PDAC细胞器构成恶性导管细胞 为了对人PDAC进行体外研究，我们从手术标本中提取了24株肿瘤细胞株。从单个患者的原发肿瘤中提取18份标本。在一例中，从同一原发肿瘤内的两个胰腺部位分离出不同的细胞器系，提供生物复制(p 080和p 081)；在另一种情况下，通过分析不同传代数的一个器官系(p 039和p 039b)，获得一个技术复制。我们还从1例患者(p 083，p 084和p 085)和两例不匹配的转移瘤(补充表)中提取了两种不同的肝转移瘤(p 083，p 084和p 085)。1 还有无花果。 1A，b )。根据组织学评价，所有肿瘤均为PDAC。根据moffitt等人定义的亚型，将患者源性PDAC细胞器以及9例活检标本按rna序列分为基底型和经典型。 14 在每种情况下，PDAC细胞器亚型与活检样本亚型(“方法”和补充表)相对应。 1 ).
图1：患者源性PDAC器官的肿瘤间异质性。 a 实验工作流程的原理图。 b 培养10天后4例PDAC细胞器样线的图像。标尺，100米。 c UMAP对18例患者的24份scRNA-seq标本进行了UMAP包埋，结果表明：p039是p 039b的技术复制；p 080是p 081的生物复制；p 084和p 085来自与p 083相匹配的肝转移瘤。 d 热图显示每名病人20个差异表达基因的表达情况。 e 所选择的特定于患者的基因的表达，使用与 c ). f 每例患者20个差异表达基因的基因组分析。BAR图显示了所指示的基因组的比例(蓝色)，以及来自每个基因组(绿色)的独特基因的数量。 g 所有患者特定基因的表达。
所有24个肿瘤细胞器系的单细胞RNA序列在质量控制后共获得93,096个细胞的转录信息，中位数为3,877个细胞，每个细胞检测到的基因中位数为4,162个(“方法”和补充图)。 1A
为了确定PDAC类细胞器细胞的类型，我们将PDAC类细胞器中的单细胞转录序列与原代PDAC的最新数据进行了比较。 19 。在所有患者中，PDAC细胞器细胞通过相互的主成分分析和特征基因的表达被一致地确定为恶性导管细胞(补充图)。 1B )，与以前观察到的体外培养条件促进导管细胞生长的结果一致。 21
PDAC细胞器显示患者特异性基因表达 PDAC的特点是少数反复的基因改变发生在高频率，因此不能充分解释患者之间在疾病进展和治疗反应方面的差异。 9 。为了在转录水平上研究PDAC细胞器的特征，我们构建了所有细胞的共享最近邻(SNN)图，发现来自同一患者的细胞聚集在一起(图1)。 1C 24 (补充图。 1C
为了进一步研究PDAC肿瘤之间转录异质性的来源，我们确定了与其他肿瘤相比，每例原发性肿瘤细胞的细胞器模型中差异表达的基因。而在每个PDAC细胞器中，最高度上调的基因的表达往往是病人特异性的(图一)。 1D，e 和补充表 2 )我们观察到，这些基因中有许多属于相同的基因家族。对每名患者前20位富集基因的基因家族成员(不包括由特定分子结构域定义的基因家族)的分析表明，最具代表性的基因家族包括细胞表面和跨膜蛋白(CD分子、claudins和溶质载体)、与细胞外基质相互作用的分泌蛋白(粘蛋白、激肽)、代谢一系列底物的酶和潜在的药物靶点(血清蛋白酶、Aldo-keto还原酶)和-I型角蛋白(Fig)。 1F )。在检测到这些基因的PDAC类细胞器中，它们经常在很大比例的细胞中表达，但在其他品系中的表达非常低或为零(见图)。 1g )。由于我们之前发现的许多基因家族都被认为是PDAC患者肿瘤特征和/或预后的指标。 25 ,26 ,27 ,28 ,29 ,30 这些结果对PDAC中的生物标志物识别具有重要意义，强调需要分析足够多的患者群体的样本，以克服患者之间的转录异质性。
