RCC血管内肿瘤扩展的空间分辨多区域取样和共登记整合基因组分析
我们前瞻性地纳入83例肾脏肿块患者，并计划接受手术切除。补充表1总结了该队列的临床病理特征。除1例肿瘤(平滑肌肉瘤)外均为RCCs(73例透明细胞，1例乳头状，1例嗜铬细胞，7例未分类)。1A，b)。我们对RCC、PT和TT进行了广泛的组织学分析。RCC是出了名的异质性。16,17，并展示了多种架构模式(图)。1C和补充图。1A，b).
图1：侵袭性血管内肾癌的特征。a1例肾透明细胞癌(CcRCC)和下腔静脉(IVC)血栓的MRI扫描。冠状位T1加权脂肪饱和造影剂增强病变梯度回声图像显示左肾大肿块(白色虚线)延伸到肾近端静脉(黑箭头)。肿瘤血栓延伸到IVC(黄色虚线)，其远端尖端(黄色箭头)位于膈肌上方，进入右心房(IV级)。一个巨大的异质性左肾上腺转移(绿色虚线)是存在的。b同一患者原发肿瘤(PT)和肿瘤血栓(TT)的宏观图像。c总结71例CCRCC血管内TT患者PT(内圆)和TT(外圆)内的结构模式(惰性(微囊)到侵略性(实片状))。dPT-TT配对样品分级微观分析的表征。e图示有侵袭性肿瘤标本的多区域取样，用于测序、PDX生成和组织学分析。PT原发瘤，TT-A相邻血栓，TT-M中血栓，TT-D远端血栓.fCcRCC患者突变、CNVS和临床参数综述。
71例患者PT和TT的综合镜检结果显示，PT较TT更具有异质性。50%的PTS(36/71)显示3-4种不同的建筑模式，而超过90%的TT(65/71)有1-2模式(附图)。1C)。PT中观察到懒惰型和攻击性型，而TT型则以侵略性型为主(图)。1C和补充图。1C；补充表。2).
然后我们将重点放在肿瘤的分级上，这是决定预后的关键因素。18。肿瘤分级主要基于核仁突出程度，从低级别(1级和2级)到高级别(3级和4级)。至于结构模式，肿瘤的分级因地区而异。在常规的临床实践中，肿瘤的整体分级是根据观察到的最高级别区域进行的.PT与TT肿瘤分级的对比分析显示肿瘤分级存在差异(附图)。1D)。出乎意料的是，TT并不总是被PT中最高等级的克隆所侵染。实际上，在3级和4级PT中，TT分别占45%和66%。1D)。这些数据表明TT并不总是被最具侵略性的克隆所播种。
我们收集了277个空间分辨配对PT和TT样本。样本是从宏观上不同的地区挑选出来的(如图所示)。1A，b)。我们利用TT提供的方向性。通常在原发肿瘤(TT)附近采集标本。A)，在远端前部(TT)D)和中间的某个地方(TT)M)(图1.1E)。还收集了几个PT样品。当可到达时，同样收集匹配的转移灶(M；Met)(n=6例)。
肿瘤样本被用于整合基因组分析并移植到小鼠体内以产生活的肿瘤模型(患者来源的异种移植[PDX]或肿瘤移植[TG]模型；图1)。1E)。为了准确地整合基因组和转录的发现，并进行组织学共登记，从组织学特征的单个样本中同时分离dna和rna，并立即从侧翼切片中分离出dna和rna。19。对78例患者的260例配对PT/TT和来自82例275例配对PT/TT的RNA-seq进行了全外显子测序(WES)分析。1E).
肾静脉附近的癌基因变异型RCC具有侵袭能力。
空间分辨TT样本的全外显子图谱与PT相比，在总的突变负担、驱动突变的数量或丰富程度或拷贝数变异(CNVS)方面没有显着性差异(图1)。1F和补充图。1E)。3p和8p损失次之，依次为5q增益、14q损失、7q增益和9p损失。1F).
