角质形成细胞特异性消融术引起皮肤炎症 为了研究OTULIN在表皮中的作用，我们杂交。 奥特林 Fl/fl 小白鼠 K14-CRE 角朊细胞特异性角蛋白14(K14)启动子调控下表达cre重组酶的转基因小鼠 25 (补充图。 1A 奥特林 Fl/fl K14-CRE 小鼠(下称OTULIN) E-KO )在角质形成细胞中缺乏OTULIN是按预期的孟德尔比率出生的，在出生后的第一天，从宏观上看与他们的没有区别。 奥特林 Fl/fl 不表达Cre重组酶的小分子。奥图林 E-KO 小鼠在出生后6天左右开始发生涉及背部和尾部皮肤的自发皮肤损害。背部皮肤表现为少数局限于颈部的局限性炎症灶，而病变影响整个尾部(补充图)。 1A )。表型随着年龄的增长而发展，约50%的小鼠在3周龄时被剔除，原因是由于达到了预先确定的严重程度标准，特别是在尾部病变方面(补充图1)。 1A )。奥图林 E-KO 在生命的最初几周，没有出现严重皮肤损伤的小鼠可以维持14周的寿命(补充图)。 1B )。这些小鼠背部的皮肤病变在严重程度上有所进展，但仍局限于类似乳头状瘤的小炎症灶(图1)。 1A
图1：角质形成细胞中缺乏OTULIN的小鼠出现皮肤炎症。 a 乌托林皮损照片 E-KO 3周龄和14周龄小鼠和OTULIN 3周龄或14周龄小鼠皮肤切片的典型图像 E-KO ，用苏木精和伊红(H&E)染色。所显示的图像是OTULIN的代表 E-KO 老鼠( n =25)。标尺：h&E=200μm。 b 所示基因型3周龄小鼠皮肤切片的代表图像，H&E染色 n =10)或用抗Caspase 3(CC3)的抗体染色(CC3)( n =6)，裂解的caspase 8(CC8)( n =6)或Ki 67( n =6)。染色为Ki-67的表皮用一条虚线表示，箭头指向毛囊。标尺H&E=100μm；CC3，CC8，Ki-67=50μm。 c 用抗角蛋白10(K10)、角蛋白14(K14)抗体免疫染色的3周龄小鼠皮肤切片的典型图像。 n 角蛋白6(K6)( n =6)，F4/80( n =6)和Gr-1( n =6)，用DAPI(DNA染色)进行染色。标尺：K10，K14，K6=20μm；F4/80，Gr-1=30μm。 d OTULIN基因表达数据的热图 E-KO 与小白蚁皮肤比较的皮损组织或非角质皮肤组织 奥特林 Fl/FL 控制老鼠。列代表3周龄小鼠的基因表达谱( n =5)，显示≥1的绝对log2(FoldChange)和未校正的基因 p ≤值0.0 5。未更正 p 数值被故意用于包含最大数量的基因在图中，同时排除明显无关的基因。统计检验 p 值是没有差异表达式的Wald测试，即log 2(FoldChange)为零。它是由生物导体R软件包DESeq 2的函数nbinomWaldtest计算的，它是基于负二项分布的基因计数的一般线性模型计算的。对照鼠包括不表达的小分子。 K14-CRE 。来源数据 d 作为源数据文件提供。
3~14周龄大鼠背部皮肤和尾部组织切片的组织学分析 E-KO 小鼠的表皮明显增厚，其中含有大量增殖的角质形成细胞，免疫组化显示Ki-67(如图所示)。 1B 和补充图。 1C )。此外，表皮分化标记物免疫染色显示基底角朊细胞标记K14的表达增加，分化标志角蛋白10(K10)在OTULIN皮肤中的表达减少。 E-KO 小鼠，与增生表皮一致(图)。 1C 和补充图。 1D )。表皮角蛋白6(K6)表达强，是表皮增生性和炎症的标志，同时F4/80含量增加。 + 髓系细胞与Gr-1 + 真皮粒细胞。 1C 和补充图。 1D )。此外，皮损中含有少量的死亡角质形成细胞，其中一些细胞被活化的Caspase-3(CC3)和Caspase-8(CC8)免疫染色(图8)。 1B 和补充图。 1C )。免疫组织学分析表明OTULIN E-KO 小鼠发生炎症性增生性皮损与角质形成细胞死亡有关，而角质形成细胞的死亡是由caspase依赖和caspase无关的机制引起的。有趣的是，奥图林的背部皮肤 E-KO 小鼠表皮厚度正常，无增生、分化改变、炎症或角质形成细胞死亡的迹象。 1B，c 和补充图。 1C，d )。然而，OTULIN非皮肤的rna序列基因表达谱的比较 E-KO 野生型(WT)皮肤显示I型干扰素(IFN)相关基因上调。 1D )。此外，基因集富集分析显示，与I型干扰素信号和抗病毒反应信号有关的基因在OTULIN非皮肤中显著上调。 E-KO 小鼠(补充表) 1 )。这些变化在奥图林的皮损中更显着。 E-KO 此外，小鼠的天然免疫激活和炎症相关基因的表达增加(补充表) 2 )。因此，I型IFN反应的上调似乎是OTULIN皮肤的一个显著特征。 E-KO 小鼠甚至在没有损伤的区域，而松弛的皮肤是以诱导炎症基因为特征的。
角质形成细胞中的TNFR 1信号引起OTULIN的皮肤炎症 E-KO 小鼠 抗肿瘤坏死因子(TNF)治疗对人口腔疾病患者和诱导性全身OTULIN缺乏小鼠的治疗以前曾被证明能预防全身炎症。 19 ,20 ,21 。探讨表皮角质形成细胞中的TNFR 1信号是否与OTULIN炎症性皮损的发生有关。 E-KO 老鼠，我们 奥特林 Fl/fl Tnfr1 Fl/fl K14-CRE (下称OTULIN E-KO ；TNFR 1 E-KO )老鼠。与奥图林不同 E-KO 小鼠，OTULIN E-KO ；TNFR 1 E-KO 小鼠在生命的最初几周内没有发生皮肤病变，并且至少在1岁之前保持无损伤状态(见图)。 2A，b 和补充图。 2A，b )。值得注意的是，杂合子角质形成细胞特异性的tnfr 1消融也有力地改善了otulin皮肤病理的发展。 E-KO 老鼠(图1. 2A，b )。对背部和尾部皮肤组织的组织学分析表明，角质形成细胞特异性消融tnfr 1完全防止了表皮增生、角质形成细胞死亡和OTULIN中髓样细胞的浸润。 E-KO 老鼠(图1. 2C，d 和补充图。 2C，d )。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)对某些炎症细胞因子和趋化因子的分析表明， Ccl 3 , Cxcl 3 , IL6 , IL1b , 肿瘤坏死因子 , Cxcl 9 和 Cxcl 10 在一些OTULIN的皮肤中被上调 E-KO 老鼠(图1. 2E )。这些基因的表达水平在不同的OTULIN之间有很大的差异。 E-KO 小鼠，可能是由于皮肤损伤高度集中，这使得很难确保在用于RNA制备的样本中存在同样数量的松弛皮肤。上皮特异性TNFR 1消融一般抑制OTULIN皮肤细胞因子和趋化因子的上调。 E-KO 2E )。综上所述，这些发现表明角质细胞内存在的TNFR 1信号对于OTULIN的炎症性皮损的发展至关重要。 E-KO 老鼠。
