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Spop突变通过削弱geminin泛素化而引起复制过度,并在atr抑制作用下触发复制突变

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发表时间:2021-10-09 09:33作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

双子蛋白及其结合伙伴Cdt 1是调控DNA复制的关键。我们发现CULLIN3E3泛素连接酶适配器蛋白SPOP在内源水平上与Geminin结合,并调节DNA复制。SPOP促进Geminin在赖氨酸残基100和127处的K27非降解聚泛素化.Geminin的这种多泛素化通过间接阻断cdt 1与MCM蛋白复合物的结合来防止DNA复制过度,这是DNA展开和复制所需的相互作用。SPOP在某些人类癌症类型中经常发生突变,并与肿瘤的发生有关。我们发现,癌症相关的SPOP突变损害双子蛋白K27连接的多泛素化,并导致复制起源、过度激发和再复制。SPOP突变引起的复制应激在ATR抑制作用下引发复制突变和细胞死亡。我们的结果揭示了SPOP在防止DNA复制、过度燃烧和基因组不稳定方面的抑癌作用,提示SPOP突变的肿瘤可能对ATR抑制剂治疗敏感。

导言

基因组的稳定性依赖于精确的基因组复制。在每个细胞周期中,必须建立数万个dna复制起始点,以确保在人类基因组中精确和完整地复制超过30亿个dna碱基对。1。为了确保DNA复制的精确进展,这一过程的许可是由复制前复合物(pre-rc)在G1期复制起源的组装来启动的。在G1/S转变后,细胞周期的其余部分不需要再激活或重新激活细胞的起源。在酵母中,原始激活是基因扩增、拷贝数变异和染色体分离的驱动因素。2,3。在哺乳动物细胞中,它会引起染色体断裂和DNA损伤反应的激活。4,5.

前rc由cdc 6、cdt 1和微染色体维持蛋白(Mcm)组成。6。ORC结合复制的起源,并在M/G1转变时招募Cdc 6。与cdc 6结合的兽人在dna复制的起源处与cdt 1形成mcm 2-7复合物。7,8,9。一旦前RC组装,起源是许可复制在S阶段,并准备好被触发。通过控制Cdt 1的合成、降解和活性,Cdt 1的活性仅限于G1。早期S期Cdt 1的低水平被认为是靶向降解的结果10,11,12而它在G2期的高水平是由它的稳定引起的。13。然而,cdt 1在S期晚期和G2期早期的增加可能导致复制起源过度和再复制,如果G2中dna复制酶有残留活性,则可能发生这种情况。Cdt 1的活性受到双子蛋白的严格控制。14,一种再复制抑制因子,直接与cdt 1结合,并抑制cdt 1的复制刺激功能。15。双子座是一种不稳定的蛋白质,被后期促进复合物(Asc)降解。16。Geminin和cdt 1在S期和G2期高水平表达,双子蛋白结合cdt 1并阻止dna再复制。15,17,18。此外,Geminin通过抑制cdt 1的泛素依赖蛋白水解,控制cdt 1的基础水平,并在有丝分裂过程中诱导cdt 1的积累。19。因此,认为双子蛋白在前RC形成中具有负向和正向作用,表明双子蛋白水平可能不是调控其功能以保证DNA复制的唯一关键调节机制。

两个双子座分子通过线圈结构域自缔合形成同质二聚体。20,21,22,也可能是交联实验中提出的四聚体。23。Geminin二聚体与cdt 1形成一种异三聚体,这是抑制cdt 1功能所必需的。20,21,22。然而,geminin/cdt 1复合物可能以不同的状态存在,因为geminin/cdt 1可以是复制激活的,也可以是非复制的,这取决于细胞周期的不同阶段。24,25。为了解释cdt 1的活性态和非活性态,提出了geminin/cdt 1复合异质三聚体-异源掩蔽器跃迁模型。26。即使对Cdt 1/Geminin进行了广泛的研究,对这种复合物是如何被调控的还没有定论的了解。

这个SPOP基因编码CULLIN3(CUL3)-环盒1(RBX 1)E3泛素连接酶(CRL)复合物的底物结合适配器亚基。SPOP与癌的发生有关,因为它经常在前列腺癌和子宫内膜癌等人类癌症中发生突变。27,28,29。值得注意的是,迄今为止在前列腺癌患者中检测到的几乎所有SPOP突变(一个突变除外)都是半基因突变。27,28,30。越来越多的证据表明,前列腺癌衍生的spop突变体以一种占优势的阴性方式发挥作用。31,32,33,这与生物化学和结构研究的结果一致,表明spop蛋白可以通过btb结构域和btb结构域形成二聚体或低聚物。34,35。一些癌相关蛋白已被确认为spop的底物,如雄激素受体(AR)、src-3、trm 24和brd 4,这些蛋白质在pca细胞和病人组织中异常地上调。31,32,33,36,37,38,39,40。此外,spop还参与了基因组稳定性的调控。41,42,43。然而,SPOP如何精确地控制基因组的稳定性仍然是一个很难理解的问题。

