示11周龄Δ的疣状癌。 克尔 OTULIN小鼠。框状区域描绘放大区域如下所示。放大区标尺：200μm.nl非病灶；L级；Vc疣状癌. c 7周龄表皮厚度量化( n =每项条件5；* p < 0.0001, One-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± SEM. d 第7、8和9周的跨表皮失水(TEWL)测量结果( n =每种情况下5只老鼠；** p =0.0019；* p < 0.0001, One-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± SEM. e 7周龄OTULIN皮肤切片的免疫荧光染色 Fl/fl 小鼠和Δ的非松弛性(NL)和剥离性(L)皮肤 克尔 OTULIN小鼠抗CD11b(红色)、F4/80(绿色)、丝氨酸(中板)或角蛋白-6(下板)抗体，核染色DAPI。每次染色 n =5只小鼠。标尺：25μm。 f IL-4、IL-6、IL-13、TNF、S100A8和MCP-1在8周龄大鼠表皮尾裂解液中的相对表达 Fl/fl (WT) n =8和 n =5用于mcp-1分析)和Δ 克尔 OTULIN(KO； n =8)小鼠。数据表示均值±扫描电镜。(*) p < 0.001; Mann−Whitney two-sided testing). g 8周龄奥托林血清IL-6、TNF、IL-17和MCP-1水平的研究 Fl/fl (WT) n ≥7)和Δ 克尔 OTULIN(KO； n =8)小鼠(**) p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; Mann−Whitney two-sided testing was performed between relevant genotypes). h 7周龄OTULIN表皮尾部裂解物的Westernblotting研究 Fl/fl n =3)和Δ 克尔 奥图林( n (3)用抗体检测OTULIN、线性泛素链(M1-Ubq)、IκBα和磷脂IκBα。对磷脂IκBα和IκBα进行免疫印迹。分子量标记单位以千吨数(KD)为单位。抗肌动蛋白被显示为负载控制。通过三个独立的实验，给出了具有代表性的图像。
对表皮尾裂解物的定量PCR分析表明，白细胞介素(IL)-4和-13的表达水平升高，两者均与表皮屏障功能有关。 27 、促炎细胞因子TNF和IL-6、趋化因子MCP-1(又称CCL 2)和抗菌肽S100A8(图1)。 1F )在Δ中 克尔 OTULIN皮肤与对照皮肤比较，证实了Δ的屏障完整性丧失和炎症状态。 克尔 皮肤。Δ 克尔 与对照组相比，OTULIN小鼠的IL-6、TNF、MCP-1和IL-17的循环水平也明显升高(图1)。 1g )，表明全身炎症，这也是明显的皮肤引流淋巴结较大的Δ。 克尔 OTULIN小鼠与对照组小鼠比较(附图)。 1D )。与Δ的炎症状态一致 克尔 OTULIN皮肤，表皮尾裂解物上的免疫印迹显示NF-κB反应增强，表现为IκBα水平降低，Δ中磷脂IκBα水平升高。 克尔 OTULIN表皮与对照表皮的关系(图1. 氢 )。此外，Δ的表皮裂解物中m1连接的泛素链水平也显著升高。 克尔 OTULIN小鼠(图1. 氢 )，与OTULIN作为M1泛素特异性脱泛素酶的功能相一致。这些数据共同表明，在角质形成细胞缺乏OTULIN的小鼠身上发生了一种强而隐匿的皮炎，提示需要适当调节LUBAC介导的线性泛素化，以维持皮肤的动态平衡。
