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环境胁迫调节β-ars/ccl 2轴诱导小鼠抗肿瘤免疫及增强对肝癌的免疫治疗作用

二维码

发表时间：2021-10-09 09:22作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

虽然心理社会压力是一个众所周知的因素，有助于癌症的发展，但目前还不清楚环境真应激是否和如何影响恶性疾病和调控与癌症有关的治疗反应。利用建立的优应力模型，我们证明生活在丰富环境(EE)的小鼠由于CD8而不受致癌物引起的肝脏肿瘤和可移植的同基因肝癌的保护。+T细胞依赖性肿瘤控制。我们在应激反应中发现了一种外周神经-内分泌免疫途径，包括交感神经系统(SNS)/β-肾上腺素能受体(β-Ars)/CCL 2，可以解除肿瘤的免疫抑制，克服PD-L1对免疫治疗的抵抗力。值得注意的是，EE能激活肿瘤细胞和肿瘤浸润的髓系细胞中的外周SNS和β-Ars信号，从而抑制CCL 2的表达，激活抗肿瘤免疫。无论是阻断CCL 2/CCR 2还是阻断β-AR信号在EE小鼠中都失去了对肿瘤的保护能力。我们的研究表明，环境胁迫通过EE刺激抗肿瘤免疫，导致更有效的肿瘤控制和更好的免疫治疗效果。

导言

心理压力对健康的影响已被广泛关注和调查。1,2,3，尤其是在新冠肺炎爆发后，导致社区中的恐惧、焦虑、抑郁和压力感增加。4,5。流行病学研究表明心理压力与癌症进展之间存在联系。6,7,8,9,10。然而，提供的证据有限且不一致。此外，这些研究大多集中在与严重压力(窘迫)的消极方面有关的压力源上，而更积极的环境刺激对癌症生物学的影响仍然很大程度上尚不清楚。

心理应激导致免疫功能障碍，进而调节肿瘤的发生和发展。11,12。许多研究表明，免疫细胞，包括淋巴细胞和髓系细胞，都含有应激激素反应所必需的受体。11,13。交感神经系统(SNS)调节应激反应，包括正常应激反应和痛苦反应。SNS的激活对生物体有有利和有害的影响，这取决于响应的持续时间和其他未知因素。交感神经反应的系统性特征表明肿瘤微环境中的肿瘤、免疫细胞或基质细胞可能受到远处或局部应激相关激素水平变化的影响。13.

肝脏是负责处理生理应激的器官之一。人口研究揭示了心理困扰与三种主要肝病：病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)之间的正向因果关系。14,15。然而，积极的心理属性是否降低肝癌的风险，它们是否有益于癌症相关治疗的结果，以及潜在的分子机制仍不清楚。从临床角度看，更好地理解压力(窘迫和正常应激)如何改变肝脏疾病将为治疗肝病提供额外的工具。它将通过优化住院条件和确保更有效的治疗方法来改善患者的生活质量。

环境丰富(EE)是一个建立的环境优应力模型，为老鼠提供更多的社会互动，在一个大的活动空间，运行车轮运动和其他玩具，以躲藏和玩。16,17,18。已经证明，EE能产生一系列有益的效果，使小鼠“更快乐”，减少焦虑。19，以及改善神经退行性疾病的症状。20和癌症16,17。然而，它需要进一步的调查和询问是否和如何影响肝癌和癌症相关的治疗反应。

本文利用3种致癌物诱导的肝脏肿瘤模型和3种可移植的同种肝脏肿瘤模型，证明了EE介导的环境真应激肽诱导的肿瘤主要通过调节肿瘤微环境中的局部β-Ars/CCL 2轴而依赖于适应性免疫。

结果

在丰富的环境中居住可减少肝癌的发生和肿瘤的生长。

心理社会困扰是肝脏疾病发生和死亡的危险因素。15。减少的痛苦水平和焦虑样行为是两个主要的表型提供了建立的模型，如丰富的环境(EE)住房(图)。1A)。为了探讨二乙基亚硝胺(DEN)和四氯化碳(CCL)三种致癌物或饮食诱导的肝脏肿瘤小鼠模型，探讨优应力对肝脏恶性进展的潜在保护作用。4)模型，DEN和高脂饮食(Hfd)模型，ccl。43种可移植性小鼠肝癌模型(Hepa1-6，LPC-H12，H22)均位于标准环境(SE)或EE中。DEN+CCL4单次注射DEN复制小鼠模型，然后重复给药。4模拟人类遗传毒性损伤和晚期纤维化相关肝癌(图一)。1B)。在SE小鼠中，使用DEN/CCL后，肝脏肿瘤明显增强。45月龄时，100%小鼠发生肝脏肿瘤。相比之下，72%的EE小鼠出现肝癌，肿瘤数量和大小减少(图一)。1C-E)。组织病理学分析进一步表明，EE促进了小鼠对DEN/CCL的保护作用。4-肝纤维化、肝细胞腺瘤和癌。1F、g)。值得注意的是，EE住房也降低了血清AST和ALT(补充图)。1A，B)与慢性肝损伤相关的病理标记物。我们还探讨了EE对DEN/高脂肪饮食(HFD)诱导的(补充图)的影响。1C)或CCL4-诱导(附图)1g)肝癌的发生，分别模仿脂肪肝-肝癌模型和慢性炎症-肝癌模型。EE在DEN/HFD模型(补充图1D-F)和CCL中持续减少肿瘤数目和肿瘤大小。4-肝癌模型(附图)。1H-K)，除了增加体重(补充图)。1L).

