人肝细胞的单细胞分析和无偏聚类 为了研究肝脏NPCs的异质性和动态串扰，我们在10×基因组铬平台上生成了人肝脏的scRNA-seq数据。因为肝细胞约占肝细胞的60% 2 ，为了丰富npc，我们采用了一种方法。 31 在制备测序库之前移除肝细胞(如图所示)。 1 A，“ 方法 ”).
图1 人肝非实质细胞scRNA-seq数据的生成。( a )样品制备、测序和生物信息学分析的工作流程。( b )本研究中单细胞的UMAP可视化。每个点表示按单元格类型颜色编码的单元格.HSCs，肝星状细胞；LSECs，肝窦内皮细胞；血管内皮细胞，血管内皮细胞；MDMS，单核巨噬细胞；NK细胞，自然杀伤细胞。( c )已知标记基因在UMAP小区中的代表性基因表达和分布。显示了规范化的表达式值。( d )点阵图，显示所鉴定的每一种细胞类型的前两个标记基因。点的大小代表表达每个基因的细胞群体的比例。颜色表示表达式的级别。( e 代表每个供体细胞对每一种细胞类型的相对贡献。来自健康肝脏的非实质细胞。( f )UMAP显示单个细胞，与Ramachandran等人肝细胞整合在一起。(2019年)。( g )间充质细胞的UMAP显示。由估计的RNA速度推断的细胞分化方向被绘制为UMAP上的流线。( h )间充质细胞的UMAP显示。细胞用ECM评分着色。( i )热图显示每一间充质细胞类型的前10位差异表达基因。血管平滑肌细胞；间皮细胞。
我们从6个健康的人体肝脏中分离和分析了17,810个细胞。去除低质量细胞后，共保留15299个细胞(每个样本1449-4821个)进行进一步分析。每个细胞检测到1141个基因的中位数。为了识别具有不同谱系和转录状态的细胞，我们使用Seurat R软件包对这些细胞进行了无偏聚类。 32 。NPC共有13个不同的细胞系(见图)。 1 (B)与肝星状细胞(HSCs)相对应； COL1A1 + DCN + )，肝窦内皮细胞(LSECs 1：1区， SPARCL 1 + CLEC14A + ；LSECS 2：区域2和3， STAB 1 + FCN2 + )、血管内皮细胞( VWF + ACKR 1 + )、胆管细胞( SOX 9 + 埃帕姆 + )，T细胞( CD3D + 特拉克 + )、自然杀伤(NK)细胞( NKG 7 + GNLY + )，B细胞( MS4A1 + CD79A + )，血浆细胞( IGLC 2 + IGHG 1 + )，树突状细胞( IRF 8 + LILRA 4 + )、单核巨噬细胞(MDM)； CD 68 + MNDA + )、Kupffer细胞( CD 68 + 马可 + )和循环细胞( TOP2A + UBE2C + )(图1. 1 c，d)。由于在离心过程中肝细胞没有完全去除，所以也有一小团肝细胞。 APOC 2 + F2 + )(图1. 1 (b-d)所有14种细胞类型都含有来自六个肝脏供体的细胞(如图所示)。 1 e)。我们还使用Singler进一步检查了我们的单元格类型注释。 33 -一个计算框架，将每个细胞的转录轮廓与参考数据集进行比较，以确定细胞的身份(补充图)。 1 ).
为了深入了解hscs的激活，我们从四个健康且重要的公共数据集的三个肝硬化人肝脏中聚集了157,619个细胞。 22 。然后对175,429个细胞进行了分析( 方法 “)随后确定了20个群体和15个不同的细胞系(见图)。 1 F，补充图。 2 ).
由于目前的研究主要集中在间充质细胞(也称为ECM产生细胞，包括HSCs、门脉成纤维细胞和血管周围细胞)，我们对这些群体进行了聚类分析，并进行了RNA速度分析。 1 G，“ 方法 “)这一分析揭示了发展轨迹的稳健性 RGS 5 -表达qHSCs给 COL1A1 -支持表达AHSCs。ECM分数，根据共同表达的ECM相关基因的表达值计算。 方法 )，也显示肝硬化患者的间充质细胞ECM表达明显增加，AHSCs的ECM表达最高(图一)。 1 h)。然后，我们通过进行差异基因表达分析，确定了每一种细胞类型的标记基因(如图所示)。 1 i)。在AhSCs的差异表达基因中，有众所周知的纤维化标记，例如， COL1A1 , COL1A2，DCN 和 兰姆 .