在PT和TT之间，驱动基因的突变频率是相当相似的，并与其他报道相比较(补充图)。2B)。与PT相比，TT无躯体改变。大多数ccRCC驱动程序突变(VHL，PBRM 1，BAP 1，mTOR，p53，和(KDM5C)PT和TT共同存在。2C)。总的突变率(PT和TT)如下：VHL突变率分别为74.3%和65.9%；PBRM 1 (35.2%&23.7%); SETD 2 (14.3%&22.2%); BAP 1 (16.5%&20.0%); PTEN(8.8%及11.9%)；及CSMD 3(6.6%和10.4%)2A). VHL突变与PBRM 1 (28.5%&15.6%); BAP 1(9.9%及10.4%)；及SETD 2(6.6%及11.9%)1F)。正如我们早些时候报道的20,21, BAP 1和PBRM 1突变是相互排斥的(图)。1F).
图2：肾静脉附近地理空间的癌基因多样性RCC具有侵袭能力。a观察RCC、PT和TT基因的突变频率。CCRCC(左)和非ccRCC(右)。b血管内ccRCC TT标本中已定义驱动突变的组成。c在相匹配的PT和TT样本中观察到突变模式。d观察51例肾癌患者TT内克隆进化模式。e6例患者PT、TT和转移的克隆进化模式。观察到的转移位点被突出显示(红色名称对应于测序样本)。
在约65%的侵袭性TT中观察到已知的ccRCC驱动器突变。根据驱动程序的突变，tt可以被分类为PBRM 1突变型(22%)；BAP 1突变型(20.6%)；SETD 2突变型(13.2%)；PBRM 1-SETD 2突变体(7.4%)；BAP 1-SETD 2突变体(1.5%)。2B).
非ccRCC PT和TT(1个发色团RCC、1个乳头状RCC、7个未分类RCC和1个平滑肌肉瘤)在躯体改变和驱动突变方面也有相似之处(附图)。二维空间)。7p增益观察到大多数非ccRCC(补充图)。1E). TP 5340%(4/10)和SETD 220%(2/10)的非CCRCCTT(补充图)突变。2E). ARID1A在2/3的非ccrcc患者中，突变对TT是私有的，而一个非ccrcc患者也是如此TSC 2突变(附图)2F).
为了评估TT的进化，我们使用332个定义的驱动突变生成了系统发育。相匹配的PT和TT的比较分析揭示了四种不同的克隆进化模式(图)。2C)。超过50%的案件(n在PT和TT中观察到不同的驱动突变，提示不同的或独立的进化(图1)。2C)。在PT和侵袭性TT中，驱动器私有突变也分别占10%和27%。在8%的病例中，PT和TT具有相同的突变谱，表明它们共同进化或克隆扩张。有2个或2个以上TT样本的肿瘤详细分析(n=51名病人)在92%的TT病例中发现了额外的驱动突变(n=47)。分支异源进化率为45%。n=23)的案件。35%(n当观察到20%的线性非均匀演化时(n=10)(图1。二维空间).
这些研究通过对6例患者(来自3例ccRCC和3例非ccRCC患者的29例多区域标本)的转移进行了进一步的分析。TT与转移标本在突变频率或驱动突变数上无显着性差异(P>0.05)。在2例ccRCC患者(XP 534和XP 1137)中，转移瘤具有与TT相似的突变特征，提示肿瘤细胞弥散是通过血管内扩张(图1)。2E)。1例有淋巴结转移的ccRCC患者出现线性演变。非同步转移的非ccRCC患者的驱动系统发育显示转移与PT之间总体上有更大的相似性，提示TT的早期传播和不同的进化。2E).
这些观察表明，具有不同癌基因状态的PT，无论与疾病侵袭性有无关联，均可作为TT侵入和扩展。虽然TT进化并获得了额外的突变，但我们发现PT的总体体细胞突变状态与血管的侵袭和生长没有关联。
由早期基因驱动的入侵代表了一种可逆的适应性反应。
为了确定与侵袭相关的基因程序，我们分析了侵袭性TT的转录谱。3A)。我们发现了一组在TT和PT之间差异表达的转录因子。p-数值<0.05，FDRq<0.2)。大多数是即时早期基因(IEGS)，包括编码AP-1复合物成分的基因(FosB，FOS，和俊B)以及Egr1，EGR 3，IER 2，ATF 3，和NR4A2(无花果)3B)。这些基因表达为对外界信号的适应性反应，并在胶质瘤和前列腺肿瘤中表达(附图)。3A)。此外，Motif富集分析显示，TT中含有AP-1和EGR转录因子结合位点的基因明显富集。3C).