其次，我们采用可移植的同种异体Hepa1-6和H22肝癌模型，研究了EE对肿瘤生长和进展的影响。3周龄C57BL/6小鼠(Hepa1-6模型)和BALB/c小鼠(H22模型)随机分为SE组或EE组，分别在皮下注射Hepa1-6和H22细胞。氢、K)。老鼠被关在原来的房子里(如图所示)。氢、K)。在EE小鼠中，Hepa1-6和H22肿瘤生长明显慢于SE小鼠，抑制率分别为49.3%和50.7%。1I、L.肿瘤体积分别减少68.4%和47.4%。1 I-M).

综上所述，这些结果表明EE对肝癌的发生和生长有保护作用。

EE介导的抗肿瘤作用依赖于CD8+T细胞

通过EE培养的阳性应激反应被怀疑能增强宿主的免疫系统对癌症的抵抗力。16,21,22。在这里，我们询问免疫系统是否与EE介导的抗肝癌模型的抗肿瘤作用有关。为探讨免疫效应细胞是否与何种免疫效应细胞介导EE诱导的肿瘤抑制作用，对DEN+CCL中的肿瘤浸润免疫细胞进行了分析。4-诱发肿瘤(图1.2A)，Hepa1-6肿瘤。2B)和H22肿瘤。2C)。EE小鼠DEN+CCL的流式细胞分析4肿瘤CD8显著升高+与SE小鼠相比，T细胞和M-MDSCs、G-MDSCs、M2样TAMs显著减少(图1)。2A、D)。其他免疫细胞的数量，如CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)和自然杀伤细胞(NK)无明显变化。2A及补充图2G，H)。同样，在可移植Hepa 1-6或H22肿瘤的EE小鼠中，CD8增加。+检测到T细胞和减少的G-MDSCs和M2样TAMs。2B、C、E)。DEN+CCL上CD4、CD8、F4/80和Ly6G免疫组化染色4肿瘤进一步证实了肿瘤微环境的重塑(补充图2A，B)。为了测试适应性免疫系统是否对EE介导的肿瘤保护是必需的，用抗CD4、抗CD8或抗NK1.1耗竭抗体结合SE或EE外壳治疗小鼠。而EE对CD4后肿瘤的生长仍起作用。+T细胞和NK细胞耗竭(补充图2C，F)，CD8+T细胞耗竭可阻断EE对Hepa 1-6的抗肿瘤作用(图1)。2F)，H22(图1.2G)LPC-H12(图1.2H)，以及DEN+CCL4(无花果)2I)肿瘤模型。这一数据表明CD8+T细胞，而不是CD4+T细胞或NK细胞是EE介导的肿瘤抑制所必需的.

TAMS和MDSCs是免疫抑制性髓系细胞的两个主要亚群，它们可以抑制肿瘤微环境中功能性T细胞的浸润和增殖。以上结果提出了CD8的增加是否存在的问题。+T细胞是由EE介导的抑制TAMs和G-MDSCs浸润所致.如所料，在SE小鼠中，用氯膦酸盐脂质体(补充图2D)或用Ly6G-抗体(补充图2e)的G-MDSCs抑制肿瘤生长并诱导CD8浸润。+T细胞(补充图3D)，模拟EE(补充图2D，E)的作用。TAMS或G-MDSCs耗竭小鼠CD8的百分率较高。+T细胞在肿瘤中，SE与EE之间无显着性差异(附图)。三维空间)。这些结果提示EE升高了CD8。+T细胞通过抑制TAMS和G-MDSCs的浸润.

在EE小鼠中，对Hepa 1-6肿瘤的qRT-PCR分析显示，与SE小鼠相比，IL-12A、iNOS、IL-6、TNF、CD 14、IFN-γ、IFN-β表达明显增加，抗炎细胞因子Arg 1、mMGL 2、FZZ 1、CD 163、Retn1a、IL-10和TGF-β表达显著降低(P<0.0 5)。EE对CD8的影响+T细胞通过G-MDSCs和巨噬细胞，原代CD8+T细胞与极化的G-MDSCs或巨噬细胞体外共培养，分离自野生型小鼠股骨或Hepa1-6荷瘤小鼠皮下在SE或EE条件下分离的T细胞(补充图3B，C)。结果表明，从荷瘤小鼠体内分离到的G-MDSCs或巨噬细胞增加了CD8。+T细胞增殖，提示EE可抑制肿瘤培养的G-MDSCs或M2样巨噬细胞的免疫抑制作用(附图)。3B、C).