角质形成细胞中OTULIN的消融导致表皮干细胞增殖和细胞死亡 LUBAC介导的线性泛素化对预防炎症性皮肤细胞死亡具有重要意义。 8 。OTULIN也因其在限制炎症细胞死亡方面的作用而被人们所认识。 17 ,24 ,28 ,29 。因此，我们量化了Δ中caspase-3阳性凋亡细胞的数量。 克尔 控制皮肤。在非局部Δ中，凋亡细胞的数量明显增加。 克尔 与对照皮肤相比，OTULIN皮肤在炎症性Δ中更为明显。 克尔 OTULIN皮肤病变(图1. 2A，b ；补充图。 2A )。用免疫印迹法证实了caspase-3在Δ表皮尾裂解物上的切割作用。 克尔 OTULIN小鼠(图1. 2C )。组织中细胞死亡率的提高往往伴随着代偿细胞的增殖。Δ分析 克尔 OTULIN皮肤切片也显示角质形成细胞在皮损和非皮损区域的增殖明显增加，如Ki 67染色所示。 2A，b ；补充图。 2B )。一致地，我们用脉冲Δ法评估角质形成细胞的增殖动力学。 克尔 OTULIN与对照皮肤用核苷酸类似物EDU(5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷)作用3h后进行分析。毛囊的全免疫荧光显示对照皮肤无明显的EDU摄取，而Δ则未见明显吸收。 克尔 OTULIN皮肤显示出广泛的EDU摄取，表明表皮干细胞增殖明显增加(图一)。 二维空间 )。尾整体成像也显示了Δ毛囊结构的明显异常。 克尔 OTULIN皮肤，具有异常形状的皮脂腺，漏斗腺明显增厚(见图)。 二维空间 )。免疫荧光染色证实了caspase-3阳性死亡细胞在Δ全长中的积累。 克尔 OTULIN毛囊，表明在没有OTULIN的情况下，毛囊干细胞(HFSC)群体的细胞活力可能受到影响(图1)。 2E )。探讨Δ中异常细胞死亡是否先于皮损形成 克尔 OTULIN小鼠，我们下一次定量的凋亡细胞的数量，在一个时间点时，还没有明显的损害，即在产后的P0.5天。而在这些新生儿Δ中，表皮厚度并没有明显改变。 克尔 OTULIN小鼠皮肤中Caspase-3阳性的凋亡卵泡间表皮(IFE)细胞数量明显增加，与对照组相比，差异有显着性(图一)。 2F−h
图2：Δ的表皮 克尔 OTULIN小鼠细胞增殖增强，凋亡增强。 a 7周龄大鼠皮肤切片 Fl/fl 和Δ 克尔 OTULIN小鼠分别用裂解caspase-3和Ki-67抗体染色，观察细胞凋亡和增殖。L.非利兹性的；L型的标尺：200μm。 b 7周龄OTULIN滤泡间表皮(IFE)细胞数的定量研究 Fl/fl (WT)和Δ 克尔 卵裂Caspase-3和Ki-67染色阳性的OTULIN(KO)小鼠 n =9 WT小鼠； n =6只和4只KO非致病性小鼠； n =6和4只KO小鼠；单向变异数；* p < 0.5; **p < 0.01; ****p < 0.0001). Data represent means ± SEM. c OTULIN表皮尾裂解物中全长(FL)和裂解(Cl)caspase-3表达的westernblot分析 Fl/fl 和Δ 克尔 OTULIN小鼠。以抗肌动蛋白免疫印迹作为负载对照。分子量标记单位以千吨数(KD)为单位。本实验分别重复三次，结果相似。 d 7周龄OTULIN尾完整切片中的EDU(绿色)细胞 Fl/fl 和Δ 克尔 OTULIN小鼠追逐3h后。用角蛋白-14(K14；红色)染色，DAPI(蓝色)染色。标尺：100μm。下面板只显示EDU染色。本实验分别重复三次，结果相似。 e 7周龄OTULIN尾全尾切片 Fl/fl 和Δ 克尔 OTULIN小鼠裂解caspase-3(红色)染色，DAPI染色。下面的面板描绘的是放大的视图。每基因型8只小鼠进行分析。标尺：50μm。 f , g 表皮厚度的量化( f )和切割的caspase-3阳性细胞数。 g )在P0.5对照和Δ皮肤切片的IFE中。 克尔 OTULIN幼犬(WT： n =3；KO： n =4；Mann−Whitney双面检验；* p =0.0007)。数据表示均值±扫描电镜。 h OTULIN蛋白酶-3染色皮肤切片的典型图像 Fl/fl 和Δ 克尔 奥图林幼犬。每基因型8只小鼠进行分析。箭头表示IFE细胞凋亡。较低的面板描绘了框状区域的放大视图。标尺：100μm。