图3：由早期基因驱动的入侵代表了一种可逆的适应性反应。a插图突出显示配对PT和TT样本用于转录分析。b从生物学独立的PT中差异表达转录因子n=114)和TT(n161例患者肿瘤标本。数据以散点图的形式表示，平均为直线。双面未配对学生t测试一下。c, dMotif富集(c)和信号通路(d)基于侵袭性TT的转录数据。标称p-GSEA分析值<0.05(棕色)；<0.01(红色)。eQRT-PCR结果显示在ccRCC细胞株中有早期反应基因的表达。n=4个生物独立样本)。数据以平均值±SD表示。Westernblot显示pP-CREB在ccRCC细胞株(INSET)中的表达。源数据作为源数据文件提供。fAP-1抑制剂T-5224存在下786个ccRCC细胞的划痕愈合试验n=4个生物独立样本)。数据为平均值±扫描电镜。双尾曼-惠特尼U-测试。g热图显示PT、TT和转移瘤(M)基因表达的变化。
转化生长因子-β反应的EMT决定基因Prrx 1在侵袭性TT中过度表达。3B)。Prrx 1与EMT促进转录因子Twist 1共同驱动细胞的侵袭和传播。22,23,24,25。此外，Prrx 1的高表达与肾癌患者的低生存率有关。相反，FosB和Egr1高表达是有利的(补充图)。3B-d)。TT中差异表达基因的途径富集分析显示AP1和TGF-β驱动的应答基因如RUNX(AP-1相互作用TF)和Smad 2/3(图2)均有富集。三维空间；补充图。3E；及补充资料档案。1)。这些差异表达的基因在TGS中也得到了丰富，这些基因可从8例患者、8例PT移植和9例TT移植中获得(补充图)。4A).
AP1和EGR转录因子驱动的细胞可塑性依赖于cAMP反应元件结合蛋白(CREB)。26。为了检测CREB活性的增加是否与IEGS的表达增强和侵袭有关，我们检测了pCREB在ccRCC细胞中的表达水平。与A 498和UMRC-2细胞相比，Caki-1细胞的pCREB活性最低，而769-P细胞和786-O细胞的pCREB活性较低。3E)。IEGS的表达与pCREB在这些细胞中的表达密切相关(图1)。3E；原始数据文件。1)。T-5224对c-Fos/AP-1细胞的药理抑制作用减少了ccRCC细胞的迁移，但对细胞增殖无影响(图1)。3F和补充图。4B-d)27,28。AP1转录因子JunB的siRNA敲除也观察到类似的结果。4E-I).
仔细观察TT中差异表达的基因，可以发现几个关键因素。克虏伯类因子2(KLF2)和-珠蛋白基因(HBB和HBA 2)在TT中被过度表达，这是在流体剪切应力和维持细胞氧化还原过程中诱导的。29,30。同样，表示CXCL 2一种与迁移有关的细胞因子，以及THBD对凝血有干扰作用，TT(补充图)增加。4J).
随着血管内肿瘤细胞向远端器官外渗和定植，IEG驱动的适应性反应可能会减弱。我们通过评估IEGS在转移灶中的表达来验证这一概念。相对于血管内生长，转移灶中IEGS的表达明显逆转(M)。转移瘤中富集的血栓素和凝血阻断因子的表达也明显减弱(图二)。第三代)。接下来，我们检查了匹配的TT和M样本的转录谱。EMT和TGF-b信号在转移样本中按预期丰富，而代谢基因集在TT中比匹配的M克隆丰富(补充图)。5A，b).
