Necs共享dna可访问区域的共同景观。
在组织形态上，necs显示出共同转录调节因子激活可能导致的相似之处。11。为了探讨染色质可达性对确定necc表型的影响，我们采用转座酶可接近染色质高通量测序(atac-seq)和rna-seq(rna-seq)的方法，分析了在不同解剖部位产生的necs的表观遗传学景观，并将rna-seq(rna-seq)应用于nepc患者源性异种移植(Pdx)模型中。12、小细胞肺癌13，和MCC，以及GINEC临床样本(补充表)1)。因为NEC可以从先前存在的AD中出现，这是NEPC的典型。5偶尔也有小细胞肺癌6我们假设这些组织学是肿瘤进展谱的极端。为了通过atac-seq分析来确定去甲肾上腺素(NE)和非小细胞肺癌(AD)之间染色质状态的差异，我们还从转移性前列腺AD(Prad)PDX模型中生成数据，并使用癌症基因组图谱数据对原发性PRAD和非小细胞肺ADS进行分析。14。我们获得了高质量的数据，读取峰值分数在10-35范围内，峰值数在25-75k范围内(补充表)。1)。样品的复制图谱显示出高度的一致性(附图)。1A)。对ATAC-seq数据进行的非监督主成分分析(PCA)显示，NECS聚集在一起，表明了染色质的收敛状态，而ADS是由解剖位点分隔的(图)。1A)。为了检验这一结果，我们还分析了先前发表的atac-seq基因工程细胞的结果，这些细胞表达了一套明确的致癌驱动程序，将正常的前列腺基底细胞重新编程至NE状态。15。晚期NEPC工程细胞(“PARCB”，表达显性阴性TP 53、myrAkt 1、RB1-shRNA、c-MYC和BCL 2)的PCA图与临床NECS密切相关，说明了这些基因改变对染色质状态从基底上皮细胞向NEPC表型的重新编程的功能影响(补充图1B)。我们的数据集的ATAC-seq峰的样本-样本相关性也支持这样的结果，即NECS比来自同一组织的AD更相似(图1)。1B)。这些分析还将前列腺PDX和原发性人类肿瘤聚集在一起，从染色质的角度强调了前列腺LuCaP的价值。16PDX建立人前列腺癌模型，以前通过组织学和分子特征进行验证。16.
图1：Ne癌具有与其解剖来源无关的共同染色质状态。aNECS ATAC-seq数据的主成分分析(PCA)包括Merkel细胞癌(MCC)、神经内分泌前列腺癌(NEPC)、胃肠神经内分泌癌(GINE)和小细胞肺癌(SCLC)。图中还包括前列腺癌(PDX模型和TCGA原发组织)和肺腺癌(TCGA原发组织)。b不同肿瘤类型ATAC-seq信号成对Pearson相关的分层聚类。c典型ADS与NECS微分区域的热图表示。每一行都是一个峰值位置，每一列都是一个示例。上面显示的是AD站点(蓝色)和NE站点(绿色)的复合标记密度图。d利用二项法丰富基因本体17显示在附近具有NE特异性可达区域的基因中富集的通路。c. e以上结果来自于去甲肾上腺素特定可达区域的母题分析。f公共芯片-seq数据集显示最高的重叠与NE特定的可访问区域，由CistromeDB工具包确定的组织类型注释。根据每种类型的最高评分数据集对TFs进行排序。gNE标记物和bHLH TFs在我们研究的所有NEC样本中的表达显示为热图。源数据作为源数据文件提供。
为了研究与NE染色质状态有关的表观遗传驱动因素，我们对ADS和NECS之间的DNA可达性进行了监督分析，发现了一个较高的数目(n：16517)。P[医] < 0.001, log2(FC) > 2) of NE-specific accessible sites shared across all NE tumor types (Fig. 1C和补充图。1C)。基因工程的前列腺细胞中也有nec特异性染色质的特征。15(补充图。1D)，这表明在NE特定的可访问站点上有明显的信号增加，而在热图中的AD特定位置则显示出很少或没有信号(补充图)。1D)。我们还确定了离每个位点最近的基因，并将ATAC信号翻译成RNA-seq信号，发现我们可以在患者队列中区分去势耐药前列腺癌(CRPC)和NEPC(补充图)。1E)进一步验证我们的PDX模型中的签名。用注释工具的基因组区富集分析进一步研究了ADS和NECS在染色质组织上的主要差异。17将基因组区域与邻近基因联系起来，然后检查基因本体(GO)路径的富集。接近NE特异性DNA可达区的基因在神经分化、发育、形态学和轴突发生的通路上表现出明显的富集(图)。1D)。接下来，我们用了荷马18目的：研究去甲肾上腺素(NE)特异性位点富集TF DNA结合基序。这一分析表明，基本bHLH TF家族的基序显著丰富，特别是Atoh 1、ASCL 1和NEUROD 1，以及NFIB、SOX 2和NKX 2-1的基序(图2)。1E和补充表2)。Atoh 1曾被认为是MCC中的LTF。19,20，ASCL 1和NEUROD 1被认为在SCLC中起着相应的作用。10,21。NFIB是一种TF，它以前参与小细胞肺癌染色质结构的重组。22，而sox 2和nkx 2-1也被认为与SCLC有关。23,24。通过观察ATAC-seq峰中共同发生的基序，我们观察到主要三个基序(ASCL 1、Atoh 1和NEUROD 1)的模块经常与SOX 2或NFIB或两者同时出现(补充图1)。1E).
