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一种表达全长抗体的肿瘤病毒增强了对胶质母细胞瘤的抗肿瘤天然免疫应答

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发表时间:2021-10-11 15:13作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

肿瘤性单纯疱疹病毒-1能够溶解肿瘤细胞,同时提醒免疫系统。CD 47与SIRPα协同作用,是抑制天然免疫细胞吞噬的重要免疫检查点。这里我们展示了表达全长抗(α)人CD 47 IgG 1或IgG 4抗体的肿瘤性疱疹病毒对胶质母细胞瘤的区域控制。受病毒感染的胶质母细胞瘤细胞分泌的抗体阻断CD 47‘不吃Me’信号,而αCD47-IgG 1由于巨噬细胞对抗体依赖的细胞吞噬作用和NK细胞的抗体依赖性细胞毒性,对肿瘤的杀伤作用强于αCD47-IgG 4。体内注射αCD 47-IgG 1产生病毒可持续释放肿瘤微环境中各自的抗体,但不能进入全身循环;此外,αCD47-IgG 1产生病毒对荷瘤小鼠的存活率的改善也优于对照αCD 47-IgG 1。免疫活性小鼠肿瘤模型的结果进一步证实,巨噬细胞和较小程度的NK细胞介导产生抗体的巨细胞疱疹病毒的抗肿瘤细胞毒性。总之,编码全长抗体的单疱型单疱病毒-1可提高胶质母细胞瘤的免疫病毒治疗水平.

导言

胶质母细胞瘤(gliobla瘤,GBM)是最常见、最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤。接受手术切除、化疗和放疗等护理标准的GBM患者的中位生存期约为15个月。1。由于本病早期浸润性,完全手术切除GBM很大程度上是不可能的。GBM对化疗和放疗的内在耐药性也是导致临床疗效差的原因之一。鉴于这些特点,迫切需要新的治疗药物来改善GBM患者的预后。

肿瘤病毒(oncolyticvirus,OV)的作用机制与治疗GBM的标准方法完全不同,为GBM提供了一种潜在的独特治疗方法。单纯疱疹病毒1型(OHSV)是目前研究最广泛的肿瘤病毒之一,其基因工程使其能够选择性地裂解癌细胞,同时使正常细胞基本保持完整。和其他许多OVS一样,oHSV也能提醒患者的免疫系统攻击肿瘤细胞。第一种美国食品及药物管理局批准的抗肿瘤病毒疗法,是以oHSV载体为基础的。2。OHSV被证明是相对安全的,并且在治疗GBM方面显示了一些活性。3。在我们以前的研究中,我们发现ohsv治疗显著增加了免疫细胞的瘤内浸润。4,5,6,7,8,9。然而,肿瘤细胞已经进化到进入免疫检查点,如CD 47和pd-l1,并向下调节免疫细胞,从而避免了抗肿瘤免疫反应。10,11。因此,表达一种能增强免疫应答和(或)阻断免疫检查点参与的转基因技术可以有效地提高oHSV对GBM的整体疗效。

摘要肿瘤相关巨噬细胞(Tams)是GBM微环境中主要的促肿瘤免疫细胞。12,13。因此,在GBM中对TAMS进行再教育可以提供一种有前景的抗肿瘤策略。14,15。CD 47-信号调节蛋白α(sirpα)通路是研究最多的巨噬细胞吞噬检查点之一。16。CD 47-sirpα髓系检查点阻滞已被证明能有效地增强肿瘤吞噬功能,减轻肿瘤负担。17,18,19,20。一种人源化的抗CD 47单克隆抗体(MAb)目前正在临床试验中,它直接抑制CD 47−sirpα的相互作用。21并在多种小鼠模型中显示出较强的抗GBM活性。18。出于安全考虑,这种抗体通常被设计在人IgG 4支架上,以减少天然免疫的fc依赖性效应功能,如自然杀伤(NK)细胞抗体依赖的细胞细胞毒性(Adc)和巨噬细胞抗体依赖的细胞吞噬功能(Afp)。22。IgG 1型抗CD 47抗体应具有ADCP和ADCC抗GBM活性,但输注毒性和穿透血−脑屏障困难是限制IgG 1型抗CD 47抗体系统治疗GBM的当前挑战。

在本实验中,我们在人IgG 1支架上(称为ov-αCD 47-G1)上构建了一株携带全长抗CD 47抗体的重组病毒,另一株作为对照,在人IgG 4支架上携带全长抗CD 47抗体(OV-αCD 47-G4)。感染OV-αCD 47-G1或OV-αCD 47-G4的GBM细胞分泌的抗体通过阻断CD 47−SIRPα轴而增强肿瘤的吞噬功能,而分泌的αCD 47-G1而不是αCD47-G4也能诱导巨噬细胞以FC受体介导的肿瘤吞噬作用,NK细胞对肿瘤的杀伤作用。在体内,颅内(I.C.)OV-αCD 47-G1和OV-αCD47-G4可使两种抗体持续释放到GBM肿瘤微环境中,而OV-αCD47-G1与OV-αCD47-G4或亲本OV-Q1相比,效果更好,存活时间明显延长。我们的发现表明,工程的HSV表达全长抗CD 47抗体,特别是IgG 1版本,并进行区域传递,是加强GBM抗肿瘤病毒治疗的一种有前景的无毒方法。