以上结果表明，EE改变了免疫抑制肿瘤的微环境，增强了CD8。+T细胞介导的抗肿瘤免疫。

CCL 2/CCR 2信号通路在EE诱导的抗肿瘤免疫中的作用

越来越多的研究发现，环境应激和危难在影响炎症反应中起着重要作用。11,23。接下来，我们建立了SE或EE环境下野生型小鼠或肝癌负荷型小鼠的模型，并在25种炎症细胞因子和趋化因子谱的背景下比较了免疫反应的规模和强度(图1)。3A和补充图。4A，B)。血清分析表明，DEN/CCL中趋化因子CCL 2、CCl 3、CCl 4、CXCL 1、CXCL 2、G-CSF和细胞因子IL-1β水平增高。4经治疗的小鼠与野生型小鼠相比(图1)。3A)。有趣的是，EE住房对野生型小鼠血清炎症因子水平无明显影响，但显著降低了DEN/ccl水平。4-刺激CCL 2(图1.3A)。CCl 4和G-CSF也下降，但无统计学意义(图二)。3A)。同样，CCL的血清或肿瘤组织中CCL 2也显著减少。4-诱导(附图)4A，C)和DEN/HFD诱导的小鼠模型(补充图4B，D)在EE条件下与SE比较。CCL 2已被证明是肿瘤浸润免疫抑制性髓系细胞(如TAMS和MDSCs)的主要趋化因子，可促进肝纤维化、脂肪变性和肝癌的发生。24,25。与此相一致，在DEN/CCL中发现肿瘤组织中CCL 2的表达减少。4-诱导(图1.3B，补充图4G，4E)，CCL4-诱发(补充图4C)和DEN/HFD诱导的HCC模型(补充图4D)与SE相比。我们进一步研究了CCL 2/CCR 2信号通路是否与EE的抗肿瘤作用有关。尤其是EE对DEN/CCL的保护作用4CCR 2中的肝癌发生被取消−/−老鼠(图1.3C)。为了进一步研究CCL 2/CCR 2信号在EE介导的抗肿瘤免疫中的作用，我们对DEN/CCL中肿瘤浸润免疫细胞进行了研究。4-流式细胞仪分析诱导肿瘤。在WT小鼠体内有EE，CD8+肿瘤微环境中T细胞明显增多，M2样TAMs和G-MDSCs减少，而CCR 2则明显减少。−/−小鼠CD8无明显变化+T细胞和M2样TAMs出现在SE和EE住房条件之间(图1)。三维空间)。值得注意的是，来自CCR 2的肿瘤组织中的G-MDSCs仍在减少。−/−在EE中居住的老鼠(图)。三维空间)。然后，我们再次出现可移植的Hepa1-6和H22肿瘤模型，以证实EE依赖CCL 2的肿瘤抑制作用。高水平的CCL 2在Hepa1-6细胞中分泌，而在H22细胞中几乎没有分泌(补充图4e)。分析表明，EE促进了CCL 2在Hepa 1~6肿瘤组织中的表达降低，且具有一致性(补充图4F、G和图)。4E)。我们进一步使用抗小鼠CCL 2的中和抗体来抑制其功能。如图所示。3F抗CCL 2抗体可明显抑制Hepa1-6的肿瘤生长。3F)在SE小鼠中。值得注意的是，阻断CCL 2可阻断EE对DEN+CCl 4肿瘤生长的抑制作用(图1)。3E)和Hepa1-6模型(如图所示)。3F)，证实CCL 2在EE诱导的肿瘤中的抑制作用。流式细胞仪分析进一步显示阻断SE小鼠CCL 2的作用模拟了EE介导的肿瘤微环境重塑的作用，即CD8的增加。+T细胞和M1样TAMs减少，G-MDSCs和M2样TAM减少(图1)。第三代).