在本研究中,我们证明SPOP是一种E3泛素连接酶,在S期与Geminin大量结合,并催化K27连接的Geminin非降解多泛素化。我们发现,与SPOP相关的Geminin的多泛素化阻断了MCM与Cdt 1的结合。此过程可防止DNA复制过度。癌症相关的spop突变损害dna复制监测,并导致复制起源过度和再复制,从而增加复制压力,使癌细胞对ATR抑制敏感。

结果

DNA复制因子Geminin作为SPOP结合蛋白的鉴定

这两个癌症基因组图谱(TCGA)前列腺癌数据集28和一个独立群体的全基因组测序数据。44结果表明,SPOP突变型肿瘤的基因组变化高于野生型SPOP肿瘤(图1)。1A,b)。虽然之前的一些研究表明,SPOP的放松管制可能导致基因组不稳定。41,42,43没有研究直接检查SPOP突变对DNA复制的影响。Hjorth jensen报告说,spop基因敲除导致dna修复和复制的重要基因转录减少,包括BRCA 2, ATR, Chk 1,和RAD 5143。然而,tcga的数据显示,这些基因在SPOP突变的前列腺癌患者样本中都没有被下调(补充图)。1A-d),这些基因的mRNA水平与SPOP前列腺癌中mRNA的表达(附图)1E-H)。患者标本数据强调SPOP突变可能通过与复制调控基因转录无关的机制来调节DNA复制,从而影响基因组的改变。

图1:DNA复制因子双子蛋白作为SPOP结合蛋白的鉴定。
figure1

a, b肿瘤基因组图谱(TCGA)中野生型(WT)(蓝点)或突变型(Mut)(红色点)SPOP标本基因组分数变化的分析28 (a)和一个独立的前列腺癌全基因组测序数据集。44 (b)。数据是使用cBioPortal生成的(Https://www.cbioportal.org/)在线工具。方框图显示中间值、四分位数范围和所有数据点。P计算值采用单侧Wilcoxon秩和检验。c文恩图显示复旦大学(上海)酵母双杂交筛选数据的重叠,梅奥诊所基于质谱的SPOP相互作用体,以及DNA复制基因集。dMyc-SPOP转染293 T细胞DNA复制相关蛋白的共IP分析。e用上述抗体对PC-3细胞内源性蛋白的共IP分析。f双子座结构域结构图,显示位于双子座C端(中、下)的假定进化保守的SBC模体(红色)。所有三个Y2H克隆簇都包含这个基元(顶部)。g瞬时转染Myc-SPOP-WT或ΔBTB突变体的293 T细胞指示蛋白的共IP分析。h, i微扰1H-15N-HSQC核磁共振谱15未标记WT滴定的n标记SPOP数学(h)或变异(i)Geminin肽(氨基酸195-209)。jSPOP的晶体结构-配合物中的数学(表面表征)与Geminin肽(氨基酸195-209)的棒状表征。用电子密度模拟肽残基196~204。红色表面对应于SPOP残余物,其化学位移扰动在1H-15N-HSQC核磁共振谱15用未标记的双子肽滴定N标记的SPOP。在癌症患者中经常发生突变的SPOP残基被标记。kGeminin肽和SPOP残基在结合界面的表达。推测分子间氢键出现在黑色破折号上。正负电荷分别以蓝色和红色表示。本文或门德利数据库(10.17632/8n7xt5rkhc.1)提供了来源数据。类似的结果(d), (e), (g)在两个独立的实验中获得了面板。

前列腺癌患者标本中检测到的大多数(>97%)spop突变位于底物结合的数学域。28,30表明与SPOP突变相关的肿瘤发生起源于SPOP底物泛素化的解除管制。确定与SPOP直接结合的蛋白质中有多少是DNA复制和修复因子(补充表)1),对酵母双杂交(Y2H)筛选结果进行聚类分析(补充表)。2)和SPOP相互作用,我们通过串联亲和纯化和质谱(补充表)生成。3)。我们发现,在两种独立方法鉴定的SPOP相互作用蛋白中,双子蛋白是唯一的DNA复制因子。1C和补充图。1I),暗示双子座是一种与SPOP相互作用的蛋白质。共免疫共沉淀实验证实,在293 T细胞和PC-3前列腺癌细胞中,异位表达的SPOP和内源性SPOP都与Geminin相互作用。1D,e和补充图。1J)。值得注意的是,共同IP分析表明,SPOP与Cdt 1的结合程度与Geminin相同,而SPOP与MCM蛋白的结合是不可检测的(图一)。1D,e)。我们还通过删除cdt 1-结合区(氨基酸82-160)生成了geminin突变体。20,21,22做联合IP分析。正如预期的那样,这个缺失突变体失去了结合Cdt 1的能力,但是能够结合SPOP(补充图)。1K),暗示SPOP与双子座以一种独立于Cdt 1的方式相互作用。为支持这一观点,结合试验进一步证实,体外翻译的spop直接结合gst-geminin从大肠杆菌细菌(附图)1L)。我们的数据表明,SPOP直接结合双子座,它们的相互作用发生在内源性水平上。