图2：角质形成细胞中的TNFR 1信号在OTULIN引起皮肤炎症 E-KO 老鼠。 a Kaplan-Meier图描述了所述基因型小鼠的存活情况。 b 图示所示基因型小鼠宏观皮肤评分的图表。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。c 所示基因型3周龄小鼠皮肤切片的代表图像，H&E染色 n =6)或免疫染色抗CC3( n =5)，反CC8( n =5)或反Ki-67( n =5)抗体。标尺：h&E=100μm；CC3，CC8，Ki-67=50μm。 d 3周龄所示基因型小鼠皮肤切片的典型图像，抗K10，抗K14免疫染色( n =5)，反K6( n =5)，反F4/80( n =3)和反Gr-1( n (3)抗体，DAPI(DNA染色)染色。标尺：K10，K14，K6=20μm；F4/80，Gr-1=30μm。 e 用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定3周龄小鼠全皮肤组织中指示基因的相对mRNA表达情况。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。对照鼠包括不表达的小分子。K14-CRE 。来源数据 a , b , e 作为源数据文件提供。
与tnfr 1结合的肿瘤坏死因子不仅通过激活NF-κB和MAPK信号来促进炎症基因的表达，而且在促进生存的信号受损时也会导致细胞死亡。 3 。为了了解OTULIN缺乏的角质形成细胞中TNFR 1信号引起皮肤炎症的机制，我们对3周龄和14周龄的皮肤总蛋白裂解物进行了免疫印迹分析。 E-KO 控制小老鼠。用识别m1连接泛素链的抗体进行免疫印迹显示，OTULIN的皮肤中存在大量线性泛素链。 E-KO 小鼠与WT小鼠相比，OTULIN脱泛素酶活性的丧失是一致的。 3A )。有趣的是，我们没有检测到乌托林皮肤中线性泛素链数量的增加。 E-KO 老鼠(图1. 3A )。一种解释可能是其他的去泛素酶可能能够部分补偿OTULIN的丢失，特别是在正常的稳态条件下角质形成细胞中。然而，100%的小鼠出现局灶性病变，这些受累的皮肤区域表现出M1链的聚集，提示需要局部触发才能引起炎症反应，这与M1泛素化升高有关。炎症环境也可能进一步增强M1泛素化，但由于增生性皮肤反应与免疫细胞浸润同时发生，事件的层次性很难解决。此外，OTULIN皮肤和尾组织NF-κB和MAPK信号通路的激活没有明显改变。 E-KO 小鼠与未白蚁对照小鼠比较(图一)。 3B )。应该注意的是，这些样本是从含有非表皮细胞的总组织中制备的。 K14-CRE 因此，如免疫印迹所示，表达OTULIN(如图所示)。 3B )。此外，从OTULIN中分离出原代角质形成细胞 E-KO 与对照角质形成细胞相比，小鼠在刺激肿瘤坏死因子后，NF-κB和MAPK信号的激活相似(图1)。 3C )，提示OTULIN缺乏对TNF诱导的促炎信号无明显影响。OTULIN的缺失可以降低某些细胞类型(如T细胞、B细胞和成纤维细胞)中LUBAC组分的蛋白水平，而在髓系细胞中却没有降低。 19 ,22 。在OTULIN缺乏的角质形成细胞中Sharpin和HOIP蛋白水平没有明显降低(图1)。 3C 和补充图。 3A )，提示该表型不是LUBAC缺乏所致。我们随后检查了OTULIN缺乏的角质形成细胞是否表现出TNF诱导的细胞死亡反应.实时活细胞显像显示，TNF单独或联合PAN-caspase抑制剂Z-VAD-fmk和Smac模拟复合鸟苷对对照组和OTULIN缺乏角朊细胞诱导细胞死亡的程度和动力学相似(图1)。 3D，e 和补充图。 3B )。然而，在原代角质形成细胞培养中观察到的自发死亡量的增加，可能掩盖了OTULIN缺乏对TNF诱导的细胞死亡的任何轻微的致敏作用(图一)。 3D，e 和补充图。 3B
