结直肠癌患者肠道细菌通过丁酸分泌促进肿瘤发生

新的证据显示肠道微生物群的改变与结直肠癌(CRC)有关。然而，目前对于肠道微生物群的改变是否和如何与CRC的发展有因果关系还知之甚少。在这两个独立的队列研究中，我们发现在CRC患者中有12个粪便细菌类群被富集。其中，2卟啉单胞菌物种能够通过分泌细菌代谢物丁酸盐来诱导细胞衰老，这是一种致癌应激反应。值得注意的是，在CRC组织中观察到这些细菌的入侵，与丁酸盐水平的升高和衰老相关的炎症表型相吻合。而且，虽然这些细菌APCΔ14/+当细菌丁酸合成基因被破坏时，小鼠会加速结直肠肿瘤的发生.这些结果表明卟啉单胞菌物种过度生长和结直肠肿瘤发生，这可能是由于丁酸引起的衰老。

在过去的几十年里，随着饮食的变化和寿命的延长，结直肠癌的发病率和死亡率都在急剧上升，现在结直肠癌已成为世界上第二常见的癌症。1。因此，迫切需要针对“儿童权利公约”采取有效措施，并期待及早发现和预防“儿童权利公约”。在健康的成年人中，结肠含有最密集的代谢活性微生物群落，越来越明显的是肠道微生物组成的变化与包括癌症在内的各种疾病有关。2,3,4,5。例如，引入核梭杆菌或脆弱类杆菌进APCMin/+小鼠加速肠道肿瘤的发生6,7。此外，据报道，PKS+ 大肠杆菌、厌氧消化链球菌、梭菌。和脆弱类杆菌结肠肌动蛋白的产生促进结肠肿瘤的发生8,9激活PI3K-AKT通路10，次生胆汁酸产生11，和脆弱类杆菌毒素生产12分别。因此，肠道微生物群用于CRC筛查和(或)CRC预防引起了极大的关注。13,14。然而，由于居民区、医疗和技术协议强烈地影响着人类肠道微生物群的变化。15,16,17，很难集成和比较不同的发布数据集。更重要的是，尽管许多研究报告，某些肠道细菌的数量在CRC患者中增加或减少。18,19,20,21，除了上述细菌外，目前尚不清楚这些肠道细菌中哪些实际上参与了crc的发展。5,22。因此，为了更好地了解大肠癌的发生机制和发展更有效的大肠癌筛查方法，有必要弄清大肠癌患者中哪些肠道细菌的增加或减少实际上参与了大肠癌的发生，以及它们如何发挥这些作用。为此，我们需要一些可靠的指标来检测潜在的致癌刺激。

由于受到各种致癌刺激，如某些癌基因的激活，活性氧(Ros)水平的升高，或暴露于无数dna损伤剂中，正常细胞要么发生凋亡细胞死亡，要么遭受不可逆转的细胞周期阻滞，称为“细胞衰老”。23,24,25,26,27,28。然而，与凋亡细胞不同的是，衰老细胞能存活很长一段时间，并形成由促炎因子和促肿瘤因子组成的分泌型，这是一种典型的特征，称为衰老相关分泌表型(Ssp)。29,30,31。因此，虽然细胞衰老最初是一种抑制肿瘤的机制，但衰老细胞在体内的积累最终通过SASP促进肿瘤发生，这取决于生物学环境。2,32,33,34,35.

利用细胞衰老反应作为识别肠道细菌的指标，可以激发潜在的致癌刺激，我们在此表明：牙龈卟啉单胞菌和溶孢卟啉单胞菌它们对应于CRC患者的两个细菌类群，很少在健康人(HI)中检测到，它们能够通过分泌丁酸(一种短链脂肪酸)在培养的细胞和肠上皮器官中诱导细胞衰老。此外，牙龈卟啉单胞菌而且，在较小的程度上，溶孢卟啉单胞菌并通过丁酸分泌促进小鼠结直肠肿瘤的发展。我们的数据显示，这些产生丁酸盐的细菌在结肠中的异常增加很可能与CRC的发展有关，这取决于生物学环境。