通过将去甲肾上腺素特异性位点与已发表的染色质免疫共沉淀序列(chip-seq)序列进行比较，在cistromeDB中编制了该序列。25，我们确定了其已发表的结合位点与NE特异性atac-seq峰的重叠程度最高的tfs，这是通过咯咯笑来量化的。26。与NECS之间观察到的共享表观遗传程序相一致，由SCLC、MCC或神经谱系生成的顶层重叠芯片-seq数据集(图1)。1F)。特别是ASCL 1(SCLC)、NEUROD 1(SCLC和髓母细胞瘤)和MAX(MCC)的结合谱。4与去甲肾上腺素特异性染色质重叠得分最高(见图)。1F)。接下来，我们分析了这些TFs和其他NEC相关因素在我们的研究样本中的表达情况。正如我们所预料的，我们观察到NE标记的表达有很强的共同性(SYP, CHGA，和INSM 1)和树干TFSOX 2(无花果)1g)整个NECS。我们还观察到bHLH TFs的一种相互排斥的表达模式，包括ASCL 1或NEUROD 1无论是NEPC还是SCLC，ASCL 1，和ASCL 2在GI-NECS和阿托赫1在MCC中的表达1g)。总之，我们的结果表明肿瘤和器官特异性bHLH TFs维持着共同的NE表观遗传状态.
根据ASCL 1和NEUROD 1的表达，可以对急诊NEPC进行细分。
为了探讨NEC表观遗传状态TF调控的异质性，我们对仅限于NECS的ATAC-seq数据进行了非监督分析。无论来源于何种组织，NECS均有表达。ASCL 1和/或ASCL 2紧密地聚集在一起，从表达NECS的细胞中分离出来。阿托赫1或NEUROD 1(补充图。2A)。此外，SCLC和NEPC在DNA可达性方面的相似性取决于ASCL 1或NEUROD 1在肿瘤类型上表达，但不表达(补充图)。2B)。前列腺标本DNA可达性的无监督分析(图一)。2A)显示与艾尔(所有ADPC)，ASCL 1，或NEUROD 1，通过对同一前列腺标本的RNA-seq数据的分析，可以看出同样的聚类现象(补充图)。2C)。虽然基于这些TFs表达的NE亚型在SCLC中已经被描述过。7,10在治疗中，这些亚型的存在是预料不到的，因为ASCL 1和NEUROD 1与肺NE细胞特别相关。8,9,27、新小细胞肺癌的起源细胞。
图2：NEPC根据转录因子ASCL 1和NEUROD 1的差异表达显示肿瘤亚型。aNEPC和ADPC PDX ATAC-seq数据的主成分分析。样本是由在该样本中表示的显性TF编码的颜色。b热图(红色)的左侧显示NEPC亚型之间的差异ATAC-seq区域。有12,751个NEUROD 1-特定区域(顶部)和8950个ASCL 1-特异性(底部)ATAC站点。热图的右侧显示ASCL 1(绿色)和NEUROD 1(蓝色)相同位置的芯片-seq数据。c差异ATAC位点与差异基因表达的关系。每个火山图都描绘了rna-seq对数2倍的变化(x-轴心)和p-由DESeq 2使用Wald‘s检验计算的多假设检验的调整值(y-轴)。每个点代表一个基因：绿色表示一个差异ATAC峰在基因的50 kB以内，橙色表示没有这样的峰。左：ASCL 1-特异性可及区和基因在ASCL 1亚型中上调；(右)NEUROD 1-特异性可及区和在NEUROD 1亚型中上调的基因。dASCL 1亚型(绿色)和NEUROD 1亚型(蓝色)富集基因的GSEA途径分析(**)q-数值<0.001，*q-数值<0.05)。eASCL 1亚型(TOP)和NEUROD 1亚型(底部)代表病例H3K27ac信号增强子的信号分布。每个图右下角的条形图识别了ROSE算法定义的增强子的子集；在LuCaP 93(ASCL 1)中识别出693个，在LuCaP 173.1(NEUROD 1)中识别出766个。