Δ中角质形成细胞增殖的研究 克尔 OTULIN小鼠是干细胞增殖能力增强的标志，而干细胞增殖能力对皮肤再生反应至关重要。 1 。的确，Δ的全层皮肤损伤 克尔 OTULIN和对照组小鼠在Δ伤口修复的初始阶段(伤后第2天和第4天)表现出明显的加速愈合反应。 克尔 OTULIN小鼠。然而，当伤口进入修复的重塑阶段(伤后第8天)时，Δ的伤口愈合速度明显减慢。 克尔 OTULIN皮肤与对照皮肤比较(附图)。 2C−e )。有趣的是，Δ 克尔 当再上皮化完成时，OTULIN皮肤在损伤部位出现囊肿和肿瘤样病变(附图)。 2E )，证实这些小鼠对皮肤肿瘤的敏感性增强。
TNFR 1介导的细胞死亡驱动Δ的炎症反应 克尔 乌托林小鼠 皮肤炎症 夏平 CPDM/cpdm 小鼠在没有TNFR 1的情况下不会发育 5 ,30 ,31 。然而，角质形成细胞特异性HOIL-1或HOIP缺陷小鼠的致死性皮炎仅部分由tnfr 1介导。 8 。因此，我们测试了基因消融tnfr 1是否也能改善Δ所观察到的炎症表型。 克尔 皮肤。交叉Δ 克尔 OTULIN小鼠的TNFR 1缺乏的背景完全防止皮炎(图一)。 3A )，即使在年老时(附图)。 3A )，以及Δ 克尔 OTULIN-TNFR 1 − /− 小鼠血清IL6、TNF和IL 17水平明显降低(图一)。 3B )。此外，一个功能性TNFR 1等位基因的缺失部分保护了Δ。 克尔 OTULIN皮肤对抗皮肤损害的形成和炎性细胞因子的产生(图。 3B )。在一致的情况下，Δ的表皮 克尔 OTULIN-TNFR 1 −/− 皮肤未增厚，可与对照皮肤媲美(OTULIN) Fl/fl )小老鼠(如图所示。 3C
图3：Δ的皮炎 克尔 OTULIN小鼠依赖于TNFR 1信号转导和FADD/MLKL-和RIPK 1激酶依赖的细胞死亡。 a 标记基因型7周龄小鼠背部皮肤和尾部的典型图像。右侧面板显示相应小鼠的H&E染色皮肤切片。标尺：200μm。 b 8周龄奥托林血清IL-6、TNF和IL-17水平的研究 Fl/fl (WT) n =9或11)，Δ 克尔 OTULIN(KO； n =8)，Δ 克尔 OTULIN-TNFR 1 −/− n =7)，Δ 克尔 OTULIN TNFR 1 +/− n =7)，Δ 克尔 OTULIN-RIPK 1 D138N/D138N n =4)，以及Δ 克尔 OTULIN/FADD/MLKL( n =5)小鼠(Mann−Whitney双面试验；* p < 0.5; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001). Data represent means ± SEM. c 7−11周龄时表皮厚度定量。L级 n =每项条件10；* p < 0.0001, One-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± SEM. d 原代角质形成细胞培养( n 在刺激前8h，以20 ng/ml的mtnf+或不加IFN-γ(10 ng/ml)启动处理。用Sytox绿色摄取法评价其活力。三个独立实验的代表性图。(剩余最大可能性(REML)；* p =0.002)。数据表示均值±扫描电镜。 e Inucyte图像显示坏死角质形成细胞在干扰素-γ和肿瘤坏死因子治疗后0和24 h摄取Sytox绿。本实验分别重复三次，结果相似。 f OTULIN原代角质形成细胞培养物的westernblot分析 Fl/fl 和Δ 克尔 用肿瘤坏死因子(TNF)治疗OTULIN小鼠，观察时间点.四个独立实验的代表人物。 g UBAN-IP对OTULIN分离的PMK裂解物中泛素的抑制作用 Fl/fl 和Δ 克尔 OTULIN小鼠经TNF指示的时间点，然后免疫印迹M1 Ubq链。免疫沉淀前裂解液(PIP)对M1 Ubq(M1)、RIPK 1和OTULIN进行免疫印迹。α-肌动蛋白显示为加载控制.本实验分别重复三次，结果相似。