肝纤维化相关细胞间通讯的鉴定 细胞信号在细胞发育、组织稳态和疾病发展中起着至关重要的作用。 34 。Hsc激活是由细胞间信号效应协同作用的过程，调控下游基因调控网络的活性。 5 ,6 。通过利用每个细胞群体的转录特征，我们利用cellPhoneDB建立了一个完整的细胞间潜在配体受体相互作用的网络。 35 数据库中的已知配体受体对 35 和文学 36 (无花果) 2 a)。AHSCs与其他细胞类型之间的潜在相互作用数显著大于qHSCs与其他细胞类型之间的相互作用(配对学生t检验， P =9.12e-7；图1。 2 a)。我们特别关注涉及HSCs的相互作用，并将qHSCs与其他细胞之间的相互作用对作为对AHSC特异性相互作用的参考，这些相互作用可能代表参与肝纤维化的发生或延续的潜在关键介质。图形 2 B显示选定的重大( P < 0.05) ligand-receptor pairs that are specific to aHSCs.
图2 正弦信号小生境中的细胞间通信。( a )热图显示由CellphoneDB预测的两种肝细胞之间潜在配体受体对的数目。( b )点阵图显示AHSCs与其他细胞类型间的配体-受体相互作用。网点大小表示所指示的相互作用的统计意义。点颜色表示平均表达式级别(Log)。 2 -转化)来自AHSCs的受体和另一种细胞类型的配体。( c –f )基因表达 ITGAV , LAMC 1 , TNFRSF11B ，和 VWF 在疾病进展阶段。从Gerhard等人那里下载和重新分析rna-seq数据。(2018年)。曼-惠特尼 U 试验(双面)进行统计比较。日志转换数每百万。
最显著的特异性相互作用发生在正弦信号生态位，其中HSCs与KCs/MDMs、LSECs和血管ECs非常接近。转化生长因子-β信号通路与肝纤维化及肝细胞活化有关。 37 并且确实出现在我们的结果中(图一)。 2 b)。配体可能与AHSCs上的表皮生长因子受体(EGFR)结合，包括两调节素(AREG)和前列腺素(GRN)(图1)。 2 b)。鲁棒表达式 AREG 在MDM和其他免疫细胞中，EGFR信号传递的可能性增加。一直以来，EGFR-AREG信号轴确实参与了HSC的成纤维活动，并且 AREG 在小鼠和人类纳什中被上调 38 。KCS和MDM还可能通过分泌grn来激活hsc，从而调节EGFR信号，而grn则被证明是一种hsc生存信号，通过efoin受体A2来刺激EGFR信号。 39 。Erlotinib可减弱hSCs中EGFR的磷酸化，从而减少AHSCs的总数量。 40 。从KCs和胆管细胞分泌的PDGFC可与HSCs的血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)结合，进而触发PDGF信号通路。 2 b)。这与以前的研究一致，表明PDGF信号通路对多种刺激产生持续的激活作用，并促进hsc的激活和纤维化的进展。 41 。HSC的激活也可以通过自分泌信号(PDGFD-PDGFRα)来扩增。 2 b)。有趣的是，PDGF-C和-D水平在qHSCs向aHSCs的转化过程中增加，并在激活过程中持续存在，提示这些亚基在纤维发生后期起一定作用。 42
以往的研究表明整合素αV(ITGAV)可能是小鼠多器官纤维化的主要驱动因子。 43 。在潜在的α亚基中，只有itgav被证明对结合和激活转化生长因子-β是关键的，而转化生长因子-β在hsc的激活中起着关键的作用。 44 。从邻近细胞分泌的层粘连蛋白亚基γ1(LAMC 1)可与ITGAV相互作用，触发HSC活化(图1)。 2 (B)，这与我们观察到的从健康到纤维化肝脏这两个基因的RNA表达增加是一致的(见图)。 2 c，d)。TNF受体超家族成员11B(TNFRSF11B)在HSCs表面可能受VWF、THBS 1和TNFSF 10等配体的调控。 2 b)。TNFRSF11B-vwf信号轴可能是一种新的相互作用，可能在hsc的激活中起作用，并且vwf缺陷已经被证明可以减轻慢性四氯化碳(Ccl)。 4 )肝纤维化 45 。