大肠癌患者肠道菌群的鉴定

为了检查CRC患者肠道细菌形态的改变是否和如何与CRC的发生有关，我们首先从健康人和CRC患者中收集粪便样本，他们接受了结肠镜检查来诊断CRC或确认没有结肠病变(Cohort-1)。为了避免任何不可预见的偏见，在进行任何治疗之前，收集粪便样本，包括结肠镜检查、抗生素治疗、化疗和放射治疗(附图)。1A)。此外，与消化道重建或炎症肠道疾病，可能影响肠道细菌组成的个人，也被排除在这一队列研究(补充图)。1A)。总计，384 HI和380例CRC患者的粪便样本，包括63例早期CRC患者(参与者的临床特征见附图)。1B和C)，对细菌16 SrRNA基因可变区1和2(v1和v2)进行了Meta序列分析。36。在QIIME 2(Version 2019.10)中，通过DADA 2管道去噪，从破乳的16 SrRNA基因序列中筛选出扩增序列变异体(Asv)。37，利用VSearch的De novo聚类算法，在97%的相似度截止下，聚类为操作分类单元(OTUS)。线性判别分析效应大小(左)38结果表明，大肠癌患者87和24 OTUS的丰度分别升高和下降。

为了寻找与CRC的发生有因果关系的肠道细菌，我们接下来将重点放在那些在CRC患者中大量增加或减少的细菌OTUS。我们注意到HI丰富的细菌OTUS中没有一例在CRC患者中普遍缺失，而12例在CRC患者中丰富的细菌OTUS很少出现在HI中(图1)。1A)。这12种细菌OTUS最有可能与牙周病相关的细菌种类相对应。39，利用细菌16S rRNA基因序列V1-V2区进行席尔瓦数据库和BLAST数据库分析(补充图)。1D)。为了证实这些结果的重复性，并检查这些细菌是否也在早期CRC患者中富集，对一个由129名HI、136名早期CRC患者和153名晚期CRC患者组成的独立验证队列(Cohort-2)进行了类似的分析(补充图1)。2)。有趣的是，使用这一独立的验证队列获得了类似的结果，12种细菌OTUS中的4种也在一定数量的早期CRC患者中增加，尽管其频率和数量低于晚期CRC患者(图1)。1B)。有趣的是，这些细菌OTUS在手术切除CRC后就不再被检测到了(如图所示)。1C)，进一步说明它们与儿童权利委员会的密切联系。然而，仅靠这些相关的研究无法区分这些细菌的增加，除了核梭杆菌Subsp.40,41,42，在CRC患者是CRC发展的原因或结果。因此，需要生物功能分析来澄清这一点。

卟啉单胞菌物种诱发细胞衰老

越来越多的证据表明，细胞衰老是由多种潜在的致癌刺激引起的，并根据生物学环境的不同抑制或促进肿瘤的发生。25,26,32,33。因此，我们决定用细胞衰老反应作为一个指标，以确定这些CRC-富集细菌是否能够激发潜在的致癌刺激。早期传代正常人二倍体成纤维细胞(Hdfs)，作为衰老研究中最常用的细胞，在含有10种粪便细菌上清液的培养基中培养9d，与CRC患者富集的细菌OTUS相对应。核梭杆菌在不含细菌培养上清液的培养基中培养3天。2A和补充图。3)。有趣的是，类似于阿霉素(DXR)，一种DNA损伤剂，已知可诱导细胞衰老。43，细菌培养上清溶孢卟啉单胞菌和牙龈卟啉单胞菌在培养的hdfs中引起不可逆的细胞周期阻滞(如图所示)。2A)。同时伴随着细胞衰老的典型特征，如衰老诱导基因表达增加。P16Ink4a和P21CIP 1/WAF 1)和SASP因子基因(IL-1和伊-6)，减少拉明B1PRb的表达和磷酸化形式，P53磷酸化形式增加，细胞内ROS水平升高，DNA损伤，而不增加凋亡标记物(图1)。2B-f)。值得注意的是，在正常人结肠上皮细胞中也观察到了类似的结果。3)以及由诱导的多能干细胞(IPS)细胞衍生的肠上皮类细胞器。44，除P16Ink4a肠上皮器官的表达(附图)4)。这些结果表明，这两种细菌不仅在成纤维细胞中而且在正常的肠上皮细胞中都有诱发潜在致癌刺激的能力。