由于ripk 1激酶活性在tnfr 1复合物II中调节细胞死亡，我们接下来评估ripk 1激酶依赖的细胞死亡对Δ炎症皮肤表型的贡献。 克尔 OTULIN小鼠。为此，我们跨越了Δ 克尔 OTULIN小鼠进入RIPK 1激酶-非活性基因( Ripk 1 D138N/D138N )背景。Δ 克尔 OTULIN-RIPK 1 D138N/D138N 小鼠也完全免受皮炎的发展(图一)。 3A )，即使在老年(40周及以上)(补充图。 3B )，并显示血清炎症细胞因子和趋化因子水平正常(如图所示)。 3B )，以及表皮的正常厚度(如图所示)。 3C )。RIPK 1激酶活性可诱导FADD依赖性凋亡和RIPK 3/MLKL依赖性坏死。 32 。因此，我们下一次跨越了Δ 克尔 有氟小鼠的OTULIN小鼠 FADD 和 MLKL 等位基因，在角质形成细胞中产生缺乏OTULIN、FADD和MLKL的小鼠。这些Δ 克尔 OTULIN/FADD/MLKL小鼠完全无损伤。 3A 和补充图。 3C )，循环细胞因子水平正常。 3B )，以及表皮的正常厚度(如图所示)。 3C )，证明细胞死亡是Δ炎症的驱动力 克尔 OTULIN小鼠。Δ 克尔 OTULIN小鼠角质形成细胞中仅缺乏MLKL，部分保护作用不受皮炎的影响。Δ完全挽救了尾部表型。 克尔 OTULIN/MLKL小鼠，但有些小鼠背部皮肤仍有损伤(附图)。 三维空间 )。最后，我们观察到Δ对皮炎有完全的保护作用。 克尔 OTULIN小鼠被杂交到缺乏MyD 88基因背景，表明微生物成分可能参与了OTULIN缺乏皮肤的皮炎的驱动作用(图1)。 3A
小鼠角质形成细胞(PMKs) 夏平 CPDM/cpdm 小鼠对TNF刺激引起的细胞死亡高度敏感 6 ,33 ，即使在没有外源刺激的情况下，hip缺陷细胞的存活能力也较低。 8 。然而，OTULIN缺乏的PMKs与对照PMKs一样对TNF诱导的细胞死亡具有抗药性(图1)。 三维空间 )。然而，当PMK用Ⅱ型干扰素(IFNγ)启动并随后用肿瘤坏死因子(TNF)刺激时，与对照PMKs相比，发现大量OTULIN缺陷的角质形成细胞死亡，这是通过24小时摄取细胞不透水染料来衡量的(见图)。 3D，e )。相反，与对照组相比，NF-κB和p38MAPK信号转导及细胞因子或趋化因子的产生无明显差异。 克尔 TNF刺激后的OTULIN PMKs(图1)。 3F 和补充图。 3E )。值得注意的是，在Δ中观察到残留的OTULIN带。 克尔 OTULIN PMKs可能来源于PMK培养中仍然存在的饲养细胞。在Δ中，Sharpin，HOIL-1和HOIP的表达明显降低。 克尔 OTULIN PMKs(图1. 3F )，与以前的研究一致，表明LUBAC组分在OTULIN缺乏的细胞和组织中的表达减少。 15 ,17 ,24 ,28 ,29 ，并符合OTULIN通过抑制其自泛素化和降解来维持LUBAC功能的概念。 17 。事实上，用蛋白酶体抑制剂MG 132预处理PMKs可以恢复Δ中Sharpin和HOIP的水平。 克尔 OTULIN文化(附图) 3F )。最后，利用重组GST-UBAN(ABIN蛋白和Nemo中的Ub结合域)对泛素结合区蛋白的特异性降解进行线性泛素化分析，结果表明，与对照组相比，TNF刺激下原代OTULIN缺陷角质形成细胞培养物中M1-泛素化显著增加(如图1所示)。 第三代 )，证实了OTULIN在限制角质形成细胞M1泛素化方面的重要性。RIPK 1在PMK的免疫沉淀裂解液中的免疫印迹显示RIPK 1在Δ中的表达降低 克尔 OTULIN PMKs(图1. 第三代 )，虽然在从Δ分离出来的表皮尾裂解物中没有观察到RIPK 1表达的改变 克尔 OTULIN小鼠(附图) 第三代
总之，我们可以证明皮炎和肿瘤在Δ中的发展。 克尔 OTULIN小鼠依赖于TNF对角质形成细胞的杀伤活性，而TNF驱动FADD-和RIPK 1激酶依赖于角质形成细胞的死亡。FADD和MLKL基因缺失对皮炎的完全挽救证明角质形成细胞死亡是Δ皮肤炎症和肿瘤发生的驱动力。 克尔 OTULIN小鼠。