这是进一步支持的基因表达比较，这两个基因在健康和纤维化的人类肝脏(图一)。 2 E，f)。此外，免疫细胞分泌的B、T淋巴细胞减毒剂(BTLA)和TNFSF 14可能与TNFRSF 14相互作用，强调AHSCs可能在损伤部位发挥促炎和增殖作用(图1)。 2 b)。与文献一致 46 我们还发现Notch信号通路参与了纤维的发生，突出了NOTCH 2在AHSCs上和配体Dll 4和JAG 2在ECs中表达的两个潜在的相互作用对(图)。 2 b)。最近的一项研究表明 Dll4 击倒可减轻LSEC毛细血管化，并对CCL有保护作用。 4 -纤维化 47
肝间充质细胞单细胞调控网络推断 基因调控网络定义和维持细胞类型的特定身份，进而决定细胞的功能.对于这一分析，我们特别关注间充质细胞(如图所示)。 1 G-I)。为了识别每个单元的主调整器，我们使用了风景线。 48 。简要地说，风景预测转录因子(TFs)与它们的候选目标基因，即共同称为正则。共表达分析、靶基因基序富集分析和调控活性评价三个主要步骤。为了检验这一方法是否有效，我们将肝细胞作为其核心基因调控网络进行了详细的研究。 49 。分析得出细胞型特异性调节因子及其相应的调节活性评分(RAS)。然后对每种细胞类型的RAS进行跨细胞平均。重要的是，图中176个重要调控子的调节子活性树状图共包含11,920个靶蛋白编码基因。 3 A与所有可靠表达的(18,771)蛋白编码基因(补充图)所定义的聚类符合得很好。 3 )。确实有人建议使用特定于细胞类型的核心调控复合物(Corc)来定义细胞类型。 50 。与文献一致 49 ，成功地识别出已知的肝细胞特异性调节因子，包括 HNF4a/G 和 FOXA 1/2/3 ，作为肝细胞的最高调控因子(图1. 3 a)。
图3 肝间充质细胞的细胞类型特异性基因调控网络。( a )人肝间充质细胞推测的调节因子热图。( b 根据CREB3L1、RUNX 1、Twist 1和TWIST 2的调节子活性，显示出调控子的细胞类型特异性。( c )未损伤和纤维化小鼠肝间充质细胞的UMAP包埋(持续6周的CCL)。 4 治疗)从Dobie等人身上检索到的小鼠肝脏。(2019年)。左，按单元格类型/状态着色的单元格。对，由条件/细胞来源着色的细胞。( d )小鼠肝间充质细胞的热图。( e 用Creb3l1和Twist 1的正则子活性染色，显示了调控子的细胞类型特异性。
这种方法在确定关键的肝细胞调节因子方面的成功使我们能够自信地检查AHSC特异性的调控物。值得注意的是，我们发现调节子RUNX 1在AHSCs中活性很高，而在qHSCs和其他细胞类型中活性较低(如图所示)。 3 (a，b)，表明它是HSC活化的潜在主调节因子。的确， RUNX 1 提示在nash相关的小鼠hsc激活中起重要作用。 17 ，并增加了对.的表达 RUNX 1 NASH患者肝脏活检与NASH活动评分的相关性研究 51 。有趣的是， RUNX 1 也被认为是纤维化小鼠肺成纤维细胞中的顶级tfs之一。 52
CREB3L1 ，也被称为OASIS，被认为是另一个潜在的HSC激活主调节因子。 3 (a，b)，因为它的预测目标基因包括已知的肝纤维化相关基因，如 COL1A1 和 LOX 。这一观察与先前的一项发现一致，即CREB3L1缺陷小鼠表现出严重的骨量减少，其原因是 COL1A1 在骨基质中 53 。另一项研究表明，抑制CREB3L1的膜内蛋白水解，可防止某些纤维化疾病中胶原蛋白的过度沉积。 54 ...利用最近一项关于人类NASH的转录研究 13 ，我们证明了 CREB3L1 随着疾病从健康到纤维化肝脏的发展(补充图)。 4 )。鼠标单细胞数据集的再分析 25 AHSCs对Creb311Regon有较高的活性(图二)。 3 (c-e)与最近的一项研究相一致 55 ，其他与AHSC有关的监管机构(即， IRF 1 和 NFKB 1 )我们的结果也观察到了。