图3：正常TNF诱导的OTULIN缺乏的原代角质形成细胞炎症和细胞死亡信号。 a 3周龄和14周龄OTULIN皮损及非皮损组织蛋白质提取物的代表性免疫印迹分析 E-KO 或以抗线性(m1-链状)泛素链或微管蛋白抗体作为负载对照的小鼠( n =3)。 b 3~14周龄OTULIN皮肤和尾部组织蛋白质提取物的代表性免疫印迹分析 E-KO 有指示抗体的小鼠或WT小鼠( n =4)。 c OTULIN原代角质形成细胞蛋白提取物特异性抗体的代表性免疫印迹分析 E-KO 用肿瘤坏死因子刺激的小鼠或对照组小鼠所指示的时间点( n =4)。NS=非特异性。 d OTULIN原代角质形成细胞Draq 7摄取法测定细胞死亡 E-KO 肿瘤坏死因子(T)(20 Ng Ml)联合治疗的对照组小鼠 −1 )，SMAC模拟(S，Birinapant)或Z-VAD-fmk(Z)，24小时。 n =6)。 e T(20 Ng Ml)联合处理所指示基因型的原代角质形成细胞的代表性图像 −1 )，S或Z，24小时( n =6)。死亡细胞在24小时后从Draq 7摄取染红，刻度BAR=400μm。对照小鼠包括少量OTULIN。 E-KO 不表达的老鼠 K14-CRE 。对照鼠包括不表达的小分子。 K14-CRE 。来源数据 a –d 作为源数据文件提供。
RIPK 1激酶活性抑制预防OTULIN皮肤炎症 E-KO 小鼠 虽然我们的体外研究不能检测到肿瘤坏死因子(TNF-)引起的OTULIN缺乏的角质形成细胞的死亡，但OTULIN表皮中存在着死亡的角质形成细胞。 E-KO 小鼠促使我们研究TNFR 1介导的细胞死亡是否与这些小鼠皮肤损伤的发展有关。当tnfr 1信号元件线性泛素化时，TNF通过激活ripk 1激酶介导的凋亡和坏死而导致细胞死亡。 4 ,22 ,26 。因此，我们推测TNFR 1可能是导致OTULIN皮肤炎症的原因之一。 E-KO 通过触发角质形成细胞RIPK 1激酶依赖的细胞死亡，探讨RIPK 1激酶活性在小鼠角质形成细胞中的作用 E-KO 带着 Ripk 1 D138N/D138N 表达激酶活性RIPK1D138N的小鼠。 奥特林 Fl/fl K14-CRE Ripk 1 D138N/D138N 小鼠(下称OTULIN) E-KO Ripk 1 D138N/D138N )至少在1岁时没有出现宏观可见的皮肤病变(图一)。 4A，b 和补充图。 4A，b )。对背部和尾部皮肤组织的组织学分析表明，RIPK 1激酶活性的丧失可防止3周龄大鼠表皮增生、角质形成细胞死亡和髓系细胞浸润。 E-KO 老鼠(图1. 4C，d )。此外，对某些炎性细胞因子和趋化因子的qRT-PCR分析表明，抑制RIPK 1激酶活性也降低了OTULIN皮肤中炎症基因的表达。 E-KO 老鼠(图1. 4E )。有趣的是，OTULIN背部和尾部皮肤切片的组织学分析 E-KO Ripk 1 D138N/D138N 1岁左右的老鼠发现一些皮肤区域表现出轻微的表皮增生，Ki-67的数量略有增加。 + 表皮角质形成细胞和K6表达轻度上调(附图)。 4C，d )。老年奥托林轻度皮肤改变的研究进展 E-KO Ripk 1 D138N/D138N 与TNFR 1缺乏症所提供的完全保护形成鲜明对比，表明RIPK 1激酶活性与TNFR 1信号无关是导致老年动物皮肤轻度改变的原因。因此，RIPK 1激酶活性依赖信号驱动角质形成细胞死亡、表皮增生和皮肤炎症。 E-KO 老鼠。