亚型异质性与预后不良相关 PDAC通常分为“经典”和“基类”转录亚型，后者预后较差。 14 。大体积rna-seq的PDAC细胞器从我们的队列分组的细胞器系分为基类，古典，和中间亚型(补充表)。 1 )。为了在单细胞水平上阐明亚型，所有患者来源的细胞器细胞都被打分以表达已发表的亚型标记，每个亚型包含25个基因。 14 。总体上，子类型注释与批量结果有很好的相关性(补充表) 3 )。对于大多数患者来源的细胞器，在基于PCA的细胞聚类后，亚型特征评分在细胞簇之间是一致的，并反映了由大量rna-seq确定的亚型(见图)。 2A )。相反，我们发现了一组含有“基底样”和“经典”细胞的患者源性细胞器(图1)。 2B )，并有相应的标记基因表达。 2C )。值得注意的是，在组织病理学评估中，显示异质亚型特征的PDAC细胞器被归类为WHO 3或4级肿瘤，而具有同质亚型特征的PDAC细胞器被归类为2或3级(图2或3)。 二维空间 )。此外，在我们的队列中，同质的经典PDAC患者总生存期往往更长，而基底样肿瘤的结局往往是最糟糕的(补充图)。 1D )。因此，PDAC细胞器系中“经典”亚型标记基因的同源富集与分化程度较高的肿瘤相关，且预后较好。
图2：PDAC亚型签名的表示。 a 热图显示Moffitt亚型标志基因在所有患者个体簇中的表达。b Moffitt亚型评分在PDAC细胞器细胞中的分布，显示两个均匀(顶部)和两个异质(底部)样本。蓝色表示经典的亚型分数，红色基类(“方法”)。 c 顶部：在P 100中发现了8种不同的细胞簇。底部：基类(顶)和经典(下)亚型跨簇的特征基因的表达，显示出在第8组中，经典基因的表达明显高于其他类型，而基类基因的表达较低。 d 原发肿瘤病理组织学分级为2级、3级或4级的均一性和异质性器官的比例。
功能细胞状态是在病人之间共享的。 为了识别肿瘤间共有的细胞状态，我们对18个原代PDAC类细胞器转录序列(“方法”)进行了基于PCA的相互整合。细胞的聚集显示了九种功能细胞状态，这些状态在不同的病人之间是保守的(图一)。 3A 和补充图。 2A
图3：PDAC患者共有的功能细胞状态。 a 在18个原代PDAC细胞器系的PDAC转录序列基于PCA的整合后，UMAP表示在患者之间共享的簇。 b 基因本体论(GO)术语富集分析使用前100个上调基因的聚类。灰色盒子表明没有明显的富集。 c 根据S期和G2/M期基因的表达计算的每个细胞的细胞周期分数，使用与以下相同的UMAP表示来可视化。 a ). d 特征基因在PDAC原代细胞器系的所有细胞中的表达，用与以下相同的UMAP表示方式可视化 a ). e 热图显示每个基因簇的平均表达量，这些基因在cxc-1和IFN-1簇中特别丰富，并记录在String数据库中。 55 f 表示基因相互作用的网络( e ). g KRT 19的RNA荧光原位杂交(FISH)染色显示PDAC细胞(洋红色)、TFF 3、MKI 67或S100A2(绿色)在p 027和P 100的原发部位。细胞核用DAPI(蓝色)染色。鱼鳞条，50 m.FISH染色在个别切片上重复两次，结果相似。h RNA鱼类染色的定量显示PDAC细胞(KRT 19染色鉴定)中每个转录本的每个核信号密度，并与样本p 027中的密度标准化(p 027： n =339个MKI 67和TFF 3核，369个S100A2核；P 100： n =176核为MKI 67和TFF 3,306核为S100A2；每个核分别来自三幅不同的图像，误差条显示平均标准误差)。