与SPOP结合的蛋白质通常含有一个与SPOP结合的共识序列(sbc,Φ-π-S-S/T-S/T,其中Φ是非极性残基,π是极性残基)。34。C端段199VSSST203是双子座唯一的SBC基序。所有三个Y2H阳性克隆簇都包含这个基序(图1)。1F)。这五种氨基酸的缺失完全消除了293 T细胞中SPOP与Geminin的相互作用(图1)。1g),表示199VSSST203是双子座的功能性SBC母题。

核磁共振波谱证实了这一结合基元,并更好地定义了SPOP中的结合界面。Geminin WT SBC肽(195AEGTVSSSTDAKPCI209)和sbc-丙氨酸突变体(195AEGTVAAAADAKPCI209)与纯化的重组spop数学结构域(氨基酸28-166)进行相互作用试验。大肠杆菌。非标记Geminin WT肽的添加15N标记的SPOP-数学域,存在多个化学位移扰动。1H-15N异核单量子相干(HSQC)谱的SPOP数学(图。)。相反,在1H-15加入Geminin SBC-丙氨酸突变肽后,SPOP的n HSQC谱(图1)。1I),表明SBC的主题199VSSST203对于SPOP-双子座的相互作用是必不可少的。我们还确定了双子肽配合物中spop-数学结构域的X射线晶体结构。195AEGTVSSSTDAKPCI209决议3.4(表)1)。不对称单元中有两种SPOP-Geminin复合物。Geminin肽电子密度可检测到每个复合物,其中我们可以容纳9个Geminin残基从Glu196到Asp204(补充图)。1M)。与我们的核磁共振数据一致,该肽位于SPOP表面的浅凹槽中(如图所示)。1J)。SPOP-Geminin的结合方式类似于与其它多肽络合的晶体结构。34。Geminin Val199位于SPOP Phe 102、Tyr 123、Trp 131和Phe 133形成的疏水口袋中,而Geminin Ser 200、Ser201和Ser 202可能参与了带有SPOP残基Lys 129、Asp130、Gly132和Lys 134的分子间氢键网络。1K)。双子座199VSSST203在9个推测的SPOP和Geminin分子间氢键中,Motif贡献了8个。一些SPOP残基存在NMR化学位移扰动(图1)。1J)在前列腺癌(Tyr 87,Phe 125,Trp 131和Phe 133)和子宫内膜癌(Met117)中经常发生突变。27,29.

表1 SPOP的数据收集和细化统计-数学-双子座肽(PDB条目7 KLZ)。

SPOP促进Geminin中赖氨酸残基100和127的K27非降解聚泛素化

SPOP WT在293 T细胞中的表达显著增强了Geminin的泛素化,这种泛素化对Geminin蛋白水平没有影响(图1)。2A)。SPOP对Geminin泛素化反应进行了不同方法的验证(附图)。2A-C)。SPOP不能诱导Geminin SBC缺失突变体泛素化(附图)。二维空间)。CRISPR-Cas9基因敲除内源性SPOP,大大减弱了293 T细胞中Geminin的泛素化(图1)。2B和补充图。2E这种效应被SPOP的恢复表达所逆转(如图所示)。2B),提示SPOP对Geminin多泛素化有特殊作用。由于SPOP过表达或基因敲除不影响Geminin蛋白水平(图1)。2A和补充图。2F-I),我们试图确定SPOP介导的双子座泛素泛素化的泛素链连锁类型。为此,我们在293 T细胞中表达了WT泛素、单赖氨酸残基或赖氨酸零突变体,表明SPOP特异性地增强了K27连接的Geminin多泛素化(图1)。2C)。为了确定Geminin的赖氨酸残基被SPOP泛素化,我们将标记的Geminin与SPOP和泛素联合转染293 T细胞,并收集细胞进行质谱分析。用质谱法检测了Geminin中赖氨酸残基27、50、100和127的泛素化。二维空间)。突变分析表明,只有Lys 100和Lys 127的突变显著降低了SPOP依赖的Geminin聚泛素化(图1)。2E)。Lys 100和Lys 127的突变完全消除了SPOP诱导的Geminin的多泛素化(图1)。2F)。这些数据表明SPOP在Geminin Lys 100和Lys 127上促进了K27连接的多泛素化。

图2:SPOP促进Geminin中赖氨酸100和127的泛素27连接泛素化。
figure2

a转染293 T细胞后,分别与Fag-Geminin和HA-Ub联合转染Myc-SPOP WT,收获ip和WB。b对照组或SPOP基因敲除293 T细胞,转染所述质粒,收获ip和WB。c293 T细胞转染HA标记的WT质粒或突变的Ub,并与其他指示的结构结合,用于IP和WB。d质谱分析显示,Geminin在赖氨酸残基27、50、100和127处泛素化。e, f转染293 T细胞后,将标记的WT或突变的双子蛋白与其他结构物联合转染,收获ip和WB。本文或门德利数据库(10.17632/8n7xt5rkhc.1)提供了来源数据。类似的结果(a), (b), (c), (e),以及(f)在两个独立的实验中获得了面板。