此外， CREB3L1 , HOXC 8 , Twist 1 和 TWIST 2 在本研究中发现的也是在不同器官来源的成纤维细胞中共享的tfs。 56 (无花果) 3 a，b)。而参与. HOXC 8 在丝素发生中仍未被探索，其作用是 Twist 1 在各种纤维疾病中，近年来逐渐被发现。 57 。激活 捻度 染色质重塑蛋白brg 1的转录可能参与了小鼠肝纤维化的发生，twst 1抑制剂(Haramine)具有抗纤维化作用。 58 。此外，我们还为其他类型的细胞鉴定了特定的调节因子，例如qHSCs的FOS、JUN和MYC，MCs的BACH 1、GLI 3、WT1和Y1(图一)。 3 a)。每个单元格类型的两个完整的规则列表及其活动可在补充表中找到 1 和 2 ，分别为人类和老鼠。
肝、胰星状细胞的比较 胰腺星状细胞(PSCs)与HSCs有许多形态和功能特征，因此推测它们有共同的起源。 59 。尽管星状细胞在纤维发生中的作用已经确立，但目前肝和胰腺星状细胞之间仍然缺乏基因组比较。一项基于微阵列的转录分析显示，hscs和pscs是高度相似的。 60 。然而，这一分析似乎相当有限。ScRNA-seq使HSCs和PSCs能够以前所未有的分辨率进行比较，以揭示重叠和独特的基因表达特征。为此，我们检索并重新分析了一个公共的人类胰腺scRNA-seq数据集。 61 ，并鉴定出两个与静止和激活的PSCs相对应的簇(图)。 4 a)。接下来，我们比较了AHSCs和aPSCs中上调和下调的基因。 4 b)。例如，许多标记基因在两个器官的星状细胞中都很常见。 RGS 5 , FABP 4 和 ADIRF 对于静止的星状细胞和 AEBP 1 , COL1A1 , COL1A2 , 兰姆 , TIMP 1 和 VCAN 活化的星状细胞。 4 b)。
图4 肝星状细胞与胰腺星状细胞表达模式的比较。( a )从Baron等检索到的人胰腺细胞的UMAP包埋。(2016年)。左边是按单元格类型着色的单元格。对，细胞由供体着色。QPSCs，静止的PSCs；aPSCs，激活的PSCs。( b )肝(左)和胰腺(右)活化和静止星状细胞差异基因表达的Volcano图谱。活化星状细胞中的上调基因(Sig.up)和下调基因(Sig.down)分别表现为绿色和粉红色。肝脏和胰腺之间的前50位上调或下调基因中共有16和6个基因分别被标记。( c )人胰腺细胞推测的调节因子热图。( d 调节子活性根据CREB3L1和RUNX 1的调节子活性着色，显示了调控子的细胞类型特异性。
另一个令人感兴趣的问题是，来自不同器官的同一类型细胞是否可以共享基因调节回路。为此，我们还对所有胰腺细胞进行了动态分析。事实上，我们发现两个器官的星状细胞都有一定的调节活性(如图所示)。 4 c)。与AHSCs的结果一致，aPSCs的RUNX 1、CREB3L1和Twist 1的调节子活性明显高于qPSCs(图1)。 4 c，d)。每种细胞类型的规则及其规模活动的完整列表可在补充表中找到 3 .
肝纤维化相关基因的可译性评价 接下来，我们试图探索我们的发现，重点是可译性。对有效和安全治疗的需求促使体外和体内模型的发展，以研究特定基因与纳什的发展和进展的相关性，并在人类研究之前评估潜在的治疗药物。 7 ,62 13 证实了与健康肝脏相比，许多AHSC特异性基因确实在纤维化中被上调。 5 a)。与这一发现相一致的是，这个数据集的计算反褶积显示了AHSCs在疾病发展过程中所占比例的上升趋势(图一)。 5 b)。其次，为了评估基于人类数据的潜在新治疗靶点的可译性，我们从ccl小鼠模型中整合了公共rna-seq数据集。 4 -诱导纤维化及体外HSC活化 17 。在体小鼠模型中，在连续8周后，将qHSCs和AHSCs分别从健康肝脏和纤维化肝脏中分离出来。 4 治疗。为建立离体小鼠模型，将健康的肝源性原代qHSCs培养并在塑料上激活12天。随后对AHSCs和qHSCs之间的差异基因表达进行了分析。 5 c，d)。在体内和体外肝纤维化模型中，我们总共发现了61个显著上调和13个下调基因，这些基因在人AHSCs和纤维化肝组织以及小鼠AHSCs中都有类似的行为。 5 E.补充表 4 和 5 ).