我们通过差异表达分析来评估每个聚类的特征(如图所示)。 3B 和补充表 4 )。五个簇代表细胞通过不同的细胞周期期(标记为Cyclt-1到Cycle-5)。两组细胞没有循环细胞(标记为非环-1和非循环-2)，但由表达细胞周期素依赖性激酶抑制剂1(补充图1)组成。 3A )。这些群集显示，与分泌、消化、细胞粘附和运动有关的基因表达增加。虽然免疫应答信号在非循环簇中普遍被上调，但另一个簇(标记为IFN-1)显示了与I型干扰素信号有关的特定基因的表达。对于表达cxc基序配体的细胞来说，最小的簇(标记为cxc-1)被富集，例如 CXCL 1 , CXCL 2， 和 CXCL 8 ，它们被认为能刺激癌细胞的增殖和迁移。 31 ,32 ,33 。细胞群IFN-1和CXC-1均由循环细胞和静止细胞组成(附图)。 3B )。值得注意的是，循环组和非循环组含有所有患者样本中的细胞，但只有5名患者(p 006、p 018、p 027、p 047和p 089)至少有1%的样本细胞参与了IFN-1，只有2名患者(p 064和p 100)对cxc-1(补充表1)有类似的贡献。 5 )。RNA原位杂交证实了IFN-1和CXC-1在患者来源的培养和原发肿瘤中的差异表达(补充图)。 2B
因此，我们得出结论，所有患者源性PDAC细胞器都含有循环细胞，我们将这些细胞分解成不同的细胞周期(图一)。 3C )，和分化细胞的功能特征，使人联想到他们的胰腺起源(图。 三维空间 )。此外，一部分患者还携带细胞簇，细胞因子的特定表达被认为通过自分泌和旁分泌机制促进肿瘤的进展(见图)。 3E，f
KRT 19(肿瘤PDAC细胞标记物)、TFF 3(分泌细胞和经典PDAC亚型标记物)、S100A2(基底型PDAC亚型标记物)和MKI 67(增殖标志)的RNA原位杂交显示，TFF 3在典型亚型中表达较高，在基底型亚型(Fig)中S100A2表达较高。 3G，h )，证实PDAC细胞器能反映原发肿瘤。
PDAC类有机物的分化层次 在观察到PDAC细胞器系间共享的簇群中含有循环细胞的基础上，我们试图确定PDAC细胞器细胞的分化轨迹。应用最近的RNA速度概念 34 ，我们测定了基因表达随时间的变化，根据每个样本中未剪接和剪接的mRNA的相对丰度来估计(见图)。 4A )。通过马尔可夫链追踪，我们确定了分化轨迹的可能起点和端点。 4B )。在所有患者中，轨迹起始点与循环星系团重合，大多数轨迹作为细胞起源群体聚集在细胞周期-4上(如图所示)。 4B，c )。轨迹端点，另一方面，主要位于遥远的星系团非循环-2(图2)。 4B，c
图4：PDAC细胞在体外和体内的分化层次。 a RNA速度轨迹显示p 039，使用相同的UMAP表示，如图所示。 3A b P 039显示的起始点(顶部)和端点(底部)概率。 c 在所有PDAC类样本(行)中，每个集群(列)内的平均起始点(红色)和端点(蓝色)概率之间的差异。 d PDAC亚型在单细胞中沿谱系轨迹的分布。颜色表示细胞是否表现出“经典”(蓝色)或“基底样”(红色)亚型标记基因的高表达。 e PDAC亚型评分与第一主成分中细胞嵌入的相关性，将循环细胞(PC1中的负值)与分化细胞(PC1中的阳性值)区分开来。 f 将所有细胞投射到PC1、PC2和PC3的线性组合上，以显示循环和分化细胞(顶上)。在轨迹分岔点周围的四个簇中的细胞用最小生成树(底部)连接。 g 沿着分支分支动态变化的基因表达(红色：高，蓝色：低)，基因表达的层次聚类显示在左侧。列注释表示沿着分支的位置。
值得注意的是，当我们将细胞的Moffitt亚型同一性与其沿谱系轨迹的位置联系起来时，我们发现与循环细胞相比，分化后的分泌细胞中的“经典”基因特征更加丰富。 4D，e