所选基因附近的超级增强子由箭头指示。f有代表性的IGV在ASCL 1和NEUROD 1基因位点上跟踪。Atac-seq轨道为红色，ASCL 1芯片-seq为绿色，NEUROD 1芯片-seq为蓝色，H3K27ac为灰色。这些位点被亚型特异性超增强子标记，并与各自的TF优先结合。gASCL 1亚型(绿色)和NEUROD 1亚型(蓝色)的谱系转录因子电路。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们旨在确定与ASCL 1和NEUROD 1 NEPC亚型相关的差异DNA可达性。监督分析比较ASCL 1和NEUROD 1表达NEPC样品鉴定出8950个ASCL 1-和12,751个NEUROD 1特异性可及区(假发现率(FDR)<0.01，log 2(FC)>1)(图1)。2B)。接下来，我们询问了cdc中的nepc亚型特异性位点，并在这些tf特定的基因组区域观察到类似的染色质可达性模式，此外，这些区域还显示出染色质状态与tf基因差异表达之间的关联。ASCL 1和NEUROD 1(补充图。二维空间)。值得注意的是，那些共同表达ASCL 1和NEUROD 1显示两组区域的综合可达性(附图)。二维空间)。这一结果突出了肿瘤亚型染色质状态的显著相似性，无论是在SCLC还是NEPC中。值得注意的是，尽管与这些亚型相关的可达性有明显差异，但鉴于这两个亚型的NE特性，这两个亚型之间仍有大量开放染色质位点(36,493个)共享(补充图)。2E).
为了进一步研究这些亚型之间的染色质差异，我们研究了TF亚型特异性染色质可及性与ASCL 1和NEUROD 1基因组结合的关系。为此，我们对nepc模型中的每一个tf进行了芯片-seq分析。ASCL 1或NEUROD 1(补充表)3)。这一分析确定了数千个高度保守的结合位点，每一个都具有重叠和差异位点(补充图)。2E，f)。重要的是，尽管36,493个共享区域中的绝大部分都显示了两个TFs的重叠结合位点(补充图)。2E)，差异染色质可达位点由相应的TF结合，而不受另一个tf的约束(图1)。2B)。这一结果与ASCL 1和NEUROD 1在各自亚型中维持染色质状态的作用是一致的。接下来，我们在特定的ASCL 1或NEUROD 1结合位点进行了新的主题分析，这些位点分别产生了预期的ASCL 1和NEUROD 1的一致基序(补充图1)。2G)，验证两个TFs之间的根本差异。为了进一步研究这两个tf之间的差异，并找出潜在的合作因素，我们比较了在共享和差异ascl 1-和neurod 1-结合位点(补充数据)富集的基元。1)。共享结合位点的结果显示，在图中所有NECS共享的ATAC-seq位点的基序分析中发现的基本相同的基序富集。1E(补充表)2)。最丰富的bHLH基序包括NEUROD 1、Atoh 1和ASCL 1，以及NFIB基序，支持它们构成维持染色质状态的基本转录模块。ASCL 1特异性结合位点的结果显示NKX 2基序有很强的富集作用。如Nkx 2-1在ascl 1亚型中的高表达率约为16倍，并已被报道为在SCLC中对ascl 1亚型的特异表达。10，它很可能对这种浓缩负有责任。对于NEUROD 1位点，我们发现EBF和lhx基序富集，可能对应于神经源性TFs、EBF 3和LHX 8，在NEUROD 1亚型中表现出较高的表达。与CRPC相比，与CRPC相比，NEPC中激活的转录程序的改变支持了所有这些在ASCL 1或NEUROD 1上显示丰富基序的TFs与CRPC相比，全部在NEPC中表达。最后，我们注意到NFIB基序在TFs和共享TFs的差异位点上都被富集，这意味着这个因子被吸收到bHLH结合位点，而不考虑特定TF的表达。