结果

Ov-αCD 47-G1或OV-αCD 47-G4感染的GBM细胞分泌全长抗CD 47抗体

我们首先评估了六种人GBM细胞系,包括患者源性干细胞样GBM 30、GBM 43和BT 422,并观察到每种细胞表面均有CD 47的均匀表达(图一)。1A和补充图。1)。然后,我们构建了αCD47-G1和αCD47-G4,分别是IgG 1和IgG 4版本的人源化抗人CD 47抗体(克隆5F9)。αCD 47-G4像以前报道的那样被重建。22。用人IgG 1恒定区取代人αCD 47-G4的人IgG 4恒定区,构建αCD 47-G1。将携带全长重链和轻链编码基因的慢病毒导入CHO细胞,产生αCD 47-G1和αCD 47-G4,进行功能检测。CD 47结合实验结果表明,αCD 47-G1和αCD 47-G4与CD 47(+)U251T2 GBM细胞具有相似的剂量依赖性结合亲和力,表明这两种抗体与CD 47(+)U251T2细胞的结合亲和力基本相同。1B)。CD 47阻断实验结果显示,α、CD 47-G1和αCD 47-G4具有类似的剂量依赖性CD 47阻断能力。1C)。接下来,我们利用亲本ov-q1,通过灭活的核糖核酸还原酶基因(Icp 6)和神经毒力基因(icp 34.5)的缺失,获得了表达αcd 47-g1或αcd 47-g4的oHSv,这两种基因都限制了其向肿瘤细胞的复制,并降低了其神经毒力。23,24(无花果)1D)。将αCD 47-G1或αCD 47-G4的轻链和重链编码基因与编码T2A自切肽的DNA序列连接,插入到OV-Q1启动子IE4/5启动子的OV-Q1中。1D)。这两个ohsv是以我们以前报告的方式生成的。4并命名为OV-αCD 47-G1和OV-αCD 47-G4.野生型人类HSV-1、OV-Q1、OV-αCD 47-G1和OV-αCD47-G4的遗传图谱如图所示.1D。用OV-αCD 47-G1或OV-αCD 47-G4感染GBM细胞,可使感染细胞分别分泌αCD47-G1或αCD47-G4。取OV-αCD 47-G1-、OV-αCD 47-G4-和OV-Q1感染的U251T2 GBM细胞及表达αCD 47-G1和αCD 47-G4的CHO细胞和对照CHO细胞培养上清进行免疫印迹试验,结果表明OV-αCD47-G1-和OV-αCD47-G4感染的U251T2 GBM细胞上清液中存在人IgG重链和轻链。1E)。OV-αCD47-G1-和OV-αCD47-G4-感染的U251T2 GBM细胞表达的轻链相对分子质量比使用双质粒系统的CHO细胞的分子量高,这可能是由于gbm细胞中甘氨酸(G)和脯氨酸(P)在其C-端的自身断裂导致轻链中T2A残基残留的17个氨基酸N-端残基所致。25(无花果)1E)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定OV-αCD 47-G1-和OV-αCD 47-G4感染的U251T2 GBM细胞的抗CD 47抗体的产量。OV-αCD 47-G1-和OV-αCD 47-G4-感染的U251T2 GBM细胞最早在感染后12h释放出相当数量的抗CD 47抗体,在24 hPI和48个HPI培养条件下,其产率分别达到5μg/ml和6g/ml以上(见图)。1F)。并构建了OV-αCD 47-G1(OV-αCD 47-G1-HL)的反向版本,该基因可改变轻链和重链编码基因的位置(附图)。2A)。OV-αCD 47-G1感染的U251T2 GBM细胞产生的抗CD 47抗体水平略高于OV-αCD 47-G1-HL感染的GBM细胞(附图)。2B),随后用OV-αCD 47-G1代替OV-αCD 47-G1-HL进行所有后续实验。

图1:OV-Q1,OV-αCD 47-G1和OV-αCD47-G4的构建与表征.
figure1

a流式细胞术检测GBM患者来源的GBM 30、GBM 43和BT 422细胞CD 47的表达.b用流式细胞仪检测CHO细胞α、CD 47-G1和αCD 47-G4的人CD 47结合亲和力。U251T2人GBM细胞与αCD 47-G1或αCD 47-G4单克隆抗体共同孵育,然后用APC结合的抗人Fc染色。c αCD47-G1和αCD47-G4mAb对抗CD 47单克隆抗体的抑制作用。U251T2细胞经αCD 47-G1或αCD47-G4mAb培养后,用结合抗人CD 47抗体孵育,流式细胞仪鉴定。d本研究中使用的肿瘤学病毒原理图。图上:野生型HSV--1基因图谱。第二:HSV基因图谱,OV-Q1,缺失γ34.5拷贝,ICP 6功能障碍,GFP基因插入。第三,OV-αCD 47-G1的遗传图谱,显示IgG 1版抗CD 47(αCD 47-G1)的插入编码基因。第四,OV-αCD 47-G4基因图谱,显示抗CD 47 IgG 4版本(αCD 47-G4)的插入编码基因。αCD 47-G1和αCD 47-G4轻链和重链编码基因由T2A序列连接,由pIE 4/5启动子驱动。LC轻链、HC重链、HIGκ人Igκ轻链、hIgG 1人IgG 1重链、hIgG 4人IgG 4重链。e用工程CHO细胞的浓缩上清液和OHSV感染的U251T2人GBM细胞用抗人FC或抗人Igκ抗体进行免疫印迹。f用ELISA法检测OV-αCD 47-G1和OV-αCD 47-G4感染的U251T2细胞培养上清中CD 47-G1和αCD 47-G4的产量。g用OV-Q1、OV-αCD 47-G1或OV-αCD 47-G4感染U251T2人GBM细胞。CCK 8细胞活力测定分析感染后3d细胞溶解情况。hU251T2细胞感染OV-Q1、OV-αCD 47-G1或OV-αCD 47-G4,MOI为2。(a−c)和(e−h)中的实验是具有相似数据的三个独立实验的代表。数据以平均值±sd表示(n=3)。

为了检测OV-αCD 47-G1和OV-αCD 47-G4的抗肿瘤作用,我们用相应的病毒感染人GBM细胞系U251T2和Gli36ΔEGFR。感染OV-αCD 47-G1、OV-αCD 47-G4或OV-Q1的GBM细胞死亡率无明显差异(图1)。1g和补充图。3A)。我们接下来评估了OV-αCD 47-G1和OV-αCD 47-G4的病毒生产能力.结果表明,OV-αCD 47-G1-和OV-αCD 47-G4-感染的U251T2 GBM细胞或Gli 36ΔEGFRGBM细胞与感染OV-Q1的GBM细胞产生的病毒数量相似(图1)。和补充图。3B)。因此,表达αCD 47-G1或αCD 47-G4的工程技术不影响其抗宿主能力和病毒产量。