图3：EE诱导的抗肿瘤免疫需要CCL 2/CCR 2信号转导。

A正常或DEN/CCL血清中细胞因子和趋化因子的检测4-致肝癌小鼠(n(5)在标准环境(SE)和富集(EE)饲养条件下，采用小鼠磁光筛选法。所有数据均以均值±扫描电镜表示，并进行了双向方差分析。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. BDEN/CCL肝癌组织CCL 2免疫染色的代表图像4-肝细胞癌模型(左)。用图像J分析量化了20×10放大率下CCL 2的相对表达量(右，n=10)。原始放大倍数为20×10，标度条为100μm，原始放大率为40×10，标度为100μm，数据为平均±扫描电镜，用双尾未配对学生的数据进行分析。t测试一下。C野生型(WT)或CCR 2敲除型(WT)和直径为3mm(右)的肿瘤总数(左)和直径(≥)−/−)小鼠注射DEN+CCL4在SE或EE条件下喂养(nSE组WT小鼠=8，n=10其他群体)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试一下。DDEN+CCL肿瘤微环境中浸润免疫细胞的流式细胞术分析4模型(n=8-9)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. EDEN+CCL肝内肿瘤总数及直径≥3mm4-在SE或EE喂养条件下，用抗CCL 2中和抗体(抗CCL 2)治疗小鼠(SE+VEH：n=6，EE+VEH：n=10，SE+反CCL 2：n=5，EE+反CCL 2：n=5)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试一下。F抗CCL 2中和抗体治疗C57BL/6小鼠皮下Hepa1-6肿瘤体积(左)和肿瘤重量(右)n为SE组车辆=8，n=10其他群体)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t**测试p < 0.01. G采用流式细胞术对Hepa1-6肿瘤微环境中浸润的免疫细胞进行分析。n=每组8人)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. H抗CCL 2中和抗体治疗C57BL/6小鼠皮下H22肿瘤体积(左)和肿瘤重量(右)nEE+抗CCL 2组=9，n=12其他组别)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试*p < 0.05, **p < 0.01.

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图4：EE增强β-AR信号，通过交感神经系统控制肿瘤.

A，B正常小鼠血清和肝脏中肾上腺素(EPI)和去甲肾上腺素(NE)的ELISA分析A或DEN+CCL4-治疗小鼠B在标准环境(SE)和富集(EE)条件下饲养(A，血清EPI，SE：n=11，EE：n=7；血清NE，n=每组9；肝脏EPI或NE水平，n每组=4；B，血清EPI、SE水平：n=9，EE：n=8；血清NE，n每组=6；肿瘤EPI或NE、SE水平：n=6，EE：n=10)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试一下。Cβ1-肾上腺素能受体(AR)、β2-AR和β3-AR在DEN+ccl肝癌组织中的表达4-小鼠肝癌模型。原放大倍数20×10，刻度棒，100μm。Dβ1-AR、β2-AR和β3-AR在DEN+ccl中的表达。4-小鼠肝癌模型(n=每组8人)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试一下。E免疫印迹法检测β1-AR、β2-AR、β3-AR和CCL 2在DEN+CCL肿瘤组织中的表达4-肝细胞癌模型及皮下肝1~6肿瘤(n=每组4人)。FDEN+CCL肝脏肿瘤总数(左)和直径3mm(右)的肿瘤数目4-诱导荷瘤小鼠。在SE或EE条件下，分别给予β-Ars阻断治疗(β-阻滞，SR59230A+心得安)。Vehicile+SE：n=7，Vehicile+EE：n=9，β-块+SE：n=9，β-块+EE：n=9.所有数据均以平均值±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试一下。G，H皮下Hepa1-6荷瘤小鼠的肿瘤体积G和H22荷瘤小鼠H未经(车辆，VEH)或β-Ars阻断治疗(G，SE+VEH：n=8，EE+VEH：n=12，SE+β-块：n=10，EE+β-块：n=12；H，SE+VEH：n=8，EE+VEH：n=8，SE+β-块：n=11，EE+β-块：n=8)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. I皮下注射或不注射6-羟基多巴胺(6 OHDA，25 mg/kg)SE+VEH小鼠皮下肝癌体积：n=12，EE+VEH：n=11，SE+6 OHDA：n=11，EE+6 OHDA：n=14.所有数据均以平均值±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t试验用*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. J-L流式细胞术检测肿瘤免疫细胞百分比。4GH、图1.4HI还有无花果。4IJ(J)n=每组6；k，nSE+VEH组和EE+VEH组=6，n=5表示SE+β-块和EE+β-块组；LnSE+VEH和EE+VEH组=10，nSE+6 OHDA组和EE+6 OHDA组=6)。所有数据均以平均±扫描电镜表示，并采用双尾未配对学生的方法进行分析。t测试*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

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为了更好地确认肿瘤细胞或宿主CCL 2信号对EE介导的肿瘤抑制是必不可少的，WT还是CCL 2？−/−将接种于SE或EE中的小鼠接种不同CCL 2状态的Hepa 1-6细胞(CCL 2 WT或CRISPR介导的KO)。结果表明，敲除肿瘤源CCL 2或宿主来源CCL 2可抑制肿瘤生长，部分降低EE的抗肿瘤作用。相反，阻断肿瘤源和宿主来源的CCL 2信号则可以阻断EE的保护功能(补充图4G)。与此相一致的是，在CCL 2-空H22肿瘤模型中，EE仍具有保护肿瘤的作用，而CCL 2中和抗体阻断宿主CCL 2信号后，EE仍具有保护肿瘤的作用(如图1所示)。3H).