接下来，我们试图通过使用从相同样本中生成的表达数据来确认ASCL 1和NEUROD 1亚型特有的增强子与附近基因的表达相关(图1)。2C)。正如预期的那样，差异表达分析表明，ASCL 1是ASCL 1组中最上调的基因之一，而NEUROD 1集则显示了几个神经性家族成员的上调，包括NEUROD 1/2/4/6(无花果)2C)。与这些差异可达区域的功能一致，我们观察到差异DNA可及性与差异基因表达之间的实质性关联(图)。2C)。基因集富集分析鉴定了这两种亚型中差异过度表达的通路，结果表明，ascl 1相关基因的表达在细胞因子的GO反应通路中富集。28而NEUROD 1相关表达在脑发育通路中富集(图1)。二维空间)。在ascl 1亚型中特异富集的是癌胚抗原相关的细胞粘附分子(CEACAM1，5，6，7)。有趣的是，CEACAM 5已经被研究使用一种抗CEACAM5-sn38抗体-药物结合物来靶向nepc。29。此外，ASCL 1亚型主要组织相容性复合体I相关基因(人类白细胞抗原基因)的表达相对较高，NLRC 5与NEUROD 1亚型相比，NEUROD 1亚型可能有助于ASCL 1相关免疫途径的富集。然而，与CRPC中的表达相比，这种表达仍然很低。因此，与其他NECS相似，NEPC的两种亚型均表现出相对较低的抗原表达途径。
ASCL 1和NEUROD 1 TFs与他们自己的启动子和附近的增强子的结合表明他们正在NEPC中作为LTFS工作。LTFS是已知的自动激活自己的表达，通过与超级促进剂(SE)结合，建立一个正反馈循环。此外，ltfs形成了由ess激活驱动的核心tfs电路，促进了维持谱系所需的转录程序。30。ASCL 1和NEUROD 1都是神经元系统中已知的谱系转录因子。31,32。为了研究这两种TFs在NEPC中的潜在LTF行为，我们用ASCL 1和NEUROD 1 NEPC的H3K27ac谱对SE进行了SE分析，发现所有模型在许多TFs中都表现出SE激活。INSM 1和NFIB)与肿瘤的亚型无关(如图所示)。2E，补充表3，以及补充数据2)。此外，我们还发现ASCL 1或NEUROD 1(及其他家庭成员)根据其表达状况。基于这些特征，ASCL 1和NEUROD 1都可以被认为是NEPC中的LTFS，并与SE结合并激活它们自己的表达(图1)。2C，f)。接下来，我们使用前面描述的方法确定了与这两种子类型相关联的tfs的核心电路，以识别相互关联的自动调节回路。30。我们在这两种亚型中识别了不同但高度重叠的TF电路集(图1)。2G).
综上所述，我们的结果为NEPC模型系统中两个分子亚型的存在提供了明确的证据。这些亚型具有NE表型特征，但在表达上存在差异。ASCL 1和NEUROD 1，这与不同的染色质景观和基因表达谱有关。
NEPC肝转移瘤异质性分析
接下来，我们的目的是确定模型系统的结果是否可以推广到人类临床NEPC。首先，我们询问了ASCL 1和NEUROD 1NEPC转移瘤的两组肿瘤组织中16,33。与我们在NEPC PDX中观察到的两个TFs的相互排斥表达形成对比(图1)。1g)，临床标本有多种共表达。这个ASCL 1在大多数转移癌中的表达较高，并伴有较低的和更多的可变表达。NEUROD 1几乎所有的案例(图一)。3A和补充图。3A)。TFs在临床NEPC标本中的差异表达与我们的分析中所发现的相应基因标记的富集有关，比较ASCL 1和NEUROD1NEPC模型(补充图)。3B).