角质形成细胞OTULIN缺乏症，干扰干细胞系，诱导皮肤浸润天然免疫细胞 更好地表征Δ的炎症表型 克尔 OTULIN小鼠及其对非Δ细胞差异的深入研究 克尔 我们接下来对从对照野生型(WT，OTULIN)分类的活细胞进行单细胞RNA测序(ScRNAseq)。 Fl/fl n =1)皮肤及利索(L； n =3)和非牵引(NL)； n =2)Δ 克尔 皮肤。根据马里奥尼管道对数据进行预处理后，劣质电池被排除在外。 34 。首先，根据高变异基因的表达情况，采用亲和繁殖的方法对种群进行无监督的全局聚类。 4A )。根据Joost等人的细胞标记的表达情况，对不偏不倚聚类所描述的不同细胞群体进行标注。 35 (补充图。 4A )。接下来，我们确定哪些细胞起源于这三种不同的条件。这一分析表明，对照细胞在不同的细胞群中有明显的聚类，这与小细胞(L)在簇内的分布相反。这一点在角质形成细胞和成纤维细胞簇中非常明显(如图所示)。 4B )。有趣的是，Δ 克尔 OTULIN非牵拉(NL)细胞分布于整个角质形成细胞和成纤维细胞簇上(如图所示)。 4B 、中间面板)。这些细胞类型正经历着非局部Δ基因整体表达的重大变化。 克尔 OTULIN皮肤，导致细胞的表达剖面与WT细胞高度相似，同时细胞是高度相似的瘦细胞和细胞明显过渡到这两个两端的表达谱。
图4：单细胞rna测序显示Δ中天然免疫细胞的明显浸润和毛囊干细胞系的变化。 克尔 OTULIN小鼠。 a 对照OTULIN活皮细胞带注释的UMAP聚类分析 Fl/fl 小鼠(WT)、非利尿性(NL)和离体(L)Δ全皮肤 克尔 OTULIN小鼠(DP真皮乳头、DS真皮鞘、FIB成纤维细胞、VSM血管平滑肌、TC T细胞、DC树突状细胞、MC巨噬细胞、LH Langerhans细胞、IFE滤泡间表皮(包括漏斗腺)、HF IL毛囊内层细胞、SG皮脂腺、UHF上层毛囊、HF OL毛囊外胶原细胞、HF Bu毛囊泡泡、EC内皮细胞、LV淋巴管、Mel黑色素细胞、SC雪旺细胞)。 b WT、NL和L细胞在细胞簇内的分布。 c 说明天然免疫细胞群的UMAP图，显示该簇内分配的簇和WT、NL和L细胞的分布。 d OTULIN免疫细胞组成的流式细胞术分析 Fl/fl 皮肤(WT， n =4只小鼠)和Δ的非松弛(Nl)和皮损(L)。 克尔 OTULIN小鼠( n =5只小鼠。每厘米免疫细胞的绝对数目 2 绘制皮肤图，数据表示手段±SEM。(Mann−Whitney双面检验；* p < 0.5; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001). e 不同条件(LH Langerhans细胞、MC巨噬细胞、DC树突状细胞)所指示的免疫细胞类型的相对归一化细胞频率。 f 角质形成细胞在WT、NL和L皮肤的总角质形成细胞群中表达所指示的HFSC标记的百分比。
ScRNAseq证实Δ中的天然免疫细胞有很强的浸润。 克尔 OTULIN皮肤，而非Δ 克尔 OTULIN皮肤仅能观察到这些免疫细胞的轻微增加，与WT皮肤的情况相比(图1)。 4B，c )。该免疫细胞群的亚聚类和注释表明，该簇主要包含巨噬细胞和树突状细胞(图1)。 4C )。Δ中免疫细胞的逐渐浸润 克尔 OTULIN皮肤显示了在这些小鼠中发展的炎症表型的渐进性。轻度Δ患者天然免疫细胞的高丰度 克尔 流式细胞术证实OTULIN皮肤中CD 45+免疫细胞总数明显增加，与非Δ相比有显着性差异(P<0.05)。 克尔 OTULIN或对照皮肤(图1. 4D )。Δ可见F4/80阳性巨噬细胞、cdc 1、cdc 2、嗜酸性粒细胞和郎格罕细胞明显浸润。 克尔 OTULIN皮肤与非松弛型Δ的关系 克尔 OTULIN或对照皮肤在流式细胞术和scRNAseq(图)。 4D，e ；补充图。 4B )。有趣的是，在小型Δ中可以观察到的最大差别 克尔 流式细胞术分析，OTULIN与非皮损皮肤相比，炎性巨噬细胞(CD 45+CD11b+F4/80+细胞)数量增加(见图4)。 4D )。ScRNAseq分析还显示T细胞群发生了广泛的变化，调节性T细胞(Tregs)大量浸润在病变和非Δ中。 克尔 OTULIN皮肤(附图) 4C−e )，并通过流式细胞术对FoxP 3的数量进行了定量分析。 + T细胞(附图) 4F