OV-αCD 47-G1感染的GBM细胞分泌的αCD47-G1能增强巨噬细胞的吞噬功能,阻断巨噬细胞中的“不吃我”信号。

我们接下来比较了αCD 47-G1和αCD 47-G4对人巨噬细胞和小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响。以前的研究表明,小鼠巨噬细胞上的SIRPα可以与人CD 47结合,刺激“不吃我”的信号。26。因此,我们从BALb/c小鼠中分离出的小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bmdms)作为效应细胞,正如以前其他组所报道的那样。27,28,29。流式细胞仪检测结果表明,αCD 47-G1和αCD 47-G4均能诱导BMDM对患者源性GBM 43细胞的吞噬作用。2A,b)和BT 422细胞(附图)。4A,b)与车辆控制相比。用OV-αCD 47-G1-、OV-αCD 47-G4-或OV-Q1感染的U251T2 GBM细胞的未浓缩上清液进行吞噬试验。与上述结果相一致,来自感染细胞的αCD 47-G1对GBM细胞的巨噬细胞吞噬能力比感染细胞的αCD47-G4高出两倍以上(如图1所示)。2C,d)。为了证明αCD 47-G1通过ADCP诱导巨噬细胞吞噬,我们重复了Fc受体阻断的吞噬实验。用高剂量(10μg/ml)人IgG 1与αCD 47-G1与Fc受体结合,预先孵育αCD 47-G1-可明显抑制BMDM对αCD47-G1诱导的GBM吞噬作用(如图1所示)。2E)。我们还发现,αcd47-g1而不是αcd47-g4显著激活了小鼠bmdm典型巨噬细胞细胞因子基因的转录,而这些基因以前被报道对gg1抗体有反应。30,如IL1b,IL6,IL10,Il12bNOS 2(无花果)2F).

图2:αCD 47-G1和αCD47-G4诱导GBM细胞吞噬。
figure2

a, b用CFSE标记GBM 43细胞,在载体对照条件下,以1:2的效应比与小鼠骨髓基质细胞(BMDM)共培养,用流式细胞仪检测5αg/ml的CHO来源的CD 47-G1或αCD 47-G4对GBM 43细胞(CD11b+CFSE+)的吞噬率。c, d用CFSE标记GBM 43细胞,在载体对照、OV-Q1-、OV-αCD 47-G1-和OV-αCD 47-G4感染的U251T2细胞的作用下,以1:2的效应比与小鼠骨髓基质共培养。流式细胞仪检测BMDM对GBM 43细胞(CD11b+CFSE+)的吞噬率。e用过量的人IgG 1进行吞噬试验,阻断BMDMFC受体。BMDM与人IgG 1(10μg/ml)共培养30 min,然后与GBM 43细胞共培养2 h,流式细胞仪检测BMDM对GBM 43细胞(CD11b+CFSE+)的吞噬率(CD11b+CFSE+)。fBMDM与GBM 43细胞按1:1比例与αCD 47-G1或αCD 47-G4共培养6h,逆转录定量(Q)PCR检测基因转录。g, h5μg/mlαCD47-G1和αCD47G4对原代人巨噬细胞吞噬GBM 43细胞的影响。i, jOV-αCD 47-G1-和OV-αCD 47-G4感染的U251T2细胞培养条件培养液对原代人巨噬细胞吞噬GBM 43细胞的影响。流式细胞术检测细胞吞噬功能。k, l原代人巨噬细胞与GBM 43细胞按1:1的比例与αCD 47-G1或αCD 47-G4共培养6h,然后用RT-qPCR进行基因转录定量。所有实验至少与三名人类供体或小鼠一起进行。误差条表示不同捐献者均值的标准差。为(b), (df), (h),以及(jl),单向方差分析P通过Bonferroni测试校正多个比较的值。

同时观察了αCD 47-G1和αCD47-G4诱导人巨噬细胞吞噬功能的作用。为此目的,原始人类供体来源的巨噬细胞被用作效应细胞,正如以前其他小组所报道的那样。31。与我们用小鼠骨髓基质细胞收集的结果相似,与载体对照相比,从转导的CHO细胞中纯化的αCD 47-G1和αCD 47-G4均能显著增强人巨噬细胞对GBM 43细胞的吞噬作用。然而,前者的效果比后者更大,因为它具有更强的ADCP效应(图1)。2G,h)。用OV-αCD 47-G1-,OV-αCD 47-G4-或OV-Q1-感染的U251T2 GBM细胞的未浓缩上清液,结果相似。OV-αCD 47-G1感染细胞分泌的αCD 47-G1和OV-αCD47-G4感染细胞分泌的αCD47-G4均能显著增强人巨噬细胞对GBM 43细胞的吞噬作用,但前者的作用比后者更明显(图1)。2i,j)。而以CRISPR/Cas9基因编辑产生的CD 47-敲除细胞(GBM 43ΔCD 47细胞)为靶细胞时,αCD 47-G1和αCD47-G4不能增强巨噬细胞的吞噬功能(附图)。5)。αcd47-g1还能激活人巨噬细胞典型的巨噬细胞因子基因的转录,如IL1B,IL6,IL10,NOS 2(无花果)2K),以及IL12A(无花果)2L).

对小鼠和人巨噬细胞来说,αCD47-G1在载体控制下的吞噬作用可能是由于阻断了“不吃我”信号和aDCP而增加的,而αCD47-G4以上的作用应该仅来自aDCP,因为IgG 1而不是IgG 4抗体可以通过fc受体介导的效应诱导出大量的aDCP,这可能是由于ggg 1和ggg 4抗体的不同物理特性所致。32.