综上所述，CCL 2可能是EE诱导的抗肿瘤免疫和肿瘤微环境重塑的关键。

EE增强β-AR信号通过交感神经系统控制肿瘤

SNS通常与应激反应有关。为了建立EE、SNS和抗肿瘤免疫之间的机制联系，我们首先研究了EE对外周SNS激活的主要神经内分泌介质去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(EPI)的影响。结果表明，两种野生型小鼠血清中NE和EPI水平均有升高。4A)和DEN+CCL4-诱发荷瘤小鼠(图1.4B)在EE的住房条件下。在正常小鼠肝脏中，EE住房下NE水平升高，EPI水平无明显变化(图二)。4A)与SE住房相比。而在DEN+CCl 4处理的小鼠肝脏中，EE组NE和EPI水平显著升高(图一)。4B)。同时，EE-诱导DEN+CCL小鼠骨髓NE水平升高，脾EPI水平升高。4-诱发荷瘤小鼠(补充图5B)，其中EE不影响正常小鼠骨髓和脾脏中的肾上腺素或去甲肾上腺素(补充图5A)。SNS可能直接支配与肿瘤生物学和局部免疫调节相关的靶器官。其次，我们分析了主要的NE受体和肾上腺素受体(Ars)在肿瘤部位的表达情况，包括α-肾上腺素受体(α1-AR或ADRA 1、α2-AR或ADRA 2)和β-肾上腺素受体(β1-AR或ADB 1、β2-AR或ADB 2、β3-AR或ADB 3)。结果表明，β1-AR和β3-AR在DEN+ccl中的表达显著增加。4-诱发(补充图5C)和DEN+HFD诱导的小鼠肿瘤组织(补充图5D)。有趣的是，酪氨酸羟化酶(TH)的mRNA表达在两种模型中均有上调(补充图)，TH是SNS激活的标志。5c，D)。组织病理学、免疫组织化学和免疫印迹分析进一步证实了β1-AR、β2-AR和β3-AR蛋白在DEN+ccl中的表达上调。4-诱发EE小鼠肿瘤(图1)。4C-E)。认为EE可导致β-肾上腺素能信号的慢性激活，从而介导其对肿瘤的保护作用。16,17,21。与此相一致的是，EE未能保护小鼠免受DEN+CCL的攻击。4-接受β-阻滞剂(支柱+SR，阻断所有β-Ars)诱发肝癌的发生。4F)。接下来，我们采用可移植的Hepa1-6、H22和LPC-H12皮下移植模型。β1-AR、β2-AR和β3-AR的mRNA和蛋白表达均有增加.4E和补充图5e)在Hepa1-6肿瘤组织中的EE住房小鼠。值得注意的是，在肿瘤微环境中，β-Ars在肿瘤细胞、TAMS和G-MDSCs中均有表达。结果表明，EE提高了CD 45-(主要为肿瘤细胞)、CD 45+(免疫细胞)(补充图5F)、TAMS(补充图5G)和G-MDSCs(补充图5H)的β1-AR和β3-AR mRNA表达水平。β2-AR mRNA在肿瘤细胞和TAMS中仅表达上调，而在G-MDSCs中不表达(补充图5F-H).此外，阻断β-AR信号有效地消除了EE介导的Hepa1-6肿瘤抑制作用(图1)。4G和补充图5J)和H22肿瘤模型(图5。4H和补充图5J)。相比较而言，当α-AR信号被阻断时，EE仍有抑制肿瘤生长的作用(补充图5i)。我们推测交感神经可能通过传导EE真应激反应信号来激活β-AR信号，重塑肿瘤的微环境，控制肿瘤的生长。为了直接验证这一假说，我们用6-羟基多巴胺(6 OHDA；腹腔注射)治疗SE或EE小鼠，破坏外周SNS，然后接种Hepa1-6肿瘤细胞。结果表明，与β-AR阻滞剂治疗类似，6 OHDA诱导的交感神经切断术消除了EE对肿瘤生长的抑制作用。4I及补充图5J)。流式细胞仪分析也显示阻断β-ars信号通路可阻断EE介导的CD8的增加。+DEN+CCL肿瘤微环境中T细胞及G-MDSCs和M2样TAMs的减少4肿瘤模型(图1.4J)或Hepa1-6皮下肿瘤模型。4K)。此外，6 OHDA诱导的交感神经切断术导致肿瘤浸润免疫细胞的模式类似于β-Ars阻滞剂(如图所示)。4L)。然后，我们研究了通过NE或EPI长期激活β-Ars信号是否能模拟EE的免疫调节作用。结果表明，在SE小鼠中适度刺激NE或EPI对肿瘤生长有抑制作用(附图)。5K)，模仿EE的抗肿瘤作用。流式细胞仪分析显示CD8增加。+β-Ars信号激活后SE小鼠T细胞及G-MDSCs和M2样TAMs的减少，表现为“EE样”表型(附图)。5L).

总之，这些结果证明了SNS激活的β-Ars信号在肿瘤微环境中的重要作用，有助于EE诱导的肿瘤控制.