a, b早期传代正常人结肠上皮细胞(CCD 841 CON)，用含指示细菌条件培养基或普通细菌培养基(Mock)的组织培养培养基，以1/30的比例培养9d，每3天换一次培养基，再用普通组织培养基培养3天。在整个实验过程中，细胞数被计数，第12天在指定的培养条件下细胞的代表性照片显示在面板的顶部。这些检测一式三份(包括生物和技术复制)，并显示了具有代表性的数据(a)。第9天对细胞进行rt-qPCR分析。b). c早期传代正常人结肠上皮细胞(CCD 841 CON)，用含指示细菌条件培养基或普通细菌培养基(Mock)的组织培养培养基，以1/30的比例培养9d，每3天换一次培养基，再用普通组织培养基培养7天。对这些细胞进行EDU掺入分析。用4‘，6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI)(蓝色)进行EDU(红色)和DNA染色。在指定的培养条件下，显示细胞的代表性照片。直方图显示EDU阳性细胞的百分比。这些检测一式三份(包括生物和技术复制)，并显示了具有代表性的数据(b, c)。对于所有图，误差条表示平均±S.D。有三个独立的生物复制体。采用单因素方差分析和Tukey‘s检验确定统计学意义。P数值<0.05被认为是显著的(b, c)。源数据作为源数据文件提供。

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为了探索这一观点，我们接下来要找出这两种导致衰老的细菌所分泌的潜在致癌刺激因子。脂多糖(Lps)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，属于这两种细菌，据报道，脂多糖可导致骨细胞衰老。45。然而，类似衰老的细胞周期阻滞在原代小鼠胚胎成纤维细胞中同样被诱导，而不考虑mid 88和trif的存在，rif是lps-tLR 4信号的重要下游介质。46(补充图。5)。此外，我们也找不到胆汁酸诱导的。白)胆汁酸从原胆汁酸转化为次级胆汁酸所必需的基因。47在这两个导致衰老的细菌基因组中NC_015501.1, NC_010729.1)。因此，尽管据报道LPS和次生胆汁酸与细胞衰老有关。2,45和CRC11,48在某些情况下，它们不太可能是这两种物质分泌的潜在致癌刺激因子。卟啉单胞菌物种。

卟啉单胞菌物种通过丁酸分泌促进细胞衰老

在寻找替代因素时，我们将重点放在短链脂肪酸(Scfas)上。短链脂肪酸(Scfa)是一种主要的肠道细菌代谢产物，据报道对宿主的同质性有不同的影响，包括肿瘤发生。22,49。在一系列的SCFAs测试中，两者的细菌培养上清液中的丁酸水平显著升高。溶孢卟啉单胞菌和牙龈卟啉单胞菌，与其他未引起衰老样细胞周期阻滞的CRC富集细菌相比(见图)。4A)。据报道，丁酸盐通过能量或表观遗传功能具有促进和抑制肿瘤的特性，这取决于细胞类型、持续时间和暴露量。22,49。重要的是，用相同浓度的丁酸盐处理hdfs在细菌培养上清液中。牙龈卟啉单胞菌(1.53毫米)确实引起衰老样表型，但其他SCFA的情况并非如此(图1)。4B，c，补充图。6)。虽然相同浓度的丁酸在培养上清液中存在溶孢卟啉单胞菌(0.69mm)单独弱诱导衰老样细胞周期阻滞，与此培养上清液中存在的其他SCFA共同作用，可更有力地诱导这一现象(如图所示)。4B，c，补充图。6)，这意味着其他SCFAs也可能与丁酸一起刺激衰老样表型，特别是低丁酸水平。注意，用SCFA混合物处理正常人结肠上皮细胞，其浓度与培养上清中的浓度相同。溶孢卟啉单胞菌和牙龈卟啉单胞菌，也引起衰老样细胞周期阻滞(附图)。7)。这与先前的观察结果一致，即crc相关的微生物群与不同氨基酸转化为乙酸丁酸和丙酸的途径有关。19。此外，总RNA测序分析表明，这些细菌培养上清液引起的基因表达谱的改变，特别是SASP因子基因和DNA损伤反应基因，与DXR在培养的HDFS中引起的基因表达谱的变化更为相似。4D，e)，暗示丁酸可能是这两种导致衰老的细菌分泌的关键致癌刺激因子。