OV-αCD 47-G1感染的GBM细胞分泌的αCD47-G1诱导NK细胞介导的

NK细胞通过自然细胞毒性和ADCC在包括GBM在内的癌症中发挥重要的抗肿瘤活性,特别是联合抗体治疗。33。为了研究αCD47-G1或αCD47-G4对NK细胞抗肿瘤活性的影响,我们制定了一项标准。51人GBM患者源性肿瘤细胞GBM 43和BT 422与人NK细胞共培养的CR释放试验51从慢病毒介导的CHO细胞中分离纯化的αCD 47-G1或αCD 47-G4,无论是否存在CR。结果表明,αCD 47-G1而非αCD47-G4对NK细胞有较强的杀伤作用。3A,b和补充图。6)。以GBM细胞株U251T2、Gli36EGFR、LN 229和患者来源的GBM 30细胞为靶细胞,获得一致的数据(附图)。7a,b)。然后用OV-αCD 47-G1-,OV-αCD 47-G4-和OV-Q1-感染的U251T2 GBM细胞的未浓缩上清液重复本实验。与OV-αCD 47-G1-感染的U251T2细胞的未浓缩上清液孵育的GBM 43细胞相比,与OV-Q1感染的上清或OV-αCD 47-G4感染的U251T2细胞培养的细胞相比,细胞的溶解程度要高得多(如图1所示)。3C)。OV-Q1-与OV-αCD 47-G4感染的U251T2 GBM细胞培养上清无明显差异(图二)。3C)。然而,对于GBM 43ΔCD 47细胞,αCD 47-G1和αCD47-G4均未诱导出更强的NK细胞杀伤作用(附图)。7C)。流式细胞仪检测活化标记CD 69和颗粒酶B的表达,证实αCD 47-G1诱导NK细胞活化。结果表明,与载体对照相比,从CHO细胞中纯化的αCD 47-G1而非αCD 47-G4能显著增强NK细胞表面CD 69的表达。3D,e和补充图。7D,e)。与车辆对照相比,αCD 47-G1显著增加NK细胞颗粒酶B的表达,而αCD 47-G4的表达略有增加(图1)。3F,g)。干扰素-γ酶联免疫吸附试验结果表明,与载体对照相比,αCD 47-G1和αCD 47-G4均不能诱导IFN-γ的分泌,即使在IL-2、IL-12、IL-15或IL-18的存在下也是如此。8).

图3:αCD 47-G1而非αCD 47-G4诱导人NK细胞对GBM细胞的杀伤作用。
figure3

a, b人原代NK细胞对αCD 47-G1和αCD 47-G4的杀伤作用(英文)a)GBM 43和(b)BT 422人GBM细胞。c人原代NK细胞在OV-Q1-、OV-αCD 47-G1-或OV-αCD47-G4-感染的U251T2 GBM细胞中对GBM 43细胞的杀伤作用。dαCD 47-G1或αCD47-G4与GBM 43细胞按1:1的作用比共培养时,对NK细胞活化标志CD 69表达的影响。e摘要数据(d)。所有实验均与三名供体一式三份进行。fαCD 47-G1和αCD47-G4与GBM 43细胞共培养对NK细胞颗粒酶B表达的影响。g摘要数据(f)。所有实验均与三名供体一式三份进行。误差条表示三个捐献者均值的标准差。为(e)和(g),单向方差分析P通过Bonferroni测试校正多个比较的值。

系统性I.P.的比较。抗CD 47抗体的注射与局部注射

目的:评价αCD 47-G1抗体在GBM微环境中的应用效果。OV-αCD 47-G1与全身腹腔内(I.P.)本实验采用免疫组织化学方法,改进了一种已报道的异种移植性GBM小鼠模型。注射1×105GBM 43细胞转化无胸腺裸鼠的实验研究34(无花果)4A)。第0天植入GBM 43肿瘤细胞。小鼠分为4组,每组1只。第21天给药:第1组(生理盐水);第2组(OV-Q1);第3组(OV-Q1+I.P.)。αCD 47-G1和OV-αCD 47-G1组.两组接受静脉注射的病毒剂量。注射OV-Q1并接受静脉注射。第21天注射OV-αCD 47-G1为2×10。5每只小鼠斑块形成单位(PFU)。第3组接受静脉滴注。第22天αCD 47-G1。其他各组小鼠均给予静脉滴注。第22天以生理盐水为对照。第23天处死小鼠,ELISA法测定血浆抗体水平,IHC法测定中枢神经系统(CNS)抗体水平。4A).

图4:ov-αCD 47-G1对抗CD 47抗体的局部传递有效,而系统给药αCD 47-G1无效。
figure4

a使用人GBM的原位模型进行体内研究的实验时间表。实验细节在正文中给出。第1组为生理盐水组;第2组为OV-Q1组;第3组为OV-Q1+I.P组。αCD 47-G1和OV-αCD 47-G1组.肿瘤植入后,第2、3、4组均注射oHSV(OV-q1或ov-αcd47-g1),剂量为2×10。5第21天每只老鼠的PFU。第1组给予生理盐水作为对照组。第22天,第3组接受静脉注射。每只小鼠注射纯化的αCD 47-G1,剂量为150μg。第1、2、4组接受静脉滴注。生理盐水注射为对照。所有小鼠在第23天接受安乐死,以便采血和采血。b用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定不同处理小鼠血浆中α、CD 47-G1的浓度。单向方差分析P经Bonferroni测试修正的用于多次比较的值(n=3只动物)。c, d取实验小鼠脑组织切片进行H&E和免疫组织化学染色,后者用抗HSV、抗人FC鉴定IgG、抗CD11b或抗NKp 46抗体。具有高倍和低放大率的图像显示在(c)和(d)分别。框状图像(d)以更高的功率显示在(c)。所提供的数据代表一项(c, d)或三(b)总共至少有三只老鼠有相似的数据。数据(b)表示为平均值±SD。

有静脉注射的老鼠。注射αCD 47-G1(150μg/鼠)在血浆中检测到约10μg/ml的αCD 47-G1,而第1、2、4组在血浆中未检测到或少量检测到αCD 47-G1。4B)。从实验小鼠中分离出脑组织进行组织学研究。用H&E染色法区分GBM组织和正常脑组织。4C,d)。用抗HSV抗体、抗人FC抗体、抗CD11b或抗NKp 46抗体进行免疫组化染色,分别显示HSV感染区、αCD 47-G1的存在、巨噬细胞和NK细胞的分布。抗人FC染色显示,小鼠脑组织中可检测到一定量的αCD 47-G1。用OV-αCD 47-G1治疗,但未在脑内注射。用生理盐水或OV-Q1或在接受静脉注射的小鼠的大脑中治疗。Ov-Q1加I.P.αCD 47-G1(图1)。4C,d反人类FC)。抗人FC染色定位于OV-αCD 47-G1处理的脑内抗HSV染色的同一区域。4C,d;抗HSV;抗人FC)。CD11b(+)巨噬细胞和NKp 46(+)NK细胞浸润仅存在于荷瘤半球,而不存在于非肿瘤半球。4D;抗CD11b;抗NKp 46)。生理盐水处理小鼠脑内巨噬细胞和NK细胞主要分布在肿瘤周围,但很少浸润到肿瘤中心区,而OV-Q1或OV-αCD 47-G1可显著增加肿瘤内CD11b(+)巨噬细胞和NKp 46(+)NK细胞的浸润。4C,d;抗CD11b;抗NKp 46)。