图4：OTULIN皮肤炎症的发展需要RIPK 1激酶活性。 E-KO 老鼠。 a Kaplan-Meier图描述了所述基因型小鼠的存活情况。 b 图示所示基因型小鼠宏观皮肤评分的图表。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。c H&E染色3周龄小鼠皮肤切片的典型图像 n =5)或用抗CC3染色( n =3)，反CC8( n =3)或反Ki-67( n =3)抗体。标尺：h&E=100μm；CC3，CC8，Ki-67=50μm。 d 3周龄所示基因型小鼠皮肤切片的典型图像，抗K10，抗K14免疫染色( n =4)，反K6( n =3)，反F4/80( n =3)和反Gr-1( n (3)抗体，DAPI(DNA染色)染色。标尺：K10，K14，K6=20μm；F4/80，Gr-1=30μm。 e 用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定3周龄小鼠全皮肤组织中指示基因的相对mRNA表达情况。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。对照鼠包括不表达的小分子。K14-CRE 。来源数据 a , b , e 作为源数据文件提供。
RIPK 3-MLKL介导的坏死导致OTULIN的皮肤炎症 E-KO 小鼠 RIPK 1激酶活性可诱导FADD-caspase-8依赖性凋亡和RIPK 3-MLKL依赖性的坏死.因为坏死是一种高度炎症的细胞死亡 3 我们推测RIPK 1依赖性角质形成细胞坏死可能参与了OTULIN皮肤病变的发展。 E-KO 老鼠。因此，为了评估身体下垂的作用，我们杂交了OTULIN。 E-KO 小白鼠 RIPK 3 −/− 和 MLKL −/− 老鼠。奥图林 E-KO RIPK 3 −/− 和奥图林 E-KO MLKL −/− 小鼠受到强烈的保护，不受严重皮肤损害的影响，只有在宏观上检测到皮肤变化的轻微迹象，表现为背部皮肤有小斑点，但尾部没有损伤(图5)。 5A，b 和 6a，b 和附图。 5A，b 和 6a，b )。RIPK 3或MLKL杂合子缺乏症也显著改善了OTULIN的皮肤病理。 E-KO 暗示基因剂量效应的小鼠(无花果。 5A，b 和 6a，b )。3周龄大鼠背部和尾部皮肤组织学分析 E-KO RIPK 3 −/− 和奥图林 E-KO MLKL −/− 小鼠证实没有严重的皮肤损害，只显示小面积显示轻度增加的角质形成细胞增殖和轻微增加的免疫细胞浸润(图五)。 5C，d 和 6C，d )。对皮肤RNA的qRT-PCR分析显示，OTULIN中一些但不是所有炎症基因的表达都降低了。 E-KO RIPK 3 −/− 和奥图林 E-KO MLKL −/− 小鼠与奥托林的比较 E-KO 动物(无花果) 5E 和 6E )，与RIPK 3或MLKL缺乏症不能完全阻止皮损发生的组织学表现相一致。随访1年后，发现OTULIN的皮损 E-KO RIPK 3 −/− 和奥图林 E-KO MLKL −/− 根据宏观和组织学评价，小鼠没有进展，保持温和(附图)。 5B-d 和 6B-d )。这些结果表明，RIPK 3或MLKL缺乏症对OTULIN的炎症性皮肤病理有明显的改善作用。 E-KO 说明RIPK 3-MLKL依赖性坏死在皮肤病变的发病机制中起重要作用.