前列腺癌衍生的spop突变体不能促进geminin的泛素化

前列腺癌中的spop突变主要发生在mat域,它与底物结合有关。28,30,45(无花果)3A)。通过协IP分析,我们发现spopΔ数学突变体失去了与双子蛋白结合和促进泛素化的能力,而不能泛素化的CUL3结合缺陷突变体Δbtb则保留了与双子蛋白结合的能力(如图所示)。3B)。正如预期的那样,SPOPΔbtb未能促进双子座的泛素化(图1)。3C)。根据我们的核磁共振波谱和X射线结晶学的结果,双子座与SPOP-数学域在前列腺癌患者经常发生突变的表面上相互作用(图一)。1H-k),我们研究了前列腺癌相关的SPOP突变是否会损害其促进双子座多泛素化的能力。我们产生了11个前列腺癌相关的SPOP突变体。协同IP分析表明,与SPOP WT相比,所有11个SPOP突变体的Geminin结合能力均明显受损。三维空间)。SPOP介导的Geminin的多泛素化也被这些突变明显减弱。3E)。过表达SPOP-WT或SPOP突变体对Geminin蛋白水平无影响(附图)。2F)。此外,我们还发现,在SPOP F102C和F133V背景下,SPOP在体外消除了Geminin的泛素化,这是前列腺癌患者标本中最常见的两种SPOP突变(图一)。3F)。因此,前列腺癌相关的SPOP突变体不能促进Geminin的泛素化.

图3:前列腺癌衍生的SPOP突变体不能促进Geminin的泛素化.
figure3

a1013例前列腺癌SPOP和SPOP突变的结构域分析30. b将转染的293 T细胞与空载体(EV)、SPOP、WT或突变体联合转染,获得标记抗体的共IP和WB。c将所述质粒转染293 T细胞后,进行ip,检测Geminin的泛素化。d293 T细胞共转染FLAG-Geminin、SPOP、WT或突变体,共IP和WB。e293 T细胞共转染FLAG-Geminin、SPOP、WT或突变体,共IP和WB检测Geminin的泛素化。f体外泛素化实验方法是将重组的E1和E2酶与CUL3/RBX 1、Myc-SPOP WT、293 T细胞和gst-geminin共沉淀的突变体共同孵育。大肠杆菌. g, h标记蛋白和泛素化的共IP分析在293 T细胞中,瞬时转染了FLAG-Geminin-WT或S202F突变体。本文或门德利数据库(10.17632/8n7xt5rkhc.1)提供了来源数据。类似的结果(bh)在两个独立的实验中获得了面板。

到目前为止,检测到的几乎所有spop突变(只有一个例外)都是半野生突变,并且以一种显性阴性的方式起作用。27,30,45。为了模拟患者的病理生理状况,我们将SPOP的突变等位基因导入不含内源性突变SPOP的前列腺癌细胞系中。我们将SPOP突变体F133V转染BPH 1和DU 145细胞株,用或不加羟基脲(HU)作为复制抑制剂,观察Geminin蛋白水平在不同环境下是否发生变化。F133V的表达未改变Geminin或其伴侣Cdt 1的蛋白水平(补充图1)。2I)。因此,SPOP突变损害了Geminin的非降解多泛素化.

我们还注意到,在肺癌和结肠癌患者样本中,在SBC基序(S202F和T 203无义突变)中出现了两种TCGA基因突变(S202F和T 203无义突变)。Https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)。我们证明了Geminin S202F突变体没有被SPOP结合并被泛素化。3G,h)。这些数据表明,双子座和SPOP都可能是病理生理突变,并与疾病的进展有关。

SPOP介导Geminin的多泛素化抑制MCM蛋白与Cdt 1的结合

为了研究SPOP介导的泛素化对Geminin DNA复制调控功能的影响,我们研究了Geminin泛素化是否影响其与Cdt 1的相互作用。共ip数据表明,SPOP突变体F102C和F133V的瞬时表达对体外表达的Geminin与Cdt 1(补充图1)的相互作用没有影响。3A)。同样,F133V的稳定表达也不能在内源性水平上影响BPH 1和DU 145细胞的Geminin-Cdt 1相互作用(附图)。3B)。Geminin泛素化位点Lys 100和Lys 127的突变也不影响Geminin与Cdt 1的结合(补充图1)。3C)。由于mcm复合物与cdt 1的结合对于调控dna复制反应至关重要。20,21我们进一步研究了SPOP介导的Geminin泛素化是否影响MCM复合物对Cdt 1的连接。正如预期的那样,Geminin基因敲除增加了Cdt 1与前RC蛋白(MCM 2、CDC6和ORC 2)的结合,这一过程被shRNA抗性的WT Geminin的表达所逆转,而不是K100R/K127R突变体的表达(图一)。4A和补充图。三维空间)。类似于Geminin泛素化耐药突变体的作用,癌源性SPOP突变体的表达也增加了Cdt 1与MCM 2、CDC6和ORC 2的结合,但对Geminin与Cdt 1的结合没有影响(图1)。4B和补充图。3E).