为了证实我们的发现,我们重复了上述实验,并做了一些修改:执行I.P。给α、CD47-G1或生理盐水两次(一次在第22天,另一次在第24天),并在第25天献祭小鼠(补充图1)。9A)。同样的结果也被观察到。αCD 47-G1(约10μg/ml)仅见于I.C组。Ov-Q1加I.P.αCD 47-G1给药(附图)。9B)。与生理盐水组比较,oHSV诱导的CD11b(+)巨噬细胞和NKp 46(+)NK细胞的瘤内浸润也明显增强。行政(附图)9C,d;抗CD11b;抗NKp 46)。αCD 47-G1在HSV-I.C后第2天和第4天均可检测到.仅在OV-αCD 47-G1治疗的脑内给药,而不是其他组(图1)。4C,d和补充图。9C,d抗人FC),提示αCD 47-G1从OV-αCD 47-G1处理的GBM微环境中持续释放。

Ov-αCD 47-G1在异种移植物抗病毒治疗方面优于OV-αCD47-G4。

为了评价OV-αCD 47-G1和OV-αCD 47-G4在体内治疗GBM的疗效,我们采用了一种先前描述的人GBM原位模型。注射1×105萤火虫荧光素酶(FFL)基因表达人GBM细胞(GBM 43-FFL)在裸鼠胸腺中的表达34。肿瘤植入后7天,动物接受静脉注射。注射剂量为2×10的OV-αCD 47-G1、OV-αCD47-G4或OV-Q1。5每只小鼠PFU,或生理盐水作为安慰剂对照。从肿瘤植入后第15天开始,用荧光素酶显像监测肿瘤进展情况。5A)。OV-αCD 47-G1在体内抑制GBM肿瘤进展的作用明显优于OV-αCD47-G4,两者均优于OV-Q1(图1)。5B−d)。与车辆控制相比,OV-Q1延缓了GBM的进展,使中位生存期从43天延长到51天。与生理盐水对照组和OV-Q1组相比,ov-αCD 47-G4组小鼠的中位生存期明显延长。OV-αCD 47-G1组9只小鼠中有8只存活,OV-αCD 47-G4组小鼠中有2只存活125天以上,无GBM症状,无荧光素酶信号。5B,c和补充图。10)。我们重复了小鼠的生存实验,并发现了类似的数据(补充图)。11)。实验小鼠的体重记录进一步表明,与其他各组相比,OV-αCD 47-G1处理的小鼠在研究后期体重持续增加时更健康(如图1所示)。5D)。为了评价OV-αCD 47-G1治疗大肿瘤的疗效,我们重复了生存研究,将治疗时间推迟到14天或21天,而图中为7天。5肿瘤植入后。结果表明,与OV-Q1组和生理盐水对照组相比,OV-αCD 47-G1治疗小鼠第14天存活时间明显延长,但在第21天没有明显延长(补充图)。12).

图5:OV-αCD 47-G1与OV-αCD 47-G4改善人GBM原位模型体内抗宿主病毒治疗效果的比较。

a体内研究的实验时间表。用免疫组织化学方法建立了人GBM的原位模型。注射1×105GBM43-FFL人GBM细胞成无胸腺裸鼠。7天后,小鼠瘤内注射车辆控制或2×10。5OV-Q1,OV-αCD 47-G1或OV-αCD47-G4的PFU。b小鼠GBM43-FFL生长的延时荧光素酶显像。cGBM 43-FFL荷瘤小鼠的存活情况a)。生存率用Kaplan-Meier法估计,用双侧对数秩检验(n=9只动物)。*OV-Q1对照组两只小鼠腹腔注射后意外死亡。第16、27天注射荧光素素,无明显GBM症状。d每隔一天记录一次实验小鼠的个体体重。

Ov-αCD47-G1优于OV-αCD47-G4,并能分离OV-Q1和αCD47-G1在提高免疫活性gbm模型的预后方面优于OV-αCD47-g4。

接下来,我们试图评价OV-αCD 47-G1在免疫能力强的GBM小鼠模型中的作用。采用改良的CT2A小鼠GBM模型,该模型易受oHSV感染(附图)。13)。对小鼠CT2A GBM细胞进行修饰,使其表达人CD 47,产生CT2A-hCD 47细胞。此修饰的目的是使αCD 47-G1抗体与CT2A-hCD47GBM细胞上表达的人CD 47结合。由I.C.将CT2A-hCD 47细胞注入免疫活性野生型C57BL/6小鼠,建立GBM免疫活性小鼠模型,并在图中重复生存研究。5稍作修改(如图所示)。6A)。OV-αCD 47-G1与OV-αCD 47-G4、OV-Q1或车辆对照小鼠相比,其中位生存期明显延长。6B,c)。然而,与异种移植模型相比,我们没有发现与用OV-αCD 47-G4和OV-Q1或车辆对照治疗的小鼠有显著差异(图1)。6B,c)。在本研究中,小鼠体重的记录证实了OV-αCD 47-G1是唯一有效的免疫活性GBM小鼠模型的治疗方法(图一)。6d).