我们的scRNAseq数据还显示，用hfc标记标记的几个角质形成细胞群体，如lgr5+、leg1+和sox 9+hfscs，在角质形成细胞和非角质形成细胞中均呈逐渐扩大的趋势，而其他如CD 34+角质形成细胞则逐渐减少在非角化和退变Δ中的频率。 克尔 OTULIN皮肤(图1. 4F 和补充图。 4G )。这些数据表明，在Δ的炎症皮肤条件下，干细胞表现出高度的可塑性。 克尔 OTULIN皮肤，提示在适当调节线性泛素化的缺陷是重要的干细胞谱系在皮肤。这些干细胞变化在免疫细胞大量浸润皮肤之前就已经开始了，因为干细胞群体在非局部Δ中表现出转录变化。 克尔 无明显免疫细胞的OTULIN皮肤比对照皮肤(图1)。 4E，f
1型干扰素在Δ皮炎发病中的作用 克尔 乌托林小鼠 最近的研究发现了1型干扰素在炎症过程中的重要作用。 4 ,17 ,24 。用我们的scRNAseq数据集对IFN刺激的基因(ISGS)进行表达分析，确实发现在OTULIN缺乏的角质形成细胞中ISGS的表达增加。值得注意的是，有多个ISG，例如 IRF 3 , Irf 9 ，和 USP 18 已经在非局部Δ中被上调了 克尔 OTULIN皮肤，提示IFN信号是皮炎皮损发生的早期事件(图一)。 5A )。Δ的Q-PCR分析 克尔 OTULIN和对照表皮尾裂解物证实了在没有OTULIN的情况下，角质形成细胞中ISG和-1型IFN的上调(图1)。 5B
图5：Δ的皮炎 克尔 OTULIN小鼠部分由1型干扰素信号介导. a 热图显示不同条件下角质形成细胞中所指示的干扰素应答基因的平均表达水平，如单细胞rna-seq数据所示。 b 相对mRNA表达 Cxcl-10，ISG 15，Mx-1，Ifnb 1，IFNa 2 ，和 IFITM 3 在8周龄的表皮尾裂解液中 Fl/fl (WT) n =8)和Δ 克尔 OTULIN(KO； n =8)小鼠。数据表示均值±扫描电镜。(*) p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; Mann−Whitney two-sided test). c Δ背部皮肤和尾部(上面板)和H&E染色皮肤切片(下面板)的代表性图像 克尔 OTULIN-IFNAR 1 +/− 和Δ 克尔 OTULIN-IFNAR 1 −/− 老鼠。标尺：200μm。 d 显示Δ百分比的发病图 克尔 奥图林( n =20)和Δ 克尔 OTULIN-IFNAR 1 −/− n =20)皮肤上有损伤的小鼠(*) p =0.0009，对数级测试)。 e 8周龄奥托林血清IL-6、TNF、IL-17和MCP-1水平的研究 Fl/fl n =11)，Δ 克尔 奥图林( n =6)，以及Δ 克尔 OTULIN IFNAR 1 −/− n =6)小鼠(Mann−Whitney双面试验；* p < 0.5; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001). Data represent means ± SEM. f 7只−11周龄小鼠表皮厚度定量。L级 n =每种情况8或10；* p < 0.0001, One-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± SEM. g OTULIN皮肤组织CD 45(绿色)和IFN-β(红色)的免疫荧光染色 Fl/fl 小鼠和Δ的非松弛性(NL)和剥离性(L)皮肤 克尔 OTULIN小鼠。切片用DAPI(蓝色)染色。每基因型8只小鼠进行分析。刻度条：150个μm.内嵌描绘一个放大的视图.