图3：单细胞分析显示NEPC亚型在人的转移中共存，并与肿瘤的内部和内部异质性有关。a临床人群NEPC组织中ASCL 1和NEUROD 1表达谱的研究16。TPM：每百万份成绩单。bFLM 3有代表性的免疫染色(顶板ASCL 1染色，中间板NEUROD 1染色)表现为肿瘤内异质性。c同一区域的苏木精和伊红染色显示了这两个亚群体的不同组织结构。dFLM 3中scATAC-seq和snRNA-seq的联合分析(左)。特定于正常细胞群的标记可以分配簇：1，血管细胞；2，基质细胞；3，肝细胞；4，单核细胞。在ASCL 1和NEUROD 1之间的前30个差异ATAC-seq区域的可访问性(右上)。分析ASCL 1和NEUROD 1在snRNA-seq分析中的表达(右下角)。此分析将细胞与TF表达相匹配，并对每个亚型进行相应的差异DNA可达性分析。eTSNE分析联合FLM 3(蓝色)和FLM 5(黑色)scATAC-seq数据(左)。其他三幅图显示INSM 1启动子(NE标记)和ASCL 1启动子和NEUROD 1启动子。f在图中定义的PCA空间中，FLM 3和5(浅棕点)聚集的scATAC-seq簇的投影。2A。源数据作为源数据文件提供。
为了研究这些tfs是在同一肿瘤细胞中共同表达，还是在不同的肿瘤亚群体中共同表达，我们研究了从尸检中获得的五种不同的肝转移片段(Flms)，这些片段来自一位被诊断为最佳切割温度化合物(oct化合物)和福尔马林固定的石蜡包埋材料的nepc患者，并进行了rna-seq以评估其表达水平。ASCL 1和NEUROD 1。这些水平显示了两个tfs与flm 3的共同表达范围，而fm 3的相对表达量最高。NEUROD 1到ASCL 1(补充图。3C)。我们接下来对FLM 3上的ASCL 1和NEUROD 1蛋白表达进行免疫组织化学(IHC)分析。ASCL 1和NEUROD 1染色显示肿瘤内异质性，定义了两个分离的肿瘤群体，它们存在于不同的肿瘤区域(图1)。3B和补充图。三维空间)。这两个亚型均表现为NE表型，其特征是NE标记INSM 1的表达和AR表达的缺失(补充图)。3E)。与组织形态学特征的相关性表明，这两种不同的细胞群体在组织学特征上也有差异。ASCL 1阳性细胞呈片状生长模式，呈梭形细胞形态，NEUROD 1阳性细胞呈较小的细胞团状生长，有明显的核形态和局灶性多形性巨细胞。3C)。我们在FLM 3中用免疫荧光法(IF)对ASCL 1和NEUROD 1进行双重染色，以探讨肿瘤细胞中的潜在共表达，并观察到绝大多数细胞表现出两种TFs(附图)的反相关表达。3F)。我们将IF分析扩展到另外6个NEPC样本，并观察到存在相同类型的肿瘤内异质性，不存在ASCL 1和NEUROD 1的共同表达(补充图1)。第三代).
然后用单细胞染色质(scATAC-seq)和单核RNA序列分析(snRNA-seq)对两个肿瘤内群体进行观察。我们选择了表达最高的FLM 3和最低的FLM 5，几乎是iUROD 1表达量的200倍。ASCL 1(补充图。3C)。我们从FLM 3的冰冻切片中分离出细胞核，并进行scatac-seq和snRNA-seq来分配ASCL 1和NEUROD 1具有相应染色质状态的表达。Scatac-seq的无监督t-分布随机邻居嵌入(Tsne)聚类导致了多个聚类，我们在SOX 2启动子区分肿瘤细胞和正常细胞。基于对SOX 2肿瘤细胞的比例约为80%。根据去甲肾上腺素的表型，肿瘤细胞在去甲肾上腺素标记的启动子处表现出可达性。INSM 1(补充图。3H)。值得注意的是，我们可以根据与ASCL 1和NEUROD 1促进者(附图)3H)。ASCL 1和NEUROD 1簇还显示了通过批量分析确定的ATAC差异区域的差异可达性(补充图)。3I)。另一个群集由显示可访问性的单元格组成。ASCL 1或者NEUROD 1启动子但相互混合；我们将该簇标记为“混合”(补充图)。3H)。接下来，我们分析snrna-seq来确定表达的肿瘤细胞。ASCL 1和NEUROD 1，然后使用seurat将此数据集与scatac-seq集成。34(无花果)三维空间)。这种整合使得能够根据特定标记的表达来分配正常的细胞。重要的是，我们观察到具有ASCL 1或NEUROD 1可访问性特征的细胞优先表达相应的TF(图1)。三维空间)。因此，我们的结果表明，ASCL 1和NEUROD 1亚型作为独立的亚群体存在，具有与各自模型系统相似的表观遗传特征。
接下来，我们研究了FLM 5样本，它的最高表达量为ASCL 1通过scATAC-seq分析。根据rna-seq，tsne分析显示fm 5肿瘤细胞在ASCL 1启动者，但不在NEUROD 1(补充图。3J)。FLM 3和FLM 5的综合scATAC分析显示，99%的FLM 5肿瘤细胞与FLM 3 ASCL 1簇重叠。3E)，表明这些细胞具有相同的染色质可达性。接下来，我们在图中的模型系统定义的PCA空间中，从FLMS中绘制了TF簇聚集的scATAC-seq。2A进一步验证了两种亚型在原代组织中的染色质状态(图1)。3F).