图5：RIPK 3介导的信号增强OTULIN的皮肤炎症 E-KO 老鼠。 a Kaplan-Meier图描述了所述基因型小鼠的存活情况。 b 图示所示基因型小鼠宏观皮肤评分的图表。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。c 所示基因型3周龄小鼠皮肤切片的代表图像，H&E染色 n =5)或用抗CC3染色( n =5)，反CC8( n =5)或反Ki-67( n =5)抗体。标尺：h&E=100μm；CC3，CC8，Ki-67=50μm。 d 3周龄所示基因型小鼠皮肤切片的典型图像，抗K10，抗K14免疫染色( n =5)，反K6( n =5)，反F4/80( n =5)和反Gr-1( n (5)抗体，用DAPI(DNA染色)染色。标尺：K10，K14，K6=20μm；F4/80，Gr-1=30μm。 e 用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定3周龄小鼠全皮肤组织中指示基因的相对mRNA表达情况。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。对照鼠包括不表达的小分子。K14-CRE 。来源数据 a , b , e 作为源数据文件提供。
图6：MLKL介导的坏死引起OTULIN的皮肤炎症 E-KO 老鼠。 a Kaplan-Meier图描述了所述基因型小鼠的存活情况。 b 图示所示基因型小鼠宏观皮肤评分的图表。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。c 所示基因型3周龄小鼠皮肤切片的代表图像，H&E染色 n =4)或用抗CC3染色( n =3)，反CC8( n =3)或反Ki-67( n =3)抗体。标尺：h&E=100μm；CC3，CC8，Ki-67=50μm。 d 3周龄所示基因型小鼠皮肤切片的典型图像，抗K10，抗K14免疫染色( n =4)，反K6( n =3)，反F4/80( n =3)和反Gr-1( n (3)抗体，DAPI(DNA染色)染色。标尺：K10，K14，K6=20μm；F4/80，Gr-1=30μm。 e 用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定3周龄小鼠全皮肤组织中指示基因的相对mRNA表达情况。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。对照鼠包括不表达的小分子。K14-CRE 。来源数据 a , b , e 作为源数据文件提供。
FADD和RIPK 3联合消融完全预防OTULIN皮肤病变的发生 E-KO 小鼠 RIPK 3和MLKL缺陷可明显改善OTULIN的皮损，但不能完全阻止皮损的发展。 E-KO 提示，非坏死性TNFR1-RIPK 1信号也与病理有关。OTULIN皮肤切片中CC8和CC3的免疫组化染色 E-KO 提示Caspase-8介导的细胞凋亡除坏死外，还可能参与皮肤病变的发展。因此，为了评估caspase-8介导的细胞死亡的潜在贡献，我们生成了OTULIN。 E-KO 在角质形成细胞和所有细胞中缺乏特异性的FADD和RIPK 3的小鼠( 奥特林 Fl/fl FADD Fl/fl K14-CRE RIPK 3 −/− ，以下简称OTULIN E-KO FADD E-KO RIPK 3 −/− 老鼠)。联合抑制FADD-caspase-8介导的细胞凋亡和RIPK 3-MLKL依赖的凋亡抑制OTULIN皮肤病变的发生 E-KO FADD E-KO RIPK 3 −/− 小鼠至少在1岁以下，从背部和尾部皮肤的宏观和组织学分析中可以看出(见图)。 7A-d 和补充图。 7A-d )。3周龄OTULIN皮肤mRNA的qRT-PCR分析 E-KO FADD E-KO RIPK 3 −/− 小鼠 Ccl 3 , Cxcl 3 , 肿瘤坏死因子 和 艾尔 6 已恢复到正常小鼠的水平；然而，Ⅰ型干扰素应答基因的表达却是正常的。 Cxcl 9 和 Cxcl 10 以及 艾尔 1β 与OTULIN相比没有被抑制 E-KO 老鼠(图1. 7E )。综上所述，这些结果证明了OTULIN的炎症性皮肤病理的发展。 E-KO 小鼠主要受RIPK 3-MLKL依赖性坏死的驱动，但当坏死被阻断时，FADD-caspase-8依赖的凋亡也通过诱导轻度皮肤损伤而起作用。