图4:SPOP介导的Geminin多泛素化抑制MCM蛋白与Cdt 1的结合。
figure4

aPC-3细胞感染慢病毒,表达shRNAs或WT或突变的双子蛋白,收获后进行共IP和WB分析。b用表达空载体或不同SPOP突变体的慢病毒感染PC-3细胞,收获共IP和WB。c经构象优化,人Cdt 1-Geminin的结构与酵母Cdt 1-MCM的结构重叠。模型的K27连接的多泛素链连接到Geminin Lys 127(淡蓝色)是不相容的Cdt1-Geminin结合到MCM复合物。dfPC-3细胞感染表达对照shRNA或Geminin特异性shRNA的慢病毒,与空载体(EV)、Geminin WT或K 100/127 R突变体联合感染PC-3细胞。在WB分析前,用30μM BrdU对细胞进行脉冲标记。d),FACS分析(e),或量化(f)。数据表示为三个独立实验的平均±SD值。双尾未配对学生t-试验;*P < 0.001. Source data are provided in this paper or Mendeley database (10.17632/8n7xt5rkhc.1). Similar results for (a), (b),以及(d)在三个独立的实验中获得了面板。

目前关于复制起源和起源识别复合物形成的结构知识主要来源于对出芽酵母的研究。46,47。最近,通过截断mcm 6的C端WD结构域(PDB 6WGG),从酵母中获得了Orc cdc6-ct1-mcm(Occm)复合物预插入负载中间体的单粒子cryo-emm结构。47。该结构中间体在螺旋酶加载过程中先于OCCM的形成,说明Cdt 1与MCM复合物是如何相互作用的。虽然序列相似性较低,但人(HCdt 1)和酵母(YCdt 1)的cdt 1在中间(M-WHD)和C-末端(C-WHD)区域都有保守的翼螺旋结构域(WHD)(附图)。3F)48。由于这些结构上的相似性,我们利用hcdt 1的双子座M-WHD区(PDB 2 Wvr)的晶体结构建立了模型。26替换上述OCCM中间配合物(PDB6WGG)中相应的yCdt 1区域47。HCdt 1和yCdt 1 M-WHD结构可以在MCM配合物上不受任何空间干涉而被覆盖(附图)。第三代)。然而,结合双子座的C端部分却造成了空间位阻.基于hCdt 1-Geminin晶体结构的分子动力学模拟揭示了用于晶体学的双子座同质二聚体C端螺旋区的大幅度运动(附图)。3H)。考虑到这种灵活性,我们调整并优化了双子座C端区域的构象,以消除任何空间冲突。双子座OCCM的结构模型(图)。4C)预测K27连接的多泛素化在Geminin Lys 127会引起与MCM复合物的立体冲突,从而取代MCM中的Cdt 1。这一分析为SPOP介导的双子素泛素化是如何影响Cdt1-MCM相互作用的,而不是直接影响Geminin-Cdt 1相互作用提供了一个合理的解释。与图中的模型一致。4C结果表明,Geminin能降低MCM蛋白的表达,SPOP介导的Geminin多泛素化能减少Geminin-MCM复合物的形成(附图)。3i-k)。此外,体外翻译的MCM 2蛋白与从细菌中纯化的GST-Geminin没有直接结合(附图)。3L),表明Geminin与MCM蛋白间接相关。

我们进一步进行了荧光激活细胞分类(FACS)分析,以确定双子蛋白的SPOP泛素化对细胞再复制的影响。Geminin基因敲除增强了PC-3细胞的复制,并通过shRNA抗性的WT双子蛋白的恢复表达而逆转,而K100R/K127R的双突变体则没有逆转(图一)。4D-f)。这些数据表明,SPOP介导的Geminin多泛素化对抑制Cdt 1的复制功能具有重要意义。

前列腺癌衍生的spop突变体会增加复制起源的触发、再复制和基因组的不稳定性,特别是在抑制atr的情况下。

Geminin的cdt 1抑制功能在细胞周期的S期和G2期早期被激活,以阻止前rc的组装。16,19,26,49。我们试图确定SPOP是否以细胞周期依赖的方式调节双子座多泛素化.为此,PC-3细胞通过胸腺嘧啶和L-甲基肌苷双阻滞同步化(见图)。5A)。我们观察到,在S期和G2早期,SPOP-F133V突变细胞中DNA含量超过四倍体(>4N)的群体略有增加(图1)。5A)。SPOP蛋白在细胞周期中振荡,在空载体(EV)表达的对照细胞中G1期和S期表达增加(如图所示)。5B)。在EV细胞G1期后,Geminin蛋白水平也开始从S期开始升高。5B),类似于以前的报告15,49,50,51,52。然而,当MCM 2等前RC蛋白的染色质结合在对照组细胞完成复制和进入G2早期后开始减少时,SPOP-F133V突变细胞中,MCM 2与染色质的结合在S期和G2期仍较高(图1)。5B,c),表明SPOP F133V突变细胞在细胞周期的这一阶段复制机制仍然活跃。SPOP和Geminin蛋白水平在细胞周期中都有波动,在S期和G2早期稳定(图1)。5B),这意味着这两种蛋白质可能在细胞周期的这几个阶段协同工作。