这些结果显示了人NEPC转移瘤的亚型异质性，这些亚型表现出明显的表观遗传特征，与模型系统中观察到的相似。
在转移患者中，nepc亚型是不同的，但仍有相关的克隆。
接下来，我们利用atac-seq数据推断的全外显子序列(Wes)和拷贝数变异(Cnv)来研究nec样本的遗传特征。35。推论Rb1来自ATAC-seq数据的遗传状态显示，在所有的NEPC PDX模型中都有双等位基因丢失，而在腺样癌(ADPC)模型中则不是这样(补充图)。4A)如以前报告的那样12。对FLM 3和FLM 5的tSNE分析确定的scATAC-seq簇也采用了同样的方法。结果表明，这些簇的CNV总体上是相似的(如图所示)。4A)。例如，我们观察到在ASCL 1和NEUROD 1簇中，所有Chr 16以及ChR 2和Chr 13的部分杂合子丢失。此外，我们还发现了一个局部杂合子丢失PTEN在两个星系团中。然而，存在明显的CNV差异，包括chr14p上的20 MB扩增和仅存在于NEUROD 1簇中的chr7p扩增。值得注意的是，FLM 3中ASCL 1组分的CNVS与FLM 5中的ASCL 1簇几乎一致(Pearson‘s相关性=0.97)，而在同一片段中与NEUROD 1簇的相关性较低(Pearson’s相关性=0.81)。4B)。对FLM样本的WES分析，虽然来源于大量组织，但验证了scATAC-seq推断的CNV改变，包括对chr14p和chr7p的扩增(补充图)。4B).
图4：NEPC亚型为明显的无性系。a从FLM 3和FLM 5中的scATAC-seq簇推断出基因组范围的CNV谱。黑点是1MB区域中的值，红线是对数据运行分段算法的结果(参见“方法”)。箭头指向跨簇的CNV中所见的差异。b样本配对Pearson‘s相关的CNV剖面。c所有患者样本的scATAC-seq推断的CNV变化的热图摘要(蓝色代表损失，红色代表收益)。dFLM 3单细胞cnv分析的热图，其中每一列都是一个跨基因组的2mb垃圾箱，行是单个的细胞，它们被聚集在一起。K-手段。箭头指向在聚类分析中观察到的CNV差异。e将FLM 3、scATAC-seq数据按簇着色后的tSNE图，每个细胞通过推测的CNV改变进行分割。这三个簇明显对应于NEUROD 1(蓝色)、ASCL 1(绿色)和正常细胞(灰色)。源数据作为源数据文件提供。
最后，我们将FLM 3的cnv分析扩展到单细胞水平。35,36. K-根据CNVS对细胞进行聚类，可区分三组：一组与正常细胞相对应，无改变，另两组则显示有改变。另一组细胞在chr7p和chr14p中有扩增，并与NEUROD 1型和第三组细胞相关，而与ASCL 1型无关(图1)。4D)。接下来，我们在样本的scATAC-seqtSNE图中标记了在遗传分析中定义的三个聚类的细胞的同一性，并显示出与表观遗传分析定义的分组的强烈对应(图)。4E)。重要的是，这种单细胞分析加强了对scATAC-seq分析中确定的混合簇的解释，表明它对应于混合的ASCL 1和NEUROD 1克隆，而不是独立的克隆(补充图)。4C，d)。总之，我们的结果表明，在这位病人中存在着与两个NEPC表观遗传亚型相关联的不同的基因克隆，这些克隆很可能来自于一个共同的祖先，因为他们有大量的CNV图谱重叠。