图6:比较OV-αCD 47-G1与OV-αCD 47-G4的疗效,以及OV-Q1和αCD47-G1在免疫活性小鼠GBM模型中的联合区域分娩。
figure6

a体内研究的实验时间表。采用免疫组织化学方法建立免疫活性小鼠GBM模型。注射1×105CT2A-hCD 47小鼠GBM细胞(表达人CD 47)转化为C57BL/6小鼠。3天后,小鼠瘤内注射生理盐水对照或2×10。5OV-Q1,OV-αCD 47-G1或OV-αCD 47-G4的PFU。b对CT2A-hCD 47 GBM小鼠在肿瘤植入后11天和16天进行荧光素酶显像。cCT2A-hCD 47荷瘤小鼠的存活情况(a)。生存率用Kaplan-Meier法估计,用双侧对数秩检验(n=9只动物)。d每隔一天记录一次实验小鼠的个体体重。e生存研究的实验时间表。采用免疫组织化学方法建立免疫活性小鼠GBM模型。注射1×105CT2A-hCD 47小鼠GBM细胞(表达人CD 47)转化为C57BL/6小鼠。3天后,小鼠瘤内注射车辆控制或2×10。5OV-Q1或OV-αCD 47-G1的PFU。第4天将渗透泵植入小鼠体内,连续给αCD 47-G1至第7天。每天监测两次,以评估肿瘤的发展情况。f用OV-Q1、αCD 47-G1、OV-Q1+αCD 47-G1、OV-αCD 47-G1或载体对照处理CT2A-hCD 47荷瘤小鼠的存活情况.生存率用Kaplan-Meier法估计,用双侧对数秩检验(n=每组9或10只动物)。

接下来,我们用CT2A-hCD 47 GBM小鼠模型重复了生存研究,比较了I.C的有效性。联合应用OV-αCD 47-G1。OV-Q1联合渗透泵持续释放αCD 47-G1单抗到GBM环境中。为此,我们设立了五个不同的I.C治疗组。给药:1组(生理盐水);2组(OV-Q1);3组(渗透泵输注αCD 47-G1);4组(OV-Q1+αCD47-G1单抗);5组(OV-αCD47-G1)。Ct2A-hCD47gbm细胞于第0天和第3天植入,两组注射OV-q1(2组和4组)和OV-αCD47-G1组(第5组)接受2×10次注射。5每只小鼠对应的PFU病毒。在第4天−7,两组采用渗透泵输送αCD 47-G1。根据图中的数据,泵以1.0g/h的速率输送抗体,持续72h,即每天24g,约为注射病毒产生量的2−3倍。1F注射病毒的剂量。其他各组小鼠均接受静脉注射。用泵输送生理盐水作为对照(图二)。6E)。作为一种单一的药物,与生理盐水相比,OV-Q1和αCD47-G1泵给药在小鼠生存中的作用不大,但没有统计学意义(图1)。6f)。OV-q1和αcd47-g1的联合泵似乎比αcd47 g1单独使用更好。P价值在有意义的边缘(P与OV-Q1相比,差异无显着性(P>0.0737)。与其他两种动物模型一致(无花果。5C6C与OV-Q1相比,OV-αCD 47-G1明显延长了GBM小鼠的存活时间.6f)。重要的是,OV-αCD 47-G1是所有测试组中最好的,特别是在统计学上优于I.C的组合。OV-Q1和αCD47-G1通过泵给药。由于OV-αCD 47-G1治疗方案将OV-Q1和αCD 47-G1合并成一种单一的治疗剂,单药的治疗效果优于单纯αCD 47-G1、OV-Q1及其联合治疗,因此,表达全长IgG 1抗CD 47抗体的单胞病毒是治疗实验性GBM的一种创新、方便、有效的方法。

OV-A4-IgG2b在改善完全免疫功能的GBM模型中对红细胞无不良影响方面优于OV-A4-IgG3。

为了避免人CD 47与小鼠SIRPα的交叉相互作用,我们用抗人CD 47抗体代替抗人CD 47抗体,建立了完全免疫能力的小鼠模型。简单地说,我们构建了抗小鼠CD 47抗体(克隆:a4)。35在小鼠IgG2b和小鼠IgG 3支架上,分别命名为A4-IgG2b和A4-IgG3,以及相应的表达A4-IgG2b(OV-A4-IgG2b)或A4-IgG3(OV-A4-IgG3)的oHSV。流式细胞术检测A4-IgG2b对小鼠CD 47的阻断作用(附图)。14)。测定A4-IgG2b和A4-IgG3对小鼠GBM细胞CT2A细胞的巨噬细胞吞噬活性。与我们先前的发现一致,A4-IgG2b类似于α的cd47-g1,它具有更强的fc受体结合亲和力。36,37,38,39,诱导巨噬细胞吞噬能力明显高于a4-IgG 3,与αcd47-g4相似,几乎缺乏fc受体结合能力。36,37,38,39(补充图。15a,b)。证实了A4-IgG2b对小鼠NK细胞的激活作用。结果表明,A4-IgG2b与A4-IgG 3对小鼠NK细胞抗CT2A细胞的ADCC有增强作用(附图)。15C)。C57BL/6小鼠I.C.用CT2A细胞进行存活研究。肿瘤植入后3d,荷瘤小鼠腹腔注射OV-Q1、OV-A4-IgG2b、OV-A4-IgG3或载体对照。结果表明,与OV-Q1或对照组相比,OV-A4-IgG2b和OV-A4-IgG3处理均能显著延长小鼠的中位生存期。在完全免疫能力的GBM小鼠模型中,OV-A4-IgG2b明显优于OV-A4-IgG3。7A)。为了明确OV-A4-IgG2b晚期治疗作用的免疫学机制,我们重复了巨噬细胞或NK细胞耗竭的生存研究。结果表明,NK细胞的缺失使OV-A4-IgG2b处理的小鼠存活时间略有缩短。OV-A4-IgG2b治疗组NK细胞耗竭组的中位生存期为29天,而未伴NK细胞耗竭组的中位生存期为32天。7b)。与无巨噬细胞耗竭组相比,巨噬细胞耗竭明显缩短了OV-A4-IgG2b组小鼠的存活时间。7C)。这些数据表明,巨噬细胞(也很可能是NK细胞)在OV-A4-IgG2b促进GBM小鼠存活的作用中起着重要作用。我们还进行了流式细胞术分析,以研究免疫细胞的招募和激活。结果表明,与对照组相比,OV-Q1、OV-A4-IgG2b和OV-A4-IgG3处理均能显著增强巨噬细胞、NK细胞和T细胞的颅内浸润。7D−f)。OV-Q1组、OV-A4-IgG2b组和OV-A4-IgG3组在免疫细胞浸润和病毒产生方面均无显着性差异(图二)。7g)。我们还检测了NK细胞在体内的激活情况,发现三种处理均能显著提高NK细胞上CD 69的表达。与OV-Q1相比,OV-A4-IgG2b、OV-A4-IgG3对NK细胞的激活作用明显增强(图一)。7H,i)。巨噬细胞体内吞噬分析表明,OV-A4-IgG2b明显优于OV-A4-IgG3,但两者的吞噬能力均显著高于OV-Q1(图一)。7J,k)。从表达抗CD 47抗体小鼠版本的oHSV完全免疫模型的数据来看,我们的数据表明,表达抗人CD 47抗体的oHSV可以有效地治疗GBM。