图5:前列腺癌衍生的SPOP突变体增加复制起源的触发、再复制和基因组不稳定性,特别是在抑制ATR的作用下。
figure5

aPC-3细胞稳定表达空载体(EV)和SPOP-F133V突变体,经胸苷和L-甲基肌苷双阻断同步化。在指定的时间点释放细胞,进行流式细胞术(FACS)细胞周期分析。b表达EV和SPOP F133V的PC-3细胞同步表达。a),供世行采收。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。c染色质相关的MCM 2的蛋白质带。b另外两个重复用ImageJ定量,归一化为MCM 2蛋白水平。数据表示为平均值±SD(n=3)。这个P计算值采用双向方差分析。d只转染HA-Ub-K27-的Ev和F133V表达的PC-3细胞与诺可唑同步,在不同的时间点释放,用于IP和WB。e, f表达EV或SPOP F133V的PC-3细胞与对照或双子座特异性shRNAs联合感染。用30μM BrdU脉冲标记细胞30 min,取细胞进行流式细胞术(FACS)分析。e)和数量数据显示在(f)。数据显示为三个独立实验的平均±SD值。双尾未配对学生t-测试。g以表达空载体(EV)或F133V的慢病毒感染PC-3细胞为对照或双子蛋白特异性shRNAs,分别用DMSO或100 NMVE-822处理8h,然后进行DNA纤维检测。测量了200个复制触发源之间的源间距离(n=200)。数据显示为三个独立实验的平均±SD值。双尾未配对学生t-测试。h用DMSO或100 NMVE-822处理稳定的PC-3细胞8h,然后进行DNA纤维测定。从200条DNA径迹中定量了DNA的再复制,并给出了相对重复倍数的变化。数据显示为三个独立实验的平均±SD值(n=3)。双尾未配对学生t-测试。i用DMSO或增加剂量的VE-822处理PC-3细胞,用所指示的抗体对pC-3细胞进行免疫组织化学染色,获得阳性表达的pC-3细胞,表达所指示的shRNAs或EV或SPOP F133V。j用VE-822(100 Nm)处理稳定的PC-3细胞24 h,取细胞进行核型分析。每细胞染色体断裂的定量显示。统计了4个生物复制体的70多个中期。数据为平均±扫描电镜。双尾未配对学生t-测试。本文或门德利数据库(10.17632/8n7xt5rkhc.1)提供了来源数据。类似的结果(b), (d),以及(i)在两个独立的实验中获得了面板。

为了研究SPOP蛋白的细胞周期依赖性振荡对Geminin多泛素化的影响,我们用诺考唑法同步表达HA标记的K27-纯泛素(Ub)(HA-Ub-K27)的PC-3细胞。4A)。在S期和G2早期的对照细胞中,Geminin K27连接的多泛素化比其他阶段的细胞显著增加(图1)。5D)。值得注意的是,Geminin和E3连接酶(SPOP)在控制PC-3细胞的这两个阶段也达到了最高蛋白水平。5B)。然而,在SPOP-F133V突变体表达的PC-3细胞中,Geminin的细胞周期依赖的K27连锁多泛素化被完全消除,尽管Geminin蛋白水平保持着与对照细胞相似的振荡模式(图1)。5D)。值得注意的是,转染WT泛素的F133V突变细胞在S期和G2早期,Geminin的总泛素化率也降低了。4B)。此外,BrdU标记细胞的FACS分析表明,SPOP-F133V的表达增加了PC-3细胞的再复制细胞(>4N)。5E,f和补充图。4C)。在Geminin基因敲除细胞中,无论SPOP-F133V的表达情况如何,也得到了类似的结果。5E,f)。这些数据表明,SPOP突变细胞经历了一个异常的复制过程,包括前RC蛋白超载到染色质(图1)。5B,c)以及最终的DNA再复制(如图所示)。5E,f).

为了进一步评估SPOP突变对再复制的影响,我们采用DNA纤维检测异常复制。ATR-CHK 1通路在抑制潜伏的起源过火和防止核池中rpa耗尽方面起着关键作用,保护dna复制叉在S期不崩溃。53,54,55。我们在DNA纤维分析中加入了ATR抑制剂VE-822,以确定ATR抑制是否对SPOP突变细胞中的DNA再复制有任何额外的影响。作为阳性对照,我们发现在VE-822处理的细胞中,相邻两个来源之间的距离(起源间距离)减小了(如图所示)。5G和补充图。4D)。然而,在Geminin基因敲除或SPOP-F133V突变体表达细胞中,未经过VE-822处理的细胞也存在这种现象。5G)。重要的是,F133V和/或Geminin基因敲除细胞的起源间距离比对照细胞低,并在VE-822共处理后进一步缩短。5G)。源间距离的减少表明SPOP突变细胞中有更多的起始放电,这为前RC蛋白与染色质结合的增加提供了一个合理的解释(图1)。5B)。与对照细胞相比,表达SPOP突变体或双子座shRNA的PC-3细胞DNA重复复制也增加了几倍(图1)。5H和补充图。4EATR抑制剂治疗后,其作用进一步增强(图1)。5H)。增加的复制应激和再复制负担使atr抑制引起复制突变和双链断裂,并最终导致细胞死亡。54。我们评估了SPOP突变细胞是否也会出现这种情况。如预期的那样,单独使用ATR抑制剂可提高γ-H2AX在PC-3细胞中的水平,这种作用主要通过表达突变体F133V或Geminin基因敲除而增强(如图1所示)。5I)。然而,SPOP-F133V表达和Geminin基因敲除联合在ATR抑制剂作用下的PC-3细胞中未诱导DNA断裂(如图所示)。5I)。这些数据表明,SPOP和Geminin的作用途径相同,抑制ATR,导致复制突变和双链断裂。我们还检查了每组细胞经ATR抑制剂处理或不使用ATR抑制剂后,每个细胞的染色体内断裂数(见图)。5J和补充图。4E,f)。结果与γ-H2AX水平的变化一致。5I)。因此,前列腺癌相关的SPOP突变F133V损伤DNA复制检查点,促进染色体不稳定,并在ATR被抑制时导致复制突变。