激活β-Ars信号抑制CCL 2表达和释放

鉴于环境胁迫能特异性降低肿瘤微环境中CCL 2水平和激活的β-Ars信号，并考虑到这两种信号在EE介导的肿瘤控制中的本质，我们决定关注这些信号的相关性。此外，先前的研究表明炎症是由交感神经张力通过β-ars调节的。13。首先，我们评价了CCL 2能否与β-Ars共定位，并利用药理学方法分析了CCL 2的调控机制。用原位免疫组织化学方法分析ccl 2、β1-AR、β2-AR、β3-AR和CD 45在DEN+CCL中的表达。4-诱导肿瘤组织(图1.5A及补充图6A)。结果显示β1-AR、β2-AR和β3-AR在肿瘤和免疫细胞中均有广泛表达.5A)。此外，CCL 2与β-Ars共定位，在肿瘤细胞和免疫细胞中均有表达。5A)。这与我们的发现一致，肿瘤来源和免疫细胞来源的CCL 2信号是EE诱导的抗肿瘤免疫所必需的。此外，阻断β-Ars信号(支柱+SR，阻断所有β-Ars)可显著抑制EE引起的CCL 2在血液中的减少(图1)。5D)和肿瘤组织。5B，E，F)在DEN+CCl 4诱导的肝癌模型中。接下来，我们利用可移植的Hepa1-6肿瘤模型来证实SNS/β-Ars信号转导与CCL 2调控的相关性。在SE或EE中的小鼠皮下接种高表达CCL 2的Hepa1-6细胞。如图所示，EE住房显著降低了血清(补充图6B)和肿瘤组织中CCL 2的表达水平。5C)，其效应被阻断β-Ars信号而被破坏(如图所示)。5C和补充图6B)。有趣的是，在CCL 2-空H22肿瘤模型中，病理免疫组化分析显示，CCL 2高表达的巨噬细胞在SE小鼠的肿瘤组织中有很强的浸润。相反，我们观察到EE小鼠的这些细胞明显减少，而在β-Ars阻断的EE小鼠中则没有明显的减少(补充图)。6C)。其次，我们用6 OHDA诱导的交感神经切除术检测了外周SNS对肿瘤部位CCL 2表达的影响。与β-AR阻滞剂类似，6 OHDA治疗也可消除EE诱导的肝癌组织CCL 2抑制作用(补充图6d)。为了进一步确定肿瘤源和宿主来源的ccl 2的特异性表达，我们分离了CD 45。−CD 45细胞+免疫细胞CD11b+F4/80+Ly6G−TAMS和CD11b+F 480-Ly6G+Ly6C-/低从Hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织中提取的G-MDSCs。QRT-PCR结果显示，EE外壳导致肿瘤细胞和免疫细胞(包括TAMS和G-MDSCs)CCL 2 mRNA表达显著下降。5G-I)。值得注意的是，当β-Ars信号传导被阻断时，这些效应就被破坏了。5G-I)。这些结果表明，肿瘤源性和宿主源性CCL 2均受β-Ars信号的调控，并参与EE介导的肿瘤控制。

图5：交感神经调节CCL 2表达通过β-Ars作为外周神经-内分泌免疫途径调节肿瘤。

为了确定NE或EPI是否直接影响CCL 2的表达，我们将其与人肝器官、小鼠肿瘤细胞、小鼠源性BMDMs和G-MDSCs(补充图6e-H)共同孵育。人肝细胞/肝星状细胞细胞器能较好地模拟肝纤维化过程，在肝癌发生中起着重要作用。有趣的是，低浓度的NE(50μg/ml或5 0 0μg/ml)和EPI(5 0μg/ml)降低了CCL 2 mRNA的表达，而高剂量的NE(5 0 0 0μ/ml)和EPI(5 0 0μg/ml或5 0 0 0μg/ml)则增加了肝组织CCL 2的表达(补充图6)。同样，在肝癌细胞(补充图6F)、BMDMs(补充图6g)和G-MDSCs(补充图6h)中，NE/EPI浓度与CCL 2表达也呈U型关系，表明中等水平的NE/EPI水平和SNS/β-AR信号的激活使CCL 2得到较好的控制。据此，我们进一步确定了NE/EPI浓度与肿瘤控制的关系。用不同剂量的去甲肾上腺素(NE)或肾上腺素(EPI)灌胃给LPC-12荷瘤小鼠，观察肿瘤生长情况。结果表明，低剂量(2mg/kg)NE/EPI可抑制S.C。肿瘤生长，但高剂量6 mg/kg EPI或8mg/kg NE对LPC-12荷瘤小鼠的肿瘤生长有促进作用(补充图6i，J)。这些数据表明，EPI/NE的促肿瘤或抗肿瘤作用取决于不同情况下的特定剂量，这将是进一步研究的兴趣所在。