图7:OV-A4-IgG2b与OV-A4-IgG3在完全免疫能力小鼠GBM模型中的效果比较。
figure7

a载体对照、OV-Q1、OV-A4-IgG2b或OV-4-IgG3对CT2A荷瘤C57BL/6免疫活性小鼠存活的影响。b载体对照、OV-Q1或OV-A4-IgG2b治疗CT2A荷瘤C57BL/6小鼠在NK细胞耗竭或无NK细胞耗竭的情况下存活。c载体对照OV-Q1或OV-A4-IgG2b治疗CT2A荷瘤C57BL/6小鼠在巨噬细胞耗竭或无巨噬细胞耗竭的情况下存活。生存率用Kaplan-Meier法估计,用双侧对数秩检验进行比较.dfNK细胞(CD3−NKp 46+)的颅内浸润d)、巨噬细胞(F4/80+CD45HighCD11b+)(e)和T细胞(CD3+NKp 46−)(f)在CT2A荷瘤小鼠体内注射病毒后3d流式细胞仪检测。n=5只动物)。gOV-Q1-、OV-A4-IgG2b-和OV-A4-IgG3处理小鼠的病毒产生。h注射病毒3d后,小鼠脑组织NK细胞中CD 69的表达。各组具有代表性的流式细胞仪图(n=5只动物)。iNK细胞CD 69表达的定量研究h). jOHSV对GBM表达CT2A细胞在体内巨噬细胞吞噬作用的研究。各组具有代表性的流式细胞仪图(n=6只动物)。kGBM表达的CT2A细胞巨噬细胞吞噬功能的定量研究j). l静脉输注后外周血红细胞计数。注射OV-A4-IgG2b或I.P。注射纯化的A4-IgG2b(n=6只小鼠)。为(dg), (i)和(k, l),单向方差分析P通过Bonferroni测试校正多个比较的值。数据以平均值±SD表示。

CD 47是红细胞(Rbcs)的重要标志,可阻止巨噬细胞清除红细胞。40。抗CD 47鼠A4抗体曾被报道能降低循环系统中的红细胞。41。为了研究OV-A4-IgG2b是否通过促进红细胞凝集或红细胞吞噬作用而对RBCs产生不利作用,我们还用完全免疫活性的GBM小鼠模型进行了贫血试验。CT2A荷瘤小鼠瘤内注射2×10。5OV-A4-IgG2b或I.P的PFU。肿瘤植入后3d注射150μg纯化的A4-IgG2b。24小时后采集小鼠外周血,计数红细胞数。结果表明:I.注射A4-IgG2b而非瘤内注射OV-A4-IgG2b可显著降低红细胞计数,提示I.C。应用一种表达全长抗体并具有较强FCR效应的oHSV治疗GBM对RBCs无明显不良影响(图一)。7L).

讨论

在本研究中,我们将抗肿瘤病毒治疗和抗体治疗结合为一种单一的治疗药物,目的是通过将“冷”免疫逃避肿瘤微环境(TME)转化为“热”TME,直接通过肿瘤溶解和间接破坏肿瘤细胞。我们开发了一个平台,通过使用oncolytic病毒作为治疗性自身和LOco-Region载体来编码和传递一种完整的mAb。这种二合一、经济、有效的试剂应能在术前、术中或术后口服.实验上,OV-αCD 47-G1的局部传递可导致(1)oHSV对肿瘤的直接杀伤;(2)OHSV对TME的天然免疫细胞浸润和激活;(3)阻断通常由巨噬细胞和GBM细胞表达的SIRPα和CD 47相互作用介导的“不吃Me”信号;(4)αCD 47-G1介导的DCP ADCC通过连接巨噬细胞上的FCγ受体和CD 47对GBM细胞的作用;(5)NK细胞介导的αCD 47-G1介导的ADCC。这些多方面的肿瘤学和免疫调节作用共同阻止了GBM的传播。

全身注射IgG 4抗CD 47抗体(αcd 47-g4)在临床前和临床研究中都显示出明显的抗肿瘤活性。18,19,21。αCD 47-G4和αCD 47-G1通过嫁接相同的互补决定区(CDRs),可以阻断CD 47−SIRPα相互作用介导的“不要吃我”信号。在人IgG 4支架上构建了αCD 47-G4,以减少αCD47-G1(NK细胞)和巨噬细胞(巨噬细胞)全身性注射αCD47-G1等依赖于FC的效应物所产生的不良影响。因此,我们生成了OV-αCD 47-G1和OV-αCD 47-G4,分别释放了全长αCD47-G1和αCD47-G4 mAb,以了解Fc−FCR相互作用在肿瘤清除中的重要性。结果表明,OV-αCD 47-G1在体内外均显著高于OV-αCD47-G4。然而,根据CT2A-hCD 47/C57BL/6免疫活性GBM模型的结果,OV-αCD 47-G4与OV-Q1相比没有显着性差异。该模型以人CD 47在小鼠GBM CT2A细胞上过表达所建立的CT2A-hCD 47为基础。这可能的解释包括:(1)小鼠巨噬细胞仍能从CT2A-hCD47GBM细胞(αCD 47-G1或αCD 47-G4)中接收到由小鼠CD 47介导的“不要吃我”的信号。值得注意的是,C57BL/6 SIRPα与小鼠CD 47的结合亲和力与C57BL/6 SIRPα与人CD 47的亲和力相似。26,42(2)人αcd47g1仍能与小鼠fc受体结合,诱导αcdp或adcc,但αcd47g4不能,如其他抗体所示。43。提示在CT2A-hCD 47/C57BL/6免疫活性GBM模型中,αCD 47-G4可能不完全阻断“不吃我”信号,也缺乏FC依赖性效应,因此我们没有观察到OV-αCD 47-G4与OV-Q1的差异。