综上所述，这些数据表明CREB/AP-1在TT细胞迁移过程中的IEG表达是对血管中流体剪切应力的可逆适应性反应。
转移能力决定因素的识别
为了阐明侵袭能力与转移能力之间的关系，接下来我们对转移性TT患者和未转移者进行了对比分析。在3年的中位随访中，~50%的患者在我们的队列中(n41例发生转移(图1)。4A，补充图。6A；及补充表。1)。转移患者(TT)M23例同时发生转移，18例发生元时性转移。转移主要累及肺部，其次是骨和肝脏(图一)。4A)，这是RCC的特点。42例TT患者未发生转移(TT)。NM)。Kaplan-Meier分析也显示了这两个群体的显着性差异，表明总体生存率有很大差异(HR 4.29；95%CI：1.24-14.82；p=0.01)(附图。6B)。我们系统地研究了TT的临床病理特征、突变、dna拷贝数改变和基因表达。M和TTNM队列。然而，TT之间的体细胞变化没有显著差异。M和TTNM(补充图。6C).
图4：肿瘤血栓分级预测转移结果。a本组RCC患者TT的转移部位。b组织结构模式适用于TT。cTT分级分布M与TT相比NM. d3级PT患者无转移生存率按TT分级分类。Kaplan-Meier(原木等级)测试e图示强调高TT级RCC患者的高转移率。
从临床病理的角度，我们评价了肿瘤大小、病灶、手术边缘、分期、肿瘤分级、肉瘤样分化、肿瘤坏死、浸润肾实质(非血管内)和淋巴结受累等因素对肿瘤的影响。这些分析揭示了TT之间的联系。M随着分期，肿瘤分级，肉瘤样分化，肿瘤坏死，肾实质浸润和淋巴结受累(补充表)。3)。此外，具有侵略性的组织结构模式也在TT中得到丰富。M相对于TTNM(无花果)4B)和转移来自配对的ccRCC患者(补充图。6d).
为了确定最关键的变量，我们用转移时间进行了多变量Cox比例风险分析。不出所料，这些分析表明，分期，肉瘤样分化和淋巴结转移是独立的预测时间的转移。然而，挑衅性的是，TT的分级而不是整体的肿瘤分级也是预测的。此外，由危险比决定的TT等级是最强的预测因素(HR，6.42；p=0.003)。我们观察到TT有较高的肿瘤分级。M相对于TTNM(无花果)4C)。研究对象为3级PT患者，占52.1%。在这些患者中，20例TT为3级，17例TT为2级。有趣的是，尽管PT评分同样高，但低级别TT患者的无转移生存率明显优于3级TT患者(图1)。4D).
扩展了我们先前观察到的最具攻击性的、级别最高的克隆并不总是会导致TT，这些数据表明，克隆播种的级别TT比整体肿瘤级别更重要的决定转移能力的因素(图1)。4E).
炎性免疫背景与转移能力的关系
接下来，我们比较了TT的转录谱。M和TTNM。我们鉴定了70个基因在TT中过表达，61个在TT中低表达M相对于TTNM(无花果)5A)。这些研究得到了公共数据集研究的补充，在这些数据集中，我们假设基因在TT中被上调。M会导致预后不良。这是在不同的肾癌数据集中的情况，包括nccRCC的组织学，以及其他肿瘤类型(如图所示)。5A和补充图。7a，b).
图5：与转移性肿瘤血栓有关的基质成分。aTT差异表达基因NM和TTM基于人类蛋白质图谱的预测能力。b内皮标记物ERG在TT中的定量及代表性免疫组化图像NM和TTM各款(n=20例，36例)。c巨噬细胞标记CD 163在TT中的定量及免疫组化表现NM和TTM各款(n=20例，36例)。数据以散点图和线的形式显示在平均值±sem；双尾Mann-Whitney。U-测试(b, c). d基于四IFSEQ反褶积方法的计时器分析揭示了生物独立TT中基质成分的差异NM (n=78)和TTM (n82例患者(肿瘤标本)。双面未配对学生t测试一下。
TT基因本体论分析M基因鉴定白细胞稳态和抑制血管生成(补充图。7C)。基因集富集分析显示TT中炎症和mTOR信号增加。M(补充图。7D)。总体而言，TT患者血管生成相关基因表达减弱，趋化因子/细胞因子表达增加。M(补充图。7E).