图7：FADD和RIPK 3联合消融完全防止OTULIN皮肤病变的发展 E-KO 老鼠。 a Kaplan-Meier图描述了所述基因型小鼠的存活情况。 b 图示所示基因型小鼠宏观皮肤评分的图表。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。c 所示基因型3周龄小鼠皮肤切片的代表图像，H&E染色 n =6)或免疫染色抗CC3( n =4)，反CC8( n =4)或反Ki-67( n =3)抗体。标尺H&E=100μm；CC3，CC8，Ki-67=50μm。 d 所示基因型的3周龄小鼠皮肤切片的代表性图像( n >5)，免疫染色抗K10，抗K14( n =4)，反K6( n =4)，反F4/80( n =3)和反Gr-1( n (3)抗体，DAPI(DNA染色)染色。标尺K10，K14，K6=20μm；F4/80，Gr-1=30μm。 e 用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定3周龄小鼠全皮肤组织中指示基因的相对mRNA表达情况。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。对照鼠包括不表达的小分子。K14-CRE 。来源数据 a , b , e 作为源数据文件提供。
MyD 88信号在OTULIN皮肤病理中的作用 E-KO 小鼠 奥图林 E-KO 小鼠在出生后的头几周就会出现皮肤损伤，这表明环境因素导致了皮肤病理的发生。皮肤中含有共生细菌的定植发生在出生后，可能通过激活Toll样受体(Tlr)信号来驱动TNF和其他炎症介质的表达，从而促进病变的发展。 27 。为了评估TLR信号的可能作用，我们生成了OTULIN。 E-KO 介导tlr诱导炎症基因表达的关键适配器myd 88的缺失 28 ,29 。的确，Otulin Fl/fl K14-CRE MyD 88 −/− 小鼠(下称OTULIN) E-KO MyD 88 −/− )受到强烈的保护，免受皮肤损害的发展，这些动物大多数保持无损伤，直到14周龄(图1)。 8a，b 和补充图。 8A )。3周龄OTULIN皮肤组织病理学分析 E-KO MyD 88 −/− 小鼠只有轻度增加的角质形成细胞增殖，没有明显的皮肤炎症迹象(图一)。 8C，d )。当观察到50周龄时，50%的OTULIN E-KO MyD 88 −/− 小鼠皮肤病理轻度(附图)。 8B-d )。此外，基因表达分析表明，MyD 88缺乏抑制了OTULIN中大多数炎症基因的上调。 E-KO 老鼠(图1. 8E )。这些结果表明MyD 88信号对OTULIN炎症性皮损的发生有重要作用。 E-KO 小鼠，表明TLR的激活可能是由寄生在皮肤上的共生细菌引起的，可能与触发反应有关。
图8：MyD 88依赖信号在OTULIN皮肤病理过程中的作用 E-KO 老鼠。 a Kaplan-Meier图描述了所述基因型小鼠的存活情况。 b 图示所示基因型小鼠宏观皮肤评分的图表。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。c 所示基因型3周龄小鼠皮肤切片的典型图像，H&E染色( n =5)或用抗CC3染色( n =5)，反CC8( n =5)或反Ki-67( n =5)抗体。标尺：h&E=100μm；CC3，CC8，Ki-67=50μm。 d 3周龄所示基因型小鼠皮肤切片的典型图像，抗K10，抗K14免疫染色( n =5)，反K6( n =5)，反F4/80( n =5)和反Gr-1( n (5)抗体，用DAPI(DNA染色)染色。标尺：K10，K14，K6=20μm；F4/80，Gr-1=30μm。 e 用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定3周龄小鼠全皮肤组织中指示基因的相对mRNA表达情况。图中的点代表单个老鼠。平均±S.E.M.在所有图表中为每一组老鼠显示。用Kruskal-Wallis检验(单侧)确定统计学意义。对照鼠包括不表达的小分子。K14-CRE 。来源数据 a , b , e 作为源数据文件提供。