a结果表明，SCFAs存在于指示的细菌条件培养基或普通的GAM培养基(MOCK)或改良的GAM培养基(Mock-MGAM)中。b–e早期传代TIG-3细胞用含指示细菌条件培养基的组织培养基培养9d，比例为1/30，或以相同浓度的SCFA或这些SCFA的混合物在细菌条件培养基中培养9d。在指定的培养条件下，显示细胞的代表性照片。标尺表示100μm(b)。然后对细胞进行rt-qPCR分析(单程变异数方差分析和双尾邓尼特试验)，并与SCFAs混合物进行比较。大肠杆菌。P数值<0.05被认为是显著的)(c)，或接受RNA测序分析(d, e)。在差异基因表达分析的基础上，给出了多维尺度图(MDS)。d)。热图表示指示细胞和模拟细胞之间基因表达的比率。热图中的颜色表示对数折叠变化(LogFC)相对于模拟，蓝色表示3倍以下的表达式，而红色则表示更高的表达式(e)。分析了Mock的三个生物复制和其他条件下的两个生物复制。d, e)。阿霉素(DXR)浓度为200 ng/ml，丁酸钠浓度为3mm。f在指示的细菌条件培养基中测定丁酸盐浓度(左)。野生型菌株牙龈P.gingivalis(ATCC 33277)和突变株代表其丁酸合成缺陷突变体(PGAGU 118)53。误差条表示平均±S.D。有三个独立的生物复制体。统计意义用一个双尾学生的t-测试。P值<0.05者为显着性。早期传代TIG-3细胞在含指示细菌条件培养基的组织培养基中培养9d，观察到指示细菌条件培养基培养的TIG-3细胞的代表性照片(右)。源数据作为源数据文件提供。

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因为丁酸会诱导P16Ink4a和P21CIP 1/WAF 1基因(图1.4C)，下一步我们将确定丁酸是否通过诱导细胞衰老来促进细胞衰老。P16Ink4a和P21CIP 1/WAF 1表情。值得注意的是，虽然丁酸处理诱导野生型小鼠原代皮肤成纤维细胞衰老样细胞周期阻滞，但缺乏这两种功能的小鼠皮肤成纤维细胞的情况并非如此。P16Ink4a和P21CIP 1/WAF 1基因50(补充图。8)。这些结果，再加上先前观察到的丁酸酯引起的表观遗传诱导P16Ink4a，p21CIP 1/WAF 1和SASP在培养的人细胞中的作用51,52，再次暗示丁酸盐是这些细菌分泌的主要衰老因子。为了进一步验证这一观点，我们接下来测试丁酸生产的阻断是否会影响产生丁酸的细菌的衰老诱导活性。事实上，减少丁酸生产，删除PGN_0725, PGN_1341和PGN_1888，三种辅酶A转移酶参与了丁酸生产的最后一步。53，使文化上清牙龈卟啉单胞菌不能诱导衰老-在HDFS中的反应(图。4F，补充图。9)。综上所述，这些结果强烈地表明丁酸酯是这些导致衰老的细菌分泌的主要潜在致癌刺激因子之一，尽管我们不能排除其他因素也可能参与其中的可能性，这取决于生物学环境。