SPOP突变细胞对ATR抑制非常敏感

因为SPOP突变细胞获得了明显的复制压力和再复制负担(如图所示)。5G,h),并遇到复制突变的ATR抑制(图一)。5i,j),我们假设SPOP突变的细胞由于复制突变而对ATR抑制剂过敏。为了验证这一假设,我们测定了两种不同的ATR抑制剂(AZD 6738和VE-822)处理的SPOP突变体BPH 1、C4-2、22Rv1、DU 145和PC-3细胞的存活率。剂量存活实验表明,SPOP突变体F133V在5种细胞株中的表达均使两种抑制剂的IC 50均低于EV对照细胞系(图1)。6A和补充图。5A-C)。ATR基因敲除对SPOP突变细胞的生长有明显的抑制作用,形成较少和较小的菌落,而在对照细胞中,ATR基因敲除只使细胞集落的大小和数量略有减少(图1)。6B,c和补充图。5D,e)。我们还用popq165p突变型异种移植(Pdx)模型研究了VE-822在临床相关环境下对前列腺癌转移灶的ATR抑制作用。45。类似于其他SPOP突变体,如F102C和F133V,Q165P失去了与双子座结合和泛素化的能力(补充图1)。5F,g)。与F133V表达细胞的结果相似,Q165P突变体表达的DU 145和PC-3细胞对VE-822的IC 50明显降低(图一)。6d,e和补充图。5H)和VE-822处理导致的菌落数比车辆处理的细胞要小得多(如图所示)。6f-i)。我们从Q165PPDX肿瘤中建立了细胞器。结果表明,模拟处理的SPOP Q165P细胞器的直径远大于Wt的细胞器直径,而用VE-822处理的SPOP Q165P细胞器的直径比对照小得多(图1)。6J,k)。我们还用VE-822治疗SPOP-WT和Q165PPDX肿瘤。与器官培养结果相似,SPOP Q165P突变体PDX肿瘤对VE-822的敏感性高于SPOP-WT PDX肿瘤(图1)。6L,m)。我们的数据表明,SPOP突变的前列腺癌细胞在体外和体内对ATR的抑制都非常敏感。

图6:SPOP突变细胞对ATR通路抑制敏感。
figure6

a5株表达EV或SPOP-F133V突变体的前列腺细胞株ATR抑制剂的IC 50分析。b, c对DU 145和PC-3细胞株进行集落形成试验,检测表达慢病毒对照、ATR特异性shRNA、空载体(EV)或SPOP突变体F133V。计数菌落数。有代表性的殖民地见(b)中显示的量化数据(c)。数据表示为三个独立实验的平均±SD值。双尾未配对学生t-测试。d, eEv、SPOP F133V和SPOP Q165P细胞在不同浓度VE-822作用下DU 145细胞的剂量-反应存活曲线d)和PC-3(e)细胞。数据显示为三个独立实验的平均±SD值(n=3个复制/组)。双尾未配对学生t-测试。fi对DU 145进行集落形成试验。f, g)和PC-3(h, i)DMSO或VE-822处理的细胞系。计数菌落数。有代表性的殖民地见(f, g)中显示的量化数据(H,我)。数据显示为三个独立实验的平均±SD值(n=3)。双尾未配对学生t-测试。j, k从Q165P PDX肿瘤中分离出SPOP WT和Q165P细胞器株,培养5d,再用DMSO或VE-822(200 NM)治疗5天。处理后的典型器官图像如下(j),器官直径的量化数据如下:k)。所有数据显示为平均值±SD(n=200)。这个P值是用未配对的双尾学生计算的t-测试。l, m将SPOP-WT或SPOP Q165P PDX肿瘤移植到SCID小鼠皮下,给予VE-822(60 mg/kg,每周5次,口服灌胃)或载体治疗。小鼠治疗3周后处死。异种移植物肿瘤被分离出来,并显示在(l)。从(l) (n=5)载于(m)。所有数据均以平均±SD表示。这个P计算值采用双向方差分析。本文提供了源数据。