由于我们的体外器官模型是丰富的祖细胞样细胞相比，原发肿瘤样本(补充图)。 1B 在我们的数据中，不同的细胞周期可以被分解，并且我们在G1期发现了一个分叉点，在这个分岔点上，细胞要么重新进入细胞周期，要么向分泌状态分化(如图所示)。 4F )。为了进一步研究PDAC类细胞器细胞的命运行为，我们计算了一个最小生成树，它连接着所有细胞-1、循环-5、非循环-1和非循环-2，并在分叉路径上给每个细胞分配了一个伪时间值。除了无处不在的细胞周期相关基因外，这种方法还可以识别细胞命运的潜在驱动因素；例如， GGCT (γ-谷氨酰环转移酶)和 RANBP 1 结合蛋白1(ran-bindingprotein 1)在分叉点后不久在细胞重新进入细胞周期中表达增加，而细胞粘附基因表达增加。 CEACAM 6 和 S100A6 钙结合蛋白编码在分化细胞中被上调(如图所示)。 4G
因此，我们得出结论，PDAC细胞器的生长是由大量循环细胞推动的，这些细胞维持着具有分泌功能的分化后代群体。值得注意的是，这一功能层次是保存在PDAC器官从我们的队列中的所有病人，以及在scRNA-seq数据从第一PDAC(补充图)。 2C
肝转移重建原发肿瘤的各个方面 PDAC常被诊断为转移，只有10例−20%的患者有可能接受治疗性手术。 35 。虽然大多数晚期PDAC患者接受姑息性化疗，但新辅助化疗的益处是目前争论的话题。 36 ,37 。最近一项关于治疗性pdac肿瘤和转移灶的全基因组测序研究发现，原发肿瘤和所有匹配的转移瘤中都存在相同的驱动基因突变。 12 激发了人们的希望，即靶向治疗可以同时消除多个位点的基因同源细胞，从而为晚期PDAC提供临床益处。
在此，我们从两个肝转移瘤(M1和M2)和同一患者的原发肿瘤(P)中提取PDAC细胞器系，在转录水平上讨论了转移性PDAC的细胞异质性问题。在将三个样本的单细胞转录组数据进行倒数PCA合并后，我们在三个PDAC细胞器系中识别出五个具有差异表达的细胞簇(见图)。 5A )。所有样本都包含循环细胞，如下所示 MKI 67 表达式(图1. 5B )。PDAC的其他功能方面，包括分泌(例如， FABP 1 , SCG 5 )，消化酶(例如， PRSS 1 , PGC 细胞骨架或细胞粘附基因(例如， ANXA 6，TUBB2B ，和 CEACAM 6 )、MHC复杂成员(例如， CD 74 , Hla-DQB 1 ，和 HLA-DRB 1 )和假定的炎症抑制基因(例如， (TMEM176A，TMEM176B) 38 ，在簇间有异种表达(图1)。 5C )。例如，对分泌和消化相关基因富集的第2簇在P和M2中检测到，而在M1中则没有。
图5：肝转移瘤的功能亚型和转录亚型异质性。 a 其中1例来源于原发肿瘤(P)和2例肝转移瘤(M1和M2)。所示的是由相互PCA整合的转录序列的umap表示，通过无监督聚类来识别共享的和细胞器系特异性的细胞簇。单元格由样本来源(左)和簇成员资格(右)着色。 b 细胞周期相关基因的表达 MKI 67 )、分泌和消化( FABP 1 , PRSS 1， 和 PGC )，以及免疫调节( CD 70 , TMEM 176B )跨越P、M1和M2类细胞器的细胞。 c 每组前10位富集基因的表达。 d Moffitt亚型从大量rna-seq数据(左)和单细胞rna-seq数据(右)中获得P、M1和M2类细胞器的评分。蓝色表示经典的亚型分数，红色基类(“方法”)。单元格根据( a )在小提琴的情节里。 e M_1和M_2转录子投射到原PDAC细胞器数据上(见图)。 4F 和“方法”)显示细胞在循环和分化簇之间的分布。