进一步研究1型干扰素在Δ皮肤炎症中是否起关键作用。 克尔 OTULIN小鼠，这些老鼠被杂交到 伊夫纳1 (干扰素-α受体1)-缺乏小鼠。Δ 克尔 OTULIN-IFNAR 1 −/− 与Δ相比，小鼠的皮肤表型得到挽救，皮损发生率较低，皮损发展较晚。 克尔 OTULIN小鼠(图1. 5C，d )，即使在老年(>40周)(补充图)。 3H )。在许多Δ中，IL-6、TNF、IL-17和MCP-1的水平降低到了基线水平。 克尔 OTULIN IFNAR 1 −/− 老鼠(图1. 5E )。然而，当一些Δ 克尔 OTULIN IFNAR 1 −/− 小鼠完全不受皮炎的影响，其他小鼠随着时间的推移仍会发展为皮肤炎症(图二)。 5D−f )。最后，1型干扰素-β的免疫染色显示该细胞因子在Δ中有明显的表达。 克尔 OTULIN皮肤(图1. 5G )。这些数据表明，1型干扰素的产生对Δ炎症性皮损的形成起着至关重要的作用。 克尔 OTULIN小鼠。
Δ皮炎 克尔 OTULIN小鼠是由天然免疫细胞释放的白细胞介素-1β介导的。 接下来，我们开始研究驱动OTULIN缺乏的角质形成细胞对炎症反应的信号。因此，我们利用nichenet算法，通过将相互作用细胞的转录组数据与现有的基因调控网络知识相结合，推断相互作用细胞之间的配体受体联系。 36 。NicheNet分析用于预测先天免疫细胞产生的配体，并与角质形成细胞上的受体结合，从而导致角质形成细胞基因表达谱的改变。 6A )。其中一种顶级的预测配体，我们通过nihenet鉴定，它是通过浸润Δ皮肤中的天然免疫细胞而产生的。 克尔 OTULIN小鼠角质形成细胞调控基因表达，为细胞因子IL-1β。 6A )。这种细胞因子也被NicheNet确认为一种在角质形成细胞中具有调节潜能的配体，当比较非松弛的皮肤和控制皮肤时(补充图)。 5A ，表明IL-1β可能是Δ异常角质形成细胞行为的早期介导者。 克尔 皮肤。在scRNAseq数据集中，我们评估了IL-1β和IL-1家族成员IL-1α和IL-18的表达特征，并观察到IL-1β确实是由浸润Δ皮肤的免疫细胞强烈产生的。 克尔 OTULIN小鼠(图1. 6B 和补充图。 5B )。这种表达谱还显示巨噬细胞是主要的产生IL-1β的细胞群(图). 6B )。有趣的是，除IL-1β和IL-18外，其他参与炎症小体激活和产生IL-1β的基因(包括caspase-1、asc和nlrp 3)也在Δ皮损角质形成细胞中被上调。 克尔 OTULIN小鼠与非致病性Δ角质形成细胞的关系 克尔 OTULIN和野生型小鼠(图1)。 6C )。IL-1β在Δ病理中的作用 克尔 OTULIN小鼠，我们接下来治疗Δ 克尔 人白细胞介素-1受体(IL1R)重组体anakinra的OTULIN小鼠阻断IL-1α和IL-1β与IL1R的结合 37 。每日腹腔注射Δ 克尔 OTULIN小鼠从P18开始含有黑素，可抑制小鼠背部皮肤和尾部皮炎的发展，证实了IL-1β在皮肤病变发展中的重要作用(图一)。 6d 和补充图。 6 )。苦参素治疗Δ皮炎的疗效观察 克尔 OTULIN小鼠的表皮渗透功能在这些小鼠的皮肤上也有明显的恢复(图一)。 6E )。这些数据表明，通过浸润免疫细胞产生的IL-1β参与了Δ的炎症皮肤表型。 克尔 OTULIN小鼠。
图6：白介素-1β介导的天然免疫细胞与OTULIN缺乏的角质形成细胞之间的信号传导调节皮肤炎症. a NicheNet分析的原理图表明，天然免疫细胞分泌的配体与角质形成细胞上的受体结合，介导基因表达的变化。皮损皮肤与非Δ的比较 克尔 皮肤。 b IL-1β、IL-1α和IL-18 mRNA在正常人单个细胞(WT)表达的热图 n =1)，以及Δ 克尔 OTULIN非利害化(NL， n =2)和直线(L， n =3)皮肤，由scRNAseq测定。 c 非特异性Δ炎症信号相关基因平均mrna表达水平的热图研究 克尔 OTULIN与LesionalΔ 克尔 OTULIN角质形成细胞，用scRNAseq分析。 d 每日注射anakinra 300 mg/kg小鼠背部皮肤的典型图片和对照组。提示小鼠的年龄和治疗时间。H&E染色的皮肤在献祭时显示病变的形态。标尺：200μm。 e 经皮水损失(TEWL)测定小鼠非表皮水损失(Nl)和愈合表皮(L)皮肤与未处理的角质皮肤(nl，nl)比较， n =5；治愈的L和未治疗的L n =4；* p < 0.001; ****p < 0.0001, One-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± SEM. f 40 mg/kgα-MCP-1抗体腹腔注射小鼠背部皮肤的典型图片，每周两次。说明治疗时间。H&E染色的皮肤在献祭时显示病变的形态。标尺：200μm。 g 抗α-mcp-1抗体治疗的小鼠非皮肤(NL)和愈合(L)皮肤的TEWL测定 n =5；治愈的L和未治疗的L n =4；* p < 0.001; ****p < 0.0001, One-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± SEM.