结直肠癌组织中细菌入侵与细胞衰老征象

为了进一步证实这一观点，我们下一步寻找证据，证明细胞衰老发生在富含这些丁酸盐产生细菌的CRC组织中。虽然水平较高(15-25毫米)54据报道，丁酸盐存在于结肠腔内，其在肠上皮中的含量要低得多，因为它覆盖了一层浓密的黏液，从而防止了肠道细菌进入下层组织。49。然而，有趣的是，利用物种特异性探针进行的原位杂交分析显示，这些产丁酸盐的细菌浸润了富含这些细菌的粪便患者的CRC组织(图一)。5A，b，补充图。10A)。此外，要区分溶孢卟啉单胞菌和[医]乌氏卟啉单胞菌，其16S rRNA序列与物种特异性基因的同源性在98%以上，RpoB，从病人中分离并测序(附图)。1D和10b)。值得注意的是，在相同的切除标本中，肿瘤区的丁酸水平明显高于非肿瘤区(图1)。5C)。这些结果，结合观察到的细胞衰老迹象，如两种p16的诱导作用。Ink4aSASP因子(IL-6)在肿瘤区域内细菌浸润附近有表达(如图6所示)。5B)，强烈提示这两种产生丁酸的细菌参与了人类结直肠组织细胞衰老的实现。注意很大比例的p16Ink4a表达细胞也表达αSMA(补充图)。10C)，暗示至少在肿瘤微环境中的一些成纤维细胞中可诱导衰老样表型。

产丁酸盐细菌加速结直肠肿瘤的发生

最后，我们确定了这两种产生丁酸的细菌是否能在体内促进结直肠癌的发生.为此，我们使用了APCΔ14/+小鼠，其远端结肠和直肠肿瘤的发育增强。55，和核梭杆菌Subsp.作为阳性对照6。值得注意的是，结直肠肿瘤的数量APCΔ14/+小鼠牙龈卟啉单胞菌而且，在较小的程度上，溶孢卟啉单胞菌与对照组(PBS)小鼠相比，小鼠灌胃量增加。5D)。这同时伴随着细胞衰老的迹象和结直肠肿瘤中丁酸盐水平的增加。APCΔ14/+小鼠使用这些细菌(附图)。11A-d)。这些结果与观察到的培养上清液中丁酸的水平是一致的。牙龈卟啉单胞菌比溶孢卟啉单胞菌(无花果)4A-C)，暗示高水平的细菌丁酸可能促进结直肠肿瘤在体内的发展。为了支持这一观点，我们接下来研究了是否减少丁酸盐的产量。牙龈卟啉单胞菌降低结直肠肿瘤形成的能力APCΔ14/+老鼠。事实上，结直肠肿瘤的数量APCΔ14/+小鼠注射丁酸合成缺陷突变体牙龈卟啉单胞菌53通过灌胃明显低于.=‘class 1’>APCΔ14/+野生型小鼠牙龈卟啉单胞菌(无花果)5E)。还值得一提的是，小鼠在灌胃时产生的结肠肿瘤的数量。牙龈卟啉单胞菌ABT-263是一种公认的抗衰老药物，它能优先消除衰老细胞。56，尽管这一减少在统计学上没有显着性意义(图1)。5F)。值得注意的是，接受ABT-263治疗组肿瘤的大小在统计学上明显小于未接受ABT-263治疗组(图1)。5F)。此外，p16的比例Ink4a用ABT-263处理的小鼠肿瘤区成纤维细胞(αSMA阳性细胞)的表达明显低于未处理的小鼠(补充图)。11E)。这些结果，再加上先前观察到的细胞衰老发生在人类结直肠肿瘤中。30,57强烈的提示，这些产生丁酸的细菌在结肠中的异常增加很可能与CRC的发展有关，至少在某些情况下可能是通过刺激细胞衰老来实现的。