总之，这些数据表明交感神经调节肿瘤来源和宿主CCL 2的表达，通过β-Ars作为外周神经-内分泌免疫途径进行肿瘤调节。

EE克服了基于PD-L1的检查点封锁电阻

只有少数肝癌患者对基于pd-1的免疫治疗有反应。26。耐pd-1的患者通常表现出与免疫抑制、血管生成、单核细胞和巨噬细胞趋化作用有关的上调基因的明显特征。27,28。正如前面所讨论的，环境应激反应改变了免疫抑制性肿瘤的微环境，并诱导了抗肿瘤免疫，这推动了一种假设，即EE可能有助于克服PD-1抵抗。为了验证这一点，我们将EE住房和抗pd-ll联合应用于荷瘤小鼠。4-诱发的肝癌肿瘤(图1)。A)。在SE小鼠中，DEN+CCL4治疗导致许多肿瘤结节在肝脏，这是不能对pd-L1免疫治疗(图一)。B、c)。始终如一的是，单纯的EE住房明显减少了肿瘤的数量和大小(图1)。B、c)。与之形成鲜明对比的是，联合组中的小鼠表现出较强的肿瘤控制能力和最小的肿瘤大小(如图所示)。B、c)。此外，EE住房显着地提高了总数(图1)。D)和干扰素-γ产生肿瘤滤过的CD8。+T细胞(图1.E抗PD-L1抗体治疗小鼠循环IFN-γ水平升高(图一)。F)。接下来，我们再次使用可移植的LPC-H12和H22模型来研究EE对PD-L1免疫治疗的影响。C57BL/6和BALB/c小鼠在SE或EE条件下均为S.C。分别接种LPC-H12和H22肝癌肿瘤细胞，然后进行抗PD-L1治疗(图1)。在LPC-H12荷瘤小鼠中，PD-L1或EE对肿瘤生长的抑制作用分别为49.5%和46.9%。H和补充图。7A)。相比较而言，在EE和接受PD-L1治疗的小鼠体内，肿瘤生长抑制率为72.8%(如图1所示)。六小时)。H22肿瘤对PD-L1治疗或EE住房治疗相对不敏感，抑制生长分别为25.9%和36.6%(图1)。I及补充图7A)。同样，联合治疗对其抗肿瘤作用有协同作用，抑瘤率为62.3%(图一)。6I).

为了进一步阐明EE住房对PD-L1阻断的协同作用机制，我们采用流式细胞术分析肿瘤微环境中肿瘤浸润的免疫细胞，并在LPC-H12肿瘤模型中跟踪抗原特异性T细胞。我们发现CD8显著增加。+EE小鼠肿瘤组织中T细胞减少，G-MDSCs和M2样TAMs减少，PD-L1单独作用产生的效果相似，但效果差得多。重要的是，这些效应在组合组中被显著放大(图1)。6J)。我们进一步追踪荷瘤小鼠脾脏中肿瘤抗原特异性T细胞。结果表明，PD-L1阻断对EE小鼠肿瘤反应性IFN-γ产生的T细胞有协同作用。6K)。这些数据表明，EE住房增强了肿瘤的免疫原性，增加了CD8。+T细胞浸润与肿瘤特异性CD8+T细胞反应与PD-L1阻滞相结合。这些结果表明EE和PD-L1阻断在控制免疫治疗难治性HCC肿瘤方面具有很强的协同作用。

最近的研究表明，肿瘤组织中的交感神经和副交感神经与pd-1/pd-l1相关。29。如前所述，EE通过SNS/β-Ars抑制肿瘤，这推动了一种假设，即EE可能通过SNS/β-Ars帮助克服PD-L1抵抗。结果表明，NE或EPI能模拟EE(补充图5K，L和补充图7b，C)对肿瘤的抑制作用和免疫调节作用。值得注意的是，小鼠在NE或EPI联合αPDL 1显示了一个强有力的肿瘤控制和最小的肿瘤大小(补充图7C)。阻断β-AR信号阻断DEN+CCL中基于PD-L1的检查点阻断抗性的EE介导的增敏效应4-诱导(补充图7D，E)和LPC-H12肿瘤模型(补充图7F，G)。

这些结果表明EE通过β-AR信号通路克服了基于PD-L1的检查点阻断抗性.

在肝癌患者中，β-Ars经常被下调，并与临床预后有关.

为了进一步证明β-Ars在肝癌的发展和进展中的作用并确认其临床相关性，我们从肿瘤基因组图谱中收集了β-Ars基因表达和存活数据公开的数据集，并研究了β-Ars表达(即ADB 1、ADB 2和ADB 3)与患者生存的关系。结果表明，HCC组织中ADB 1(补充图8A)和ADB 2(补充图8B)的表达较TCGA正常组织或癌旁组织明显降低。与HCC相似，ADB 1和ADB 2在乳腺癌(BARC)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD和READ)、肺癌(LUAD和LUSC)、补充图9 A、B等多种肿瘤中的表达也明显降低。有趣的是，ADB 3基因在大多数肿瘤及癌旁组织中的表达微乎其微，包括肝癌(补充图8C和补充图9C)。我们进一步使用Kaplan-Meier Plotter Web服务器，检测ADB 1、ADB 2和ADB 3表达水平与HCC患者预后的相关性。结果显示β-Ars表达与患者整体生存(补充图10A)和无进展生存(补充图10A)呈正相关。10b)。在小鼠正常应激诱导的β-ars表达和ccl 2表达降低的情况下，cdl 2的低表达与肝癌患者的整体生存状况密切相关，正如我们以前报道的那样。24.