大量的rna-seq表明，这两种转移来源的细胞器系都比原发于肿瘤的细胞器系表现出更多的‘基底样’基因表达(补充表)。 1 )，与早期观察转移组织中“基底样”表型富集的结果一致。 14 。相反，在单细胞水平上，我们发现转录亚型异质性，即使在单个转移来源的细胞器系内，M2中的一部分细胞表现出更多的‘经典’基因表达，而不是来自原发肿瘤的细胞子集(图)。 5D
通过将两个转移来源的细胞器系的scRNA-seq数据投射到所有原代PDAC类细胞器转录体的PCA上，我们进一步观察到分化细胞(团簇‘non-cyling-2’)的缺失，尤其是在M1(图1)。 5E )，对应于上文确定的功能簇2的耗竭(补充图1)。 3C
这些观察表明，肝转移性PDAC病变重建了原发肿瘤的不同方面，包括在原发样本中确定的分化等级。由于M1和M2基因在原发肿瘤中也有表达，但在转移瘤之间没有共同表达，因此所观察到的基因表达模式与潜在的同质突变相一致，并与差异表观遗传控制相结合，这可能是由局部微环境或偶然事件驱动的。与基因组相比，PDAC转移瘤在转录水平上表现出更多的异质性。12 基因表达的差异可能不是新事件的结果，对未来的靶向治疗有着令人鼓舞的影响。
PDAC类有机物为药物筛选提供了体外模型 在寻求为晚期转移性疾病或不利的转录亚型PDAC患者开发新的化疗方法时，器官模型为体外药物反应筛选提供了很大的潜力。为了说明我们的PDAC细胞器系在筛选应用程序中的用途，我们应用了最近基于显微镜的活细胞分析和量化工作流程( DeathPro )39 。在此流程中，所有细胞用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)染色以区分活细胞和死细胞；然后从投影共焦图像中测量死细胞(PI)和所有细胞(Hoechst 33342或PI染色)所覆盖的总面积，并计算细胞死亡和增殖抑制(AUCpi)的面积曲线下值。与简单的发光细胞活力检测方法相比，该方法解决了药物诱导的细胞死亡和增殖抑制问题。 39 。本文测定了临床应用于PDAC治疗的6种药物对PDAC细胞死亡和增殖的抑制作用，即5-Fu、Gemcitabine、Irinotecan、Paclitaxel、Erlotinib和oxaliDP(图一)。 6A 和补充表 6 ).
图6：经典亚型基因表达与器官药物反应相关。 a 实验药物筛选协议概述。PDAC类有机物经不同浓度的药物处理72h后，进行三维共聚焦成像。通过测量Hoechst(H)和碘化丙酸丙酯(PI)信号强度，计算评分，比较药物诱导的细胞死亡和增殖抑制。标尺，200米。 b 24条PDAC细胞器系从scRNA-seq数据计算的中位亚型评分与药物诱导的增殖抑制(AUCpi)值之间的相关性(AUCpi)。高分 x 轴代表一种更“经典”的转录表型。 c 转录型PDAC亚型(TOP)、中位细胞周期评分(中间)和对5-Fu处理的增殖抑制作用(下)的变化概述如下 z -所有样本的分数。
5-氟尿嘧啶和吉西他滨对筛选出的所有细胞器系的细胞死亡和增殖抑制最大，而厄洛替尼和奥沙利铂的效果最差，尽管在不同的细胞器系间存在显著的药物反应异质性(附图)。 4A )。对于每种药物，“经典”亚型基因的表达与药物治疗后更明显的增殖抑制有关，而药物诱导的细胞死亡与PDAC亚型的相关性较小(图一)。 6B 和补充图。 4B
综上所述，我们的结果表明，“经典”亚型特征与更好的药物反应和更高的分化水平有关，而预后较差的“基性”信号则与细胞增殖和药物反应减少有关(图一)。 6C 和补充图。 4C