因此,为了避免人CD 47与小鼠SIRPα的交叉相互作用,我们构建了一种表达抗小鼠CD 47抗体OV-A4-IgG2b和OV-A4-IgG3的OV-αCD 47-G1和-G4。小鼠IgG_2b和IgG_3与人IgG_1和IgG_4的结合亲和力分别与人IgG_1和IgG_4相似。与OV-αCD 47-G1和-G4的结果相似,OV-A4-IgG2b对GBM的治疗效果最强。重要的是,在这种完全免疫功能的模型中,与OV-Q1相比,OV-A4-IgG3也显著延长了实验小鼠的存活时间,但对GBM的治疗效果不如OV-A4-IgG2b。这些结果验证了GBM 43异种接枝模型的有效性。

上述完全免疫功能模型使我们能够研究免疫细胞介导表达全长抗体的肿瘤病毒的作用,无论是否存在Fc依赖效应。摘要GBM的免疫抑制TME以活化T细胞浸润率低、TAMs比例高为特征,可导致肿瘤免疫逃逸。44。TAMS是促进GBM微环境中肿瘤发展的主要免疫细胞。45,46。由于调节TAMS被认为是一种很有前途的抗肿瘤策略,针对TAMS的CD 47-SIRPα轴是治疗GBM的一种很好的方法。CD 47在多种肿瘤中高表达,包括GBM。17,28,47。CD 47通过与巨噬细胞表面的SIRPα结合,作为一种抗吞噬的“不要吃我”的信号。SIRPα的激活对吞噬功能的抑制作用19。CD 47的表达有助于肿瘤细胞逃避巨噬细胞的清除,促进肿瘤的转移。48。使用mAb破坏cd47-sirpα轴已被证明能增强对癌细胞的吞噬作用,并抑制某些血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的进展。18,21,49,50。结果表明,OV-A4-IgG2b和OV-A4-IgG3在体内和体外均能增加巨噬细胞的颅内浸润和对GBM细胞的吞噬作用。巨噬细胞耗竭抑制OV-A4-IgG2b病毒治疗GBM的疗效。这些数据表明巨噬细胞在介导我们的抗体表达方面起着很强的作用,尤其是具有Fc依赖性的抗体。此外,我们还发现,OHSV治疗显著增加了NK细胞和T细胞的颅内浸润。总之,我们的数据表明,表达抗体的oHSV可以诱导对GBM的先天免疫和适应性免疫反应。

单抗已被广泛而成功地用于许多癌症的靶向治疗。然而,静脉注射(I.V.)、皮下(S.C.)或肌肉内(I.M.)给药途径可能会阻碍其治疗具有挑战性的实体肿瘤的疗效。因为分子尺寸很大,S.C。还有我。MAb的使用需要一个额外的吸收步骤,通过这个步骤,mAb在排入血液中之前,从间质间隙被输送到淋巴系统。51。然而,无论给药途径如何,mAb的系统传递主要分布在血浆中,而不是靶组织。为了在实体肿瘤等靶向组织中获得有效的局部剂量,需要高剂量的全身抗肿瘤抗体,但这可能导致不良副作用和过度成本。此外,通过血脑屏障(BBB)治疗GBM是另一个挑战,在大多数GBM患者中很大程度上排除了系统的单抗治疗途径。我们的抗体分布数据比较了αCD47-G1分子的系统性和局部传递,表明OV-HSV和αCD47-G1联合应用于TME是一种有效的方法,但作为两种不同的治疗手段,OV-HSV与αCD47-G1联合应用也是一种有效的方法。

目前的研究表明,重组的oHSV是一个很好的平台,可以在诸如GBM这样的实体肿瘤中传递mAb,因为在瘤内注射oHSV时,mAb可以通过GBM本身传递到BBB区域之外。在我们目前的方法中,全长抗体,包括由强病毒启动子产生的重链和轻链,可以增加TME中抗体的区域传递,但可以消除毒性,并需要在中枢神经系统中达到更好的治疗水平。然而,当肿瘤病毒被认为是中枢神经系统之外的肿瘤时,OV-αCD 47-G4可能是有效的,毒性较小。考虑到在临床上已经检测到了oHSV主干和抗CD 47抗体,我们表达抗CD 47抗体的oHSV很可能被考虑移植到临床治疗系统性实体肿瘤。目前,OV-αCD47-G1的良好制造实践已经在我们的机构完成.

只要OV在TME内持续存在,我们的治疗性OHSV不仅会激活天然免疫系统,而且还会在局部持续产生mAb。在理想的情况下,一旦肿瘤细胞被OV完全溶解,复制病毒就会消散,抗体产生就会停止,从而限制了长期局部组织毒性的可能性。虽然我们目前的方法是制造一种全长抗体,直接针对带有IgG 1和gg 4选项的免疫细胞,但我们的平台可用于传递其他形式的mAb,如单链mAb(Scfv)或任何具有多种功能的mAb,如T细胞检查点阻断(包括抗pd 1、抗pd l1、抗ctl 4或直接针对肿瘤细胞的mAb,例如抗EGFR mAb)。52,53.

总之,我们开发了一个有效的oHSV平台,通过直接肿瘤溶解、天然免疫浸润和激活、巨噬细胞免疫检查点抑制和FC依赖的天然免疫细胞毒性功能,为治疗GBM提供了长时间长的单克隆抗体。我们的平台可以扩展到在TME中表达针对免疫细胞和/或肿瘤细胞的其他转基因,因此有可能提高抗肿瘤病毒疗法和单抗治疗癌症的整体疗效。


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