在细胞因子IL-1β的旁边，我们还通过NicheNet鉴定了趋化因子MCP-1作为调节角质形成细胞转录变化的配体(补充图)。 5A )。Mcp-1是一种吸引巨噬细胞的趋化因子，因此我们研究了阻断mcp-1是否能抑制Δ的皮炎。 克尔 OTULIN小鼠。事实上，腹腔注射Δ 克尔 用中和α-mcp-1抗体的OTULIN小鼠可以改善但不能完全抑制背部皮肤的皮炎，完全恢复Δ的炎症表型。 克尔 尾皮肤(图1) 6f，g 和补充图。 6 ).
小鼠人类突变的Knockin 奥特林 OTULIN缺乏症基因 人类纯合亚纯突变 奥图林 基因影响蛋白质的去泛素酶活性，已被证明是严重威胁生命的自身炎症综合征(Oras)的基础。 15 ,16 。ORA患者会出现新生儿发热、关节肿胀和腹泻，但也会出现皮炎和血管炎。 15 ,16 ,38 。最具特征的纯合错义突变L272P(c.815T>C；p Leu272Pro)导致OTULIN的稳定性和对M1连接的泛素的活性降低，患者的成纤维细胞和外周血单个核细胞显示NF-κB信号增强和炎性细胞因子的产生。 15 ,16
为了评估L272P基因突变的重要性，我们构建了一株新的基因敲除蛋白转基因小鼠株，表达了OTULIN基因。 L272P 通过CRISPR/CAS基因编辑技术进行突变(小鼠保守氨基酸L 272)。通过PCR扩增和对靶点周围DNA序列的测序，验证了所需的点突变。 7A )。杂合子OTULIN L272P/+ Knockin小鼠杂交到纯合子，但没有纯合子OTULIN。 L272 P/L272 P 老鼠出生了(表) 1 )，证实了这些小鼠脱泛素酶功能丧失所致的致死性表型，与以前在OTULIN基因敲除小鼠中所显示的一致。 15 ,24 ，在表达催化活性(C129A)OTULIN的基因敲除小鼠中 17 ，以及 甘比 具有点突变(W96R或D336E)的小鼠 奥特林 从而消除了它与泛素结合的能力 13 。然而，奥图林 L272 P/L272 P 奥图林可以拯救生命 L272P 小鼠被杂交成caspase-8和rIPK 3缺乏背景(表)。 1 还有无花果。 7b，c )。奥图林 L272 P/L272 P Casp8 − /− RIPK 3 − /− 小鼠以孟德尔氏数出生，发育正常，无炎症迹象(表) 1 、图1. 7b，c 除了Casp8所发展的淋巴增殖综合征 −/− RIPK 3 −/− 如前所述，老鼠 39 ,40 。这一拯救意味着异常的细胞死亡触发了OTULIN的致命性。 L272 P/L272 P 老鼠。
图7：小鼠人类突变的Knockin 奥特林 OTULIN缺乏症。 a 小鼠L272P突变的延迟策略 奥特林 等位基因。 b OTULIN背部皮肤和尾部(上面板)和H&E染色皮肤切片(下面板)的代表性图像 L272P/+ 奥图林 L272P/ΔKer ，和奥图林 L272 P/L272 P Casp8 −/− RIPK 3 −/− 老鼠。标尺：200μm。 c 7只−11周龄小鼠表皮厚度定量。L级 n =每项条件10；* p < 0.0001, One-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± SEM. d 7周龄OTULIN表皮尾裂解物的免疫印迹 Fl/fl n =2)， ΔKer 奥图林( n =2)和OTULIN L272P/ΔKer n (2)用抗体检测HOIP、Sharpin和OTULIN的小鼠。抗肌动蛋白被显示为负载控制。分子量标记单位以千吨数(KD)为单位。
表1.说明所指示杂交后代的数量(观察和预期比率)。 我们下一次穿越奥图林 L272P/+ 杂合子角质形成细胞特异性OTULIN缺陷小鼠产生OTULIN的Knockin小鼠 L272P/ΔKer 小鼠，在所有细胞和组织中都有一个L272P基因敲除等位基因，在角质形成细胞中有一个OTULIN基因敲除等位基因。这些小鼠在背部皮肤上以与Δ相似的方式和时间发生皮肤损伤和疣状癌。 克尔 OTULIN小鼠(图1. 7b，c )。OTULIN分离的PMKs的免疫印迹研究 L272P/ΔKer 小鼠证实OTULIN、Sharpin和HOIP的稳定性降低(图1)。 7D
这些发现共同证明了人相关的OTULIN突变在小鼠体内的表达与角质细胞特异性的OTULIN基因敲除小鼠所观察到的炎症皮肤表型相似，证实了线性蛋白泛素化的适当调控对哺乳动物皮肤的动态平衡是至关重要的。