我们用免疫组织化学方法(IHC)对TT侧翼切片的观察结果进行了验证。M和TTNM用于基因表达分析的样本。ERG染色显示，TT中内皮细胞减少。M相对于TTNM(无花果)5B)。促肿瘤M2巨噬细胞(CD 163)显著增加+)在TT的侧翼部分被观察到。M(无花果)5C)。相反，PD-L1染色无显着性差异(附图)。7F).
进一步研究TT间基质成分的差异M和TTNM，我们部署了RCC肿瘤微环境(ETME)的经验衍生基因标记。31。为了支持我们的发现，ETME分析显示TT中巨噬细胞的富集和内皮细胞标记物的减少。M(补充图。7g)。TT中单核细胞和调节性T细胞富集，NK细胞标记物减少。M。QuanTISEQ、EPIC、MCPCOUNTER和肿瘤免疫评估资源(Timer)也进行了类似的观察。32,33(无花果)5D和补充图。7H-j)。巨噬细胞和树突状细胞相关基因列示(补充图)。7k-m)。我们指的是我们在图中的发现。4DTT分级越高，转移效果越好。同样，TT 3/4年级的炎症和免疫特征高于TT 2级。类似于我们对TT的观察。MTT 3~4级肿瘤因炎症和免疫征象而富集，并剥夺与血管生成相关的基因集(附图)。8a，b).
增强的mTORC 1信号决定转移潜能
进一步评估mTOR(指mTOR复合物1或mTORC 1)是否在TT之间被差异激活。M和TTNM进行免疫组织化学分析。P-S6是mTORC 1活性的一个广泛应用的标记物，在TT中显著升高。M(与TT相比)NM)。高等级TT组的P-S6也高于低级别TT组(图1)。6A和补充图。9A)。与PT和M(补充图)相比，TT中的mTOR基因信号也丰富。9B，c为了评估mTOR激活的功能后果，我们检测了mTORC 1抑制在PDX模型中的作用。PDX模型是从5个TT生成的。M9例转移瘤(XP 373和XP 453)。荷瘤小鼠(n3-5)给予司罗莫司，一种代谢物mTORC 1抑制剂，并监测肿瘤的进展与车辆对照(n=3-5)(图3。6B)。13/14 PDX对西罗莫司敏感，中位抑瘤率为80.5%。6C和补充图。9d，e).
图6：mTOR信号在转移性肿瘤血栓中被诱导。aTT中磷S6的定量(左)和有代表性的免疫组化图像(右)NM和TTM (n=65例，81例)。数据以散点图和线的平均值±扫描电镜表示。双面未配对学生t测试一下。b抑制肾癌患者源性异种移植(PDX)mTOR的示意图高亮实验方案。cMTOR抑制剂西罗莫司对TT和转移性PDX细胞系的肿瘤生长抑制率(每只PDX 3~5只小鼠)。d实验转移实验中抑制mTOR的实验方案。e, f用心内注射荧光素酶介导的786-OccRCC细胞，用全身生物发光成像(BLI：总光子通量(p/s))追踪小鼠体内转移情况。图中显示了BLI的量化和具有代表性的全身图像(e)。器官转移负荷的体外显像定量研究(英文)f). n=4只小鼠，每组4只。数据以平均值±SD表示。双尾曼-惠特尼U-测试。
接下来，我们评估了mTOR抑制对转移的影响。6d)。在这些实验中，小鼠心内注射GFP-荧光素酶介导的786-OccRCC细胞，以监测转移的定植.注射后，将小鼠随机分为两组，分别用西罗莫司类似物(西罗莫司类似物)治疗。用生物发光成像技术追踪转移率。我们观察到mTOR抑制剂处理的小鼠体内总光子通量显著下降(图一)。6E)。注射后5周，小鼠被安乐死。活体成像和切片荧光素酶染色显示肝、肺和骨转移的发生率明显降低(图一)。6f和补充图。9F-I)。总之，这些数据表明，靶向抑制mTOR信号在癌细胞中阻碍肿瘤的进展和转移爆发。