图5 现有RNA测序数据集的Meta分析纳什和肝纤维化。( a )肝纤维化与健康肝脏差异基因表达分析。只有排名前10位的上或下调控基因被标记为基因符号。绿色和粉红色分别显示上调基因(Sig.up)和下调基因(Sig.down)。( b )191例人肝标本(正常36例；脂肪变性50例；炎症52例；纤维化53例)大量RNA-seq数据的计算反褶积。从Gerhard等人那里检索了rna-seq数据。(2018年)。曼-惠特尼 U 试验(双面)进行统计两两比较。( c )AHSCs和qHSCs的差异基因表达分析(作为参考)。 4 鼠肝。从Marcher等人那里检索了rna-seq数据。(2019年)。绿色和粉红色分别显示上调基因(Sig.up)和下调基因(Sig.down)。只有排名前10位的上或下调控基因被标记为基因符号。( d )AHSCs与qHSCs的差异基因表达分析(作为参考) . 体外用塑料激活健康肝源性qHSCs。从Marcher等人那里检索了rna-seq数据。(2019年)。绿色和粉红色分别显示上调基因(Sig.up)和下调基因(Sig.down)。只有排名前10位的上或下调控基因被标记为基因符号。( e )Venn图显示了与qHSCs相比，AHSCs中三组上调基因与qHSCs之间的所有可能的逻辑关系，以及与健康对照组相比，一组上调基因在人体纤维性肝中的表达。在此分析中，只考虑了编码人、鼠和大鼠一对一同源基因的15,252种蛋白质(补充表)。 6 ). (f )对61个共有的上调基因进行功能富集分析。( g 在61个基因中，前三个调控基因(Motifs)及其相应的靶基因的调控基因网络。( h –m )用时程RNA-seq数据研究肝纤维化候选治疗靶点的上下文化。( h ,i 高脂饲料诱导的纳什小鼠模型； j ,k 硫代乙酰胺(TAA)诱导大鼠肝纤维化模型； l ,m )胆管结扎(BDL)大鼠肝纤维化模型。左，研究样本的PCA。对，感兴趣基因的表达水平。TPM，每百万份成绩单。调整后的p值<0.05为绿色.
然后我们专门关注61个显著上调的基因。功能富集分析揭示了61个基因被过度表达的途径，其中最丰富的10个途径包括与ECM组织、胶原形成和降解以及整合素细胞表面相互作用有关的途径(图1)。 5 f)。总之，这突出了ECM和整合素在肝纤维化发展中的中心作用，而不管疾病的病因是什么。此外，还为61个DEGS建立了一个基因调控网络，以更好地了解负责纤维化发展的主TFs的潜在协同调控作用。目标基因、前三个基序和相应的TFs(如果有信息)如图所示。 5 G.符合上述规则的结果， CREB3L1 再次被确认为肝纤维化相关基因的主调节因子。
接下来我们检查单个基因。其中许多基因，包括COL1A1 , LOX , MMP 14 , TGFβ3 , TIMP 1 和 VCAN 是肝纤维化的已知标志。其他基因，如 AEBP 1 , Prrx 1 和 LARP 6 也参与了肝纤维化的发生，并可能成为纳什纤维化的潜在药物靶点。不要紧， AEBP 1 和 Prrx 1 是61个基因中仅有的两个TF基因。表达 AEBP 1 与小叶性炎症、脂肪变性和健康肝相比，纤维性人肝明显升高，且随着纤维化程度的加重，NASH患者的肝纤维化增加。 63 AEBP 1 也是与qPSCs相比，aPSCs中最显著的上调基因之一(见图)。 4 b)。有趣的是， Aebp 1 在 Col14a1 -在小鼠纤维化肺中产生肌成纤维细胞的亚群体 52 。利用啮齿动物肝纤维化模型，先前的一项研究揭示了 Prrx 1 在PDGF依赖的hsc迁移和腺病毒介导的 Prrx 1 短发夹RNA(ShRNA)给药减少硫代乙酰胺(TAA)和CCL 4 -肝纤维化 64 。始终如一， Prrx 1 最近发现参与特发性肺纤维化，抑制Prrx 1活性足以减轻肺纤维化的发展。 65 。由于纤维化的特点是Ⅰ型胶原过度堆积，因此LARP 6与胶原mRNAs 5‘干环结构的结合是胶原翻译的关键步骤。 66 。这使得 LARP 6 肝纤维化的一个很有前途的靶点，最近的一个高通量筛选得到了一种化合物(C9)，它代表了第一个具有显著抗纤维化活性的LARP 6抑制剂。 67
为了进一步探索那些我们已经证明参与肝纤维化相关通路和基因调控回路的基因，我们利用了小鼠高脂肪饮食诱导纳什的时程数据集。 16 。此外，我们还建立了TAA和BDL诱导的肝纤维化大鼠模型的时间历程RNA-seq数据.一贯地，两个著名的肝纤维化相关基因的表达(例如， Col1a1 和 LOX )在61个共有的肝纤维化相关基因和4个感兴趣的TF基因中(例如， RUNX 1 , 克里布3l1 , Aebp 1 和 Prrx 1 在所有三种啮齿动物模型中，随着疾病的恶化，它们呈现出上升的趋势(如图所示)。 5 进一步证实了它们在人类、小鼠和大鼠之间的可译性，为今后的药物发现工作做准备。