讨论

在此，我们通过颠覆β-Ars/CCL 2介导的免疫抑制作用，建立了环境应激反应与肝癌发生和进展之间的因果关系。我们证明，与SE小鼠相比，生活在EE中的小鼠对致癌性肝癌和可移植的同基因肝癌有更好的保护作用，因为存在CD8。+T细胞依赖性肿瘤控制。环境胁迫激活外周SNS，中度升高血浆NE和EPI，增强配体和受体水平的β-Ars信号。β-Ars在肿瘤细胞和免疫细胞中的激活直接抑制了CCL 2的表达，导致免疫抑制性肿瘤微环境和对抗PD-L1治疗后检查点阻断难治性肿瘤反应的显著增强(如图1所示)。6L).

交感神经系统(SNS)通常与应激反应有关，包括窘迫和正常应激反应。在对sns、NE和epi的应激和激活的反应中，局部和系统地上调和刺激了β-ars，导致了对生物体有利和有害的影响，这取决于响应的持续时间和其他未知因素。13,30。研究表明，小剂量0.5和2mg/kg的EPI每日注射几天可抑制小鼠体内肿瘤的生长。肿瘤生长，模拟自愿运动的效果31。慢性β激动剂异丙肾上腺素每日10 mg/kg，促进肿瘤生长，损害抗肿瘤免疫。32。结果表明，0.5和2mg/kg的NE/EPI能抑制S.C。6mg/kg EPI或8mg/kg NE对小鼠肿瘤生长有促进作用(补充图5K、6I-J和7B)。同时，我们发现NE/EPI浓度与培养的肿瘤细胞、TAMS或MDSCs中CCL 2表达呈U型关系，即较低浓度的NE/EPI有助于降低CCL 2的表达，高浓度可逆转这种作用(补充图6e-I)。这些数据表明，EPI/NE的功能具有剂量特异性，值得进一步研究。许多研究还产生了β-AR活性与真性应激与危重之间的矛盾关系，证明了β-AR激活对危重诱发的促癌作用有一定的促进作用。33,34,35，在应激反应模型中具有保护肿瘤的作用。16,17,31。可能的机制可能包括β-Ars(E.C.)组织分布的不同模式.β1-AR、β2-AR和β3-AR)通过不同的生化途径传递信号，其功能在肿瘤生物学上具有上下文依赖和非线性的特点.

此外，人口研究显示，重度抑郁症似乎导致β-ars过度活化，而轻度抑郁则与β-ars激活不足有关。36,37,38提示β-Ars的适度激活在缓解危重方面可能是阳性的.在此，我们发现环境胁迫使血清和肿瘤微环境中NE和EPI水平适度升高。阻断NE和EPI受体β-Ars，阻断EE对肿瘤的保护作用.虽然还需要更多的研究，但这在一定程度上解释了β-Ars信号在一定程度上调控肿瘤生长过程中的悖论功能。值得注意的是，随着NE和EPI的中度升高，EE小鼠体内肿瘤微环境中β-Ars的表达显著增加。先前的研究还显示，EE增强了β-AR信号在配体和受体水平的慢性激活，以防止淀粉样蛋白-β引起的小胶质细胞炎症，并对阿尔茨海默病的特点提供了保护。39。在此基础上，我们发现β-Ars经常被下调，并与肝癌患者的不良预后有关。

我们已经报道过CCL 2的过度表达会影响肝癌的肝TAMs和MDSCs的聚集和免疫抑制特性。24。TAMS和MDSCs的亚群均能抑制CD8。+T细胞40,41。以往的研究表明，GMDSC和巨噬细胞的靶向治疗可以增强pd-1的免疫治疗效果。41,42。在本研究中，我们发现EE能降低血清CCL 2，下调肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞中CCL 2的表达，增加CD8的数量。+T细胞通过抑制TAMS和G-MDSCs的浸润.虽然还需要更多的研究，但越来越多的证据表明，免疫抑制性髓系细胞是连接应激和免疫反应的主要细胞类型。13,43。此外，有报道显示ccl 2会影响癌症的免疫治疗，其阻断可能对癌症治疗的结果有好处。44,45。在此我们发现，通过sns/β-ars信号通路，正常应激反应克服了pd-1的抵抗，并增加了肿瘤特异性CD8。+T细胞浸润和反应通过沉默CCL 2。