肠道微生物群研究领域中的一个重要问题是肠道微生物群的改变是否和如何与CRC的发展有因果关系的问题。5,22。在这项研究中，我们发现在两个不同的队列研究中，有12个粪便细菌在CRC患者中富集，而在HI中很少被检测到。1A，b)。虽然一些与这些细菌分类群相对应的细菌种类在CRC患者中有增加，但在几项不同的研究中。18,19,20，目前尚不清楚这些细菌种类，除了核梭杆菌，是否致癌。因此，我们以细胞衰老为指标，探讨了这一课题。在本研究中，我们使用正常肺hdf作为筛选肠道细菌的一种工具，因为正常肺hdf是细胞衰老研究中最常用的细胞。2)。然而，必须强调的是，我们随后证实了用hdfs鉴定的两种细菌能够诱导肠道细胞衰老样表型(图一)。3和补充图。5)和老鼠。5D-f)。请注意，SA-β-gal是一种广泛使用的衰老标志，当正常细胞因接触抑制或血清饥饿而变得静止时，也会产生这种活性。58,59,60，而不是实现细胞衰老所必需的。61。因此，在本研究中，我们使用了其他已知的在建立衰老状态中起关键作用的标记，如dna损伤灶增加。P21CIP 1/WAF 1和/或P16Ink4a表达，和降低层压蛋白B1的表达(图一。2, 3, 4, 5、补充图。4, 8, 9和11)。在几个培养细胞的实验中，我们也证实了细胞周期阻滞的不可逆性，这是细胞衰老的一种基本表型。2一个,3A，c、补充图。5A和7)。从这些标记来看，我们发现牙龈卟啉单胞菌而且，在较小的程度上，溶孢卟啉单胞菌有能力通过丁酸分泌诱发衰老样表型和结直肠肿瘤的发展。4和5).

一些报告表明，丁酸盐还具有抑制肿瘤的作用，可能是因为它作为组蛋白去乙酰化酶(Hdac)抑制剂的作用。22,49。另一方面，大量的研究表明丁酸酯在不同的CRC动物模型和人类中促进了大肠癌的发生。22,49。丁酸盐对肿瘤发生的影响的这种差异被称为丁酸盐悖论，可以通过丁酸盐浓度来调和。62。例如，虽然低剂量的丁酸会促进肿瘤的发生，但高剂量的丁酸会抑制肿瘤的发生。49。然而，最近的研究表明，较高浓度的丁酸盐也能促进crc的发展。63和肝癌64，很难用丁酸盐浓度的差异来描述丁酸盐悖论。因此，考虑到细胞衰老的两个方面(肿瘤抑制和肿瘤促进)32,33我们的发现，很容易推测丁酸盐悖论也可以用细胞衰老对肿瘤发生的相反影响来解释，至少在某些情况下是这样。

值得一提的是，在CRC患者粪便中富集的12种粪便细菌分类群和HI中很少检测到的细菌类群显然与牙周病相关的细菌种类相对应。39(补充图。1D)。这些结果与先前的观察结果一致，即在CRC患者粪便中富集的许多细菌与典型的口腔合并症有关。18,19,20,21。更有趣的是，最近的一项大型队列研究显示，牙齿数量少、牙周炎症中度或严重的妇女患CRC的风险增加了48%。65。总的来说，虽然我们对口腔细菌对肠道异位定植的机制知之甚少，但很明显牙周病与CRC之间存在细菌联系。

衰老细胞可以通过SASP吸收各种免疫细胞，如巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、中性粒细胞和T淋巴细胞，而免疫细胞的过度积累会引起可能促进癌变的慢性炎症。66。此外，据报道，细胞衰老会损害上皮细胞的紧密连接和屏障完整性。67。因此，推测结肠中产生丁酸盐的细菌的异常增加可能有助于CRC的发展，这可能是通过促进肠道细菌和免疫细胞向肠道上皮屏障的浸润，至少在某些情况下是这样。然而，我们不能排除某些细菌可能在不引起衰老反应的情况下促进crc的发展。10,41。此外，在体内诱导细胞衰老的机制可能与体外不同。因此，需要进一步的研究，以了解肠道细菌联系与CRC的发展机制。然而，尽管可能有更多的机制在这里发挥作用，我们的数据提出了一种可能性，即肠道细菌的子集在CRC患者中增加，有可能通过丁酸分泌引起细胞衰老和肿瘤发生。这些发现扩大了我们对肠道微生物群改变是否和如何与CRC的发展有因果关系的理解，并为其控制开辟了可能性。