讨论

虽然SPOP被广泛认为是前列腺癌的抑癌因子,SPOP突变与基因组重排的频率较高有关,但SPOP突变促进基因组不稳定的分子机制尚不清楚。在本研究中,我们确定了SPOP在保护DNA复制和染色体稳定性方面的作用。基于我们的发现,我们设想了一个模型,其中SPOP突变细胞增加了复制起源触发和再复制负担,导致复制突变和ATR抑制细胞死亡(图1)。7)。因此,我们的工作揭示了以前未被认识到的SPOP在防止DNA过度复制和基因组不稳定方面的作用。

图7:一个假想的模型描述了SPOP突变如何损害DNA复制并使癌细胞对ATR抑制敏感。
figure7

aSPOP-CUL3-RBX 1是一种E3泛素连接酶,与Geminin结合,在Lys 100和Lys 127处催化K27连接的Geminin多泛素化。b依赖于SPOP的Geminin多泛素化阻断Cdt 1与MCM蛋白的结合。多泛素化可以控制许可能力状态,防止DNA复制过度.c癌症相关的SPOP突变损害DNA复制监测,并导致复制起源、过度激发和再复制.dSPOP突变在ATR抑制作用下引发复制突变和癌细胞死亡。

双子座在调控复制许可方面发挥着关键作用,确保每个细胞周期只复制一个DNA。因此,Geminin蛋白的表达水平在G1期较低,或无法检测到,并在细胞周期的S期至G2期早期急剧升高。然而,Geminin的活性并不与其表达水平完全相关,这意味着除了其蛋白水平外,还存在其他调控双子蛋白活性的机制。有趣的是,之前的一项研究发现98YWK100双子座的母题对于双子座防止dna复制过度的关键,尽管其潜在机制尚未被探索。56。我们的数据显示Lys 100在98YWK100Motif是SPOP泛素化位点之一。最重要的是,我们发现Geminin K100R突变体保留了与cdt 1结合的能力,这与以前报道的能力相似。98阿瓦100突变体56,SPOP介导的Geminin K100R突变体泛素化显著减少。因此,我们的发现为双子座的临界功能提供了一个机械的解释。98YWK100Motif及其多泛素化在防止DNA过度复制中的作用。

长期以来,人们一直认为geminin/cdt 1存在不同的复制许可状态。24,25,26,57。然而,在细胞周期中,许可给许可的抑制状态之间的平衡是如何变化的仍然是一个悬而未决的问题。我们的工作表明,SPOP依赖的Geminin聚泛素化间接阻止MCM进入Cdt 1,这一效应可能是通过我们的结构模型预测的空间位阻来实现的。这种双子蛋白的翻译后修饰可能是双子座Cdt 1复合物的功能开关。我们承认其他机制是可能的,但我们提议的模型,与实验结果一致,为SPOP如何通过Geminin泛素化调控DNA复制提供了最简单的解释(图1)。7b)。在其他解释中,一种可能是由SPOP诱导的Geminin-Cdt1-MCM复合物的泛素化引起的构象变化。与K27连接的双子蛋白泛素化不会导致蛋白质降解和这种修饰是可逆的这一发现一致,我们的工作还表明,细胞周期中SPOP蛋白水平的振荡会导致双子蛋白泛素化的波动,从而使下一个细胞周期复制触发的允许状态重新形成。

癌症患者样本的全基因组和外显子测序表明,SPOP是原发性前列腺癌中最常见的突变基因。27,28表明SPOP突变是前列腺癌的一个重要亚型。Spop突变通常发生在带有保留野生型等位基因的杂合子状态,并且能够以显性阴性的方式调节已知的底物。32,33,58。我们的发现也证实了SPOP突变的显性阴性效应。几乎所有的突变体都失去了结合和泛素化双子蛋白的能力,即使存在内源性的SPOP(图1)。3D,e)。越来越多的证据表明,SPOP以大量的蛋白质底物为靶点进行降解,这意味着不同下游信号通路的失调将需要对突变的SPOP患者采取不同的治疗策略。事实上,表达前列腺癌衍生spop突变体的细胞由于bet家族蛋白brd 2、brd 3和brd 4的高表达而对bet抑制剂产生耐药性。32,33。相反,由于SPOP突变体不能激活双子蛋白抑制DNA复制过火的功能(图一)。7C),SPOP突变在ATR抑制作用下触发复制突变(如图所示)。7D)。这一模型的进一步支持,我们的发现,SPOP突变的前列腺癌细胞是高度敏感的ATR抑制。因此,我们的发现为SPOP突变型前列腺癌患者的新治疗药物的发展提供了新的线索。

综上所述,SPOP通过控制Geminin的泛素化和Geminin/Cdt 1复合物从复制许可到许可-缺陷状态的转换,在保证DNA复制的正常过程中起着重要的作用。我们进一步证明SPOP蛋白的表达在S期和G2期处于稳定状态,从而触发了Geminin的多泛素化,并在正常细胞周期的这几个阶段阻止了DNA的异常复制。我们还揭示了SPOP的突变导致双子蛋白失活和不想要的复制、过度激发和再复制。我们的发现,SPOP突变触发复制灾难,大规模的DNA断裂,和细胞死亡的ATR抑制突出表明,携带SPOP突变的前列腺癌可能容易受到ATR抑制剂的治